著者は彼らのサポートのためにスウェーデンの研究評議会、ストックホルム郡評議会、およびKI資金に感謝します。 MSPの発現および精製は、カロリンスカ研究所/ SciLifeLabタンパク質科学基盤施設（http://PSF.ki.se）で行いました。また、作者は彼らの技術的な専門知識を共有するため、それらのタイムリーな支援のために博士パシPurhonen博士マチルダスエルバーグに感謝したいと思います。

ナノディスクの調製<ol><li>膜足場タンパク質8、35の発現および精製<ol><li>フラスコ中の大腸菌 BL21（DE3）T1R pRARE2株にHisタグMSP1E3D1を発現します。 37℃で50μg/ mlのカナマイシンを補充したLB培地で50 mLの一晩スターター培養を準備します。 50μg/ mLのカナマイシンを補充した素晴らしいブロス培地の2 Lで一晩スターター培養物を希釈します。 </li><li> 600ナノメートル（OD 600）での光学密度が約3 18℃で3時間、0.5 mmのタンパク質発現イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を誘導に達するまで37℃で細胞を増殖させます。 </li><li>溶解バッファー（; 100mMのNaCl、10％グリセロール、100mMのトリス-HCl、pH8.0）に調製します。使用直前に1 mMのTCEPを追加します。 </li><li> 18℃での誘導の3時間後、4,500×gで10分間の遠心分離により細胞を回収4°C。 、上清を捨て採取した細胞を比較検討し、細胞のグラム当たりの溶解緩衝液を2mLの割合で溶解緩衝液中で再懸濁それら。 </li><li> 80％の振幅で3分間（ON 4秒、4秒OFF繰り返し率）、パルス超音波処理によって溶解細胞。 </li><li> 49,000×gで、4℃で20分間溶解物を遠心分離します。この遠心分離からのペレットを捨てます。 </li><li>好ましくは4℃に保っ自動液体クロマトグラフィーシステムに接続された5ミリリットルのNi +キレートカラムに上清を注入します。 </li><li> Hisタグ化MSP以外のすべてのタンパク質を除去するために、次の3 - 溶出工程（ステップ1.1.9）の前に、バッファ1でカラムを洗浄します。精製プロセスを追跡する280 nmでのタンパク質含有量を監視します。 280nmでのUV記録は、各洗浄後にベースラインに戻る行く必要があります。 <ol><li> 40mMのトリス-HCl、300mMのNaCl、10mMのイミダゾール、1％トリトン、pHが8.0：洗浄緩衝液1で洗浄しました。 </li><li> 40mMのトリス-HCl、300mMの：洗浄バッファー2で洗浄NaCl、20mMイミダゾール、及び50mMコール酸ナトリウム、pHは8.0。 </li><li> 40mMのトリス-HCl、300mMのNaCl、および50 mMイミダゾール、pHは8.0：洗浄緩衝液3で洗浄します。 </li></ol></li><li> 40mMのトリス-HCl、300mMのNaCl、および500mMイミダゾール、pH8.0でMSPを溶出します。 </li><li>ゲルろ過8、35、標準緩衝液（0.5 mMのEDTA; 100mMのNaCl、20mMのトリス-HCl、pHが7.5）MSPするバッファを変更します。バッチあたりの収量は約7ミリグラムLであるべき-1。 </li></ol></li><li>リン脂質原液の調製<ol><li> 1-パルミトイル-2- oleoyl- SN -glycero -3-ホスホコリン（POPC）の305μLをガラスビーカーに25ミリグラム/ mLの濃度でクロロホルムに溶解し、窒素の穏やかな流れでそれをパージすることにより、クロロホルムを蒸発させる追加。真空デシケーター中で一晩脂質を乾燥させます。注：このステップは、ガラスビーカーの底部に脂質の薄膜を残す脂質から溶媒を除去します。</li><li>溶液が透明になるまでチューブをボルテックスすることによって100mMのコール酸ナトリウムを含むMSP標準緩衝液200μL中の脂質ケーキを再懸濁し、これを50mMのPOPC濃度を有する溶液を提供します。 注：2（脂質：洗剤）8一般的には、この時点で洗剤に対する脂質のモル比は1でなければなりません。この脂質 - 界面活性剤混合物は、ほぼ2ヶ月間-80℃で保存することができます。 </li></ol></li><li>界面活性剤除去のための疎水性ビーズの作製<ol><li> 50 mLチューブにビーズの5グラム（乾燥重量）を配置します。 </li><li>超純水40mLで、次に100％メタノール30mLでビーズを洗浄し。 </li><li> 10 mLのMSPの標準緩衝液でビーズを洗浄します。最後に、4℃でMSP標準緩衝液15mLでビーズを格納します。 </li></ol></li><li>ナノディスクの再構成<ol><li>マイクロチューブにMSP1E3D1（0.124ミリモル）の190μLを分注し、リン脂質のストック溶液（50mMのPの61.5μLを追加同じチューブにOPC）。 1時間氷上で再構成混合物をインキュベートします。注：130（MSP1E3D1：POPC）これは1のモル比に等しいです。 </li><li>自己組織化プロセスを開始するために再構成液1mL当たりのビーズ0.5gの濃度で疎水性ビーズを加えます。 4℃で16時間、ロータリーインキュベーターでインキュベートします。 </li><li>インキュベーションの後、沈殿物や凝集物を除去するために13,000×gで、4℃で10分間遠心操作します。ペレットを捨て、上清を保存します。 </li><li> 280 nmでの吸光度が安定するまでMSP標準緩衝液（自動液体クロマトグラフィーシステムに搭載された）サイズ排除クロマトグラフィーカラムを平衡化します。カラムに上清を注入し、ピーク画分を集めます。 </li><li> 280nmでのピーク画分にナノディスクの濃度を測定します。ナノディスク濃度の計算のためにMSP1E3D1のモル吸光係数（ε= 29910センチメートル-1 M -1）を使用します。注記：ナノディスクあたりの脂質の数は、放射標識脂質およびリン分析4の組み合わせによって単独リン酸分析によって測定することができます。 </li></ol></li></ol> Monotopicタンパク質の調製5-リポキシゲナーゼ35 <ol><li>一晩スターター培養物を準備します。 100μg/ mLのアンピシリンを含むLB培地50mlを補います。 5-リポキシゲナーゼ遺伝子（ALOX5）のプラスミドを含む大腸菌 BL21（DE3）で培地に接種。 42ミリモルのNa 2 HPO 4、24 mMのKH 2 PO 4、9のNaCl、19 mMのNH 4 Cl を 、1mMの硫酸マグネシウム、0.1ミリモルのCaCl 2、0.2％D-グルコース、0.1を含有する発現培地中で一晩スターター培養物を希釈％、5μMのFeSO 4、および100μg/ mLアンピシリン。 OD 600が 〜25℃で0.5になるまで細胞を増殖させます。 C 35 20℃で16時間、0.2mMのIPTGでタンパク質発現を誘導します。 </li><li> 7,000×gで、4℃で10分間の遠心分離により収穫し、上清を捨てます。採取した細胞を含むチューブの下部にあるペレットを秤量し、溶解緩衝液中に回収した細胞を再懸濁（100mMのトリス-HCl、pH8.0の、100mMのNaCl、10％グリセロール、及び1mMのTCEP）、プロテアーゼ阻害剤および0.5を含みますmg / mlで細胞の1gあたりの溶解緩衝液を2mLの割合で35リゾチーム。 </li><li>溶解80％の振幅で5×15秒間超音波処理により細胞。 7,000×gで、4℃で10分間の遠心分離により細胞破片を除去します。ソリューション35中のタンパク質を沈殿させるために60％飽和- 30に硫酸アンモニウム沈殿を実行します。 16,000×gで4℃で15分間遠心分離します。注：5LOペレットを急速凍結し、最長6ヶ月間-80℃で保存することができます。 </li><li> 40,000×gで4℃で15分間、溶解緩衝液および遠心20mLでペレットを再懸濁します。 </li><li>上の上澄み液をインキュベート<html> 30分間、4℃でATPアガロースカラム。 0.5 M NaClを含む溶解緩衝液の1カラム容量で一回カラムを洗浄。 10μMのFeSO 4および20μg/ mLのカタラーゼを含有する溶解緩衝液中20mMのATPと5LOを溶出します。 ATP 35を除去するために、ゲルろ過クロマトグラフィーを行います。 注：5LOが不安定で、すぐに精製した後に使用する必要があります。それ以外の場合は、硫酸アンモニウム沈殿の段階（ステップ2.1.3の後の注を参照）で停止することをお勧めします。 </li></ol>ナノディスク - タンパク質複合体の調製<ol><li>複合体の100μLの総容量を準備します。 MSP標準緩衝液中の1mM の Ca 2+存在と0.8μMNDと0.8μM5LOミックス（20 mMトリス-塩酸、pHが7.5; 100mMのNaCl; 0.5mMのEDTA、および1.5 mMのCaCl 2を）とは、10分間インキュベート冷やして。注：サンプルは、C 35 4℃で1ヶ月まで保存することができます。 </li></ol>サンプルのove_title &quot;&gt; 4。分析<ol><li>ゲル電気泳動<ol><li>非変性電気泳動<ol><li>ローディングバッファーの5μL（50mMのビストリス、6NのHCl、50mMのNaCl、10％（w / v）のグリセロール、および0.001％ポンソーS、pH7.2）で49でサンプルの15μLを混合し、4にそれを読み込みます - 16％のBis-Trisゲルで電気泳動を行います。 </li><li>光陰極バッファと陰極タンクを埋める（50mMのビストリス、50mMのトリシン、pHが6.8、および0.002％クマシーG-250）及び緩衝液（50mMビストリスおよび50mMのトリシン、pHは6.8）を実行すると、アノードタンク。 150 Vで一定の電圧を使用して分離を開始します</li><li>クマシーフロントがゲルの終わりに到達した電気泳動分離を停止します。 </li><li>標準クマシーブループロトコルを用いてゲルを染色。 </li></ol></li><li>変性電気泳動<ol><li> （（SDSを含むローディング緩衝液の10μLで0.05パーセントを、サンプルの40μLのミックス/ v）のブロモフェノールブルーワット; 0.2 Mトリス塩酸、pHが6.8; 20％（v / v）グリセロール。 10％（W / V）SDS。電気泳動を行うために20％トリスグリシンゲル - 及び10mM 2-メルカプトエタノール）とは4でそれをロードします。 </li><li>ランニング緩衝液で陰極と陽極とタンクを記入（25 mMトリス - 塩酸、pHが6.8; 200 mMグリシン、および0.1％（w / vで）SDS）。 150 Vで一定の電圧を使用して分離を開始します</li><li>ローディング色素フロントがゲルの終わりに到達した電気泳動分離を停止します。 </li><li>標準クマシーブループロトコルを用いてゲルを染色。 </li></ol></li></ol></li><li> NAPT溶液の調製<ol><li>酸性溶液（w / v）の2％を与えるように、室温で攪拌することにより水50mL中のリンタングステン酸ナトリウム塩1gを溶解します。 </li><li> 1 M NaOHでpHを7.4に調整します。 0.22μmのシリンジフィルターを使用して粒子を除去します。室温または4℃で溶液を保管してください。 </li></ol></li><li> TEM分析用のサンプルの調製<ol><li>グロー放電炭素被覆銅グリッド（430ミリアンペアで20秒間の00メッシュ）は、試料の吸着前親水性グリッドをレンダリングします。グリッド上のサンプル（ナノディスクに対して0.8μM）の3.5μLを置き、30秒間インキュベートします。注：適用量は、サンプル濃度に応じて、2.5〜5μLを変えることができます。 1μM - ナノディスクに適した濃度範囲は0.5です。 </li><li>濾紙を用いて余分な溶液をオフブロット。 </li><li>すぐに30秒間2％NAPTの低下にグリッドを染色します。過剰の溶液をオフにブロットし、空気乾燥さグリッドを残します。 </li><li> TEMによるグリッドを評価します。 120-200 keVの加速電圧を持つ顕微鏡は、スタッキングの度合いを推定するのに十分です。注：本プロトコルでは、較正透過型電子顕微鏡を用いた、200 keVの電界放出銃を備えました。 </li><li> TEM画像を記録します。長いスタックを示す画像については、さらに処理されません。画像は、いくつかを含有することができる外因性タンパク質と、ナノディスクの複合体を示しますショートスタックが、ほとんどの粒子が複雑です。録音複数の画像処理クラス平均と低解像度、複合体の3次元モデルを得るための標準的な方法に従って、これらの。 注：ネガティブ染色データの収集のために、グリッドが少なくとも三つの異なる日に行きました。ネガティブ染色が適用される前、毎日のために、新鮮なサンプルのインキュベーション（ステップ3.1のように）が行われました。 </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

空のナノディスクの再構成、タンパク質ナノディスク複合体の調製、およびこれらの複合体のTEMについて陰性染色：この方法は、3つの部分に分離することができます。各部分は技術の限界、重要なステップ、および有用な修飾に関する個別に対処されることになります。 空のナノディスクの再構成。ナノディスクの製造と使用における重要なステップと制限。 <p class="j...

医学研究では、多くの注意が脂質相互作用の様々な関与、内因性または外因性のいずれかの、膜タンパク質に焦点を当てています。脂質相互作用タンパク質を操作するような洗剤、amphipols 1、または小さいタンパク質2などの脂質への代替を選択する、または可溶性および活性タンパク質を保持する膜の代用品を見つけるのいずれかが含まれます。リポ膜代替物は、リポソームおよびナノディスク（ND）3、4を含みます。 ナノディスクは、天然に血液中に発生する高密度リポタンパク質（HDL）のタンパク質部分、アポA-1を操作することによって開発され、ネイティブに近い膜のプラットフォームです。アポA-1は、短い両親媒性αヘリックスの243残基長鎖状であり、無脂質可溶性コンホメーションを持っています。 in vitroでの脂質の存在下で、タンパク質アポA-1の2つのコピーが自発的にhydrを取り囲むように並べ替えるとき脂質二重層のパッチ5のophobicアシル鎖部分。アポA-1の操作されたバージョンは、一般的に、膜足場タンパク質（MSP）と呼ばれ、数は増加し、プラスミドとして、または精製されたタンパク質として市販されています。 6長いか短い7膜足場タンパク質中のアポA-1、結果の繰り返しまたはαヘリックスの欠失を有します。これにより、直径が17ナノメートル〜8 6nmで7の周りにディスクを形成することができます。ナノディスク3,9のためのアプリケーションの種類があります。最も一般的に使用されるアプリケーションは、以前に3,9レビュー内在性膜タンパク質8の安定化のために、ネイティブに近い膜環境を提供することです。あまり探求使用は、研究のためのナノスケールの膜表面を提供することを目的とします周辺膜タンパク質10、11、12、13、14、15、16、17。プロトコルの第1節は、以下のリン脂質や膜骨格タンパク質から構成されるナノディスクを作成するための手順を可視化します。 サンプル調製は、ほとんどのメソッドのボトルネックです。メソッド固有のサンプルは、特定の情報を追加することができ、彼らはまた、結果の比較が困難になります。試料がマルチモーダルであり、いくつかの異なる方法で直接使用することができる場合したがって、簡単です。ナノディスクを用いて一つの利点は、リポソーム（ 例えば、サンプルは直接本プロトコルのように、TEMおよび非変性ゲル電気泳動の両方のために使用することができる）と比較して、ナノディスクの小さいサイズです。 、18利用可能です。しかし、リポソーム膜に埋め込まれたmonotopic膜タンパク質のない高解像度の3D構造は、我々の知る限りでは、まだ公開されていません。金ナノ粒子または抗体は、TEM 19を用いてリポソームまたは小胞に結合するタンパク質を可視化するために使用することができます。これらのプローブは、非常に特異的であるにもかかわらず、彼らは膜結合部位をベーリングしたり、柔軟な部品で関心のある分野をマスキングすることにより、膜結合タンパク質を妨害する可能性があります。金標識又は抗体複合体を形成するタンパク質は、おそらくゲル上で分析することができ、これは実験のコストを増加させます。 リポソームは優れたプラットフォームであるが、一つはポップと確信することはできませんピュレーションは、リポソームあたりのタンパク質の特定の比率、ナノディスク20を使用することによって探索することができるという特徴を持っています。リポソームでは、補因子および基質は可溶性の内部に捕捉することができます。膜溶解性である物質は、膜模倣体の両方のタイプのための同じ運命を共有します。二重層領域がナノディスクに小さくなるようにもかかわらず、物質の少量を、ナノディスクの膜を飽和させるのに必要とされます。 原子構造の決意を介してタンパク質の機能を理解することは、研究の多くの分野のために不可欠となっています。タンパク質構造決意するための方法は、X線21を含みます。核磁気共鳴（NMR）22、23。透過型電子顕微鏡（TEM）極低温で24、cryoEM。 cryoEMによって解像度が最近大幅に主に起因する直接電子デの使用に、改善されました26、25 tectors。巨大分子は、ネイティブに近い状態で薄く、ガラス質氷27に結像されます。 200 kDaの - しかし、生体分子の低コントラストのために、彼らは100のサイズ範囲で検出が困難になります。適切なサイズのサンプルについては、データ収集を行うことができ、単一粒子の再構成の方法は、構造体28を得るために適用することができます。 しかし、TEMによるタンパク質構造の決意は、多段階プロセスです。これは通常phosphotungstenのような重金属の塩を使用して負染色TEM 29（PT）30やウラン31によるサンプル単分散性の評価から始まります。ネガティブ染色高分子の低解像度モデルの再構築は、通常行われ、分子構造29に関する重要な情報をもたらすことができます。並行して、cryoEMを使用してデータ収集を開始してもよいです。アーチファクト形成の誤解を避けるために、ネガティブ染色TEMデータを評価する際には注意が必要です。一つの特定のアーチファクトは、側面33から見たコインのスタックに似た長い棒の形成をもたらし、リン脂質およびリポソーム32にPTの汚れの影響です。 （以下、「スタック」と表記）は、このような「連銭」または「スタック」は、HDL 34早期に観察し、それ以降もナノディスク35のためにしました。 膜の積層と整形は多くの理由で発生することがあります。例えば、モリブデン酸アンモニウム染色36でTEM画像で示される銅のような補因子によって誘導することができます。リポソーム中の膜脂質の割合は、このように銅イオンを添加した後、リポソームを積層し、EDTAによって金属錯体を模倣イミノジ酢酸頭部基を含有しました<sクラス= &quot;外部参照&quot;&gt; 36アップ。スタッキングも（使用ステインが言及されていない）脂質二重層内または上のタンパク質によって37タンパク質間相互作用に起因する可能性があります。 PTによるリン脂質のスタック形成は早い段階で観察されました。しかし、それ以降の作業は、このアーティファクト形成38を削除するか、廃止に焦点を当てています。 ここでは、TEMによる膜結合タンパク質の研究のために積み重ねNAPTによって誘発されるナノディスクを利用する方法を提案します。要するに、ナノディスクに結合タンパク質が積み重ねからナノディスクを防止するであろう。スタッキングの理由は明らかではないが、それはお互いに（ 図1A）に固執するディスクを引き起こし、リン脂質およびPTのホスホリル基との間の静電相互作用があることが39提案されました。私たちのプロトコルの背後にある仮説は、タンパク質は、ナノディスクに結合すると、リン脂質表面の大部分はご利用できないということです<html>タンパク質による立体障害によりPTとの相互作用についてBLE。これは、スタックの形成（ 図1B）を防止するであろう。二つの結論を引き出すことができます。まず、積層の予防は、対象のタンパク質が膜に結合したことを意味します。第二に、タンパク質ND複合体は、複合体の大まかな形態を得るために、標準的な単一粒子処理方法24、40で処理することができます。また、非変性ゲル電気泳動または動的光散乱のような方法によって分析を行うことができます。 この仮説を実証するために、我々は、多くの炎症性疾患41,42に関与する膜結合タンパク質5-リポキシゲナーゼ（5LO）を使用しました。この78-kDaのタンパク質は、その膜43にバインドするためにカルシウムイオンを必要とします。この膜結合は、リポソームを用いて広く研究されているもののS = &quot;外部参照&quot;&gt; 44、45、46、膜画分47、これらは、TEM分析および構造決意するために使用することができません。 ナノディスクの調製は、界面活性剤コール酸ナトリウムに再懸濁脂質とMSPを混合することによって開始されます。 1時間氷上でインキュベートした後、界面活性剤をゆっくりと吸着樹脂を使用して再構成混合物から除去されます。この種の材料は、しばしば小さなビーズに成形ポリスチレンで作られています。彼らは比較的疎水性であり、脂質の48に比べて洗剤を結合するための強力な好みを持っています。疎水性ビーズを除去し、遠心分離を用いて説明を行った後、ナノディスクは、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）により精製します。精製されたナノディスクは、（滴定用またはいくつかの比率）等モル比でmonotopic膜タンパク質（および可能な補因子）と混合されているとrに残っていますEACT（15分）。 TEMによる分析は、グロー放電、炭素被覆グリッド上に試料をμL-量を適用することによって、その後、NAPTでネガティブ染色を行うことによって行われます。アリコートをTEMグリッドに適用した場合の同じサンプルは大きな変化で、非変性またはSDS PAGEゲル電気泳動によって、並びに活性測定の各種による分析のために使用することができます。

<table><tbody><tr><td>Transmission electron microscope: JEOL2100F</td><td>JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glow discharger</td><td>Baltec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM grid: 400 mesh</td><td>TAAB</td><td>GM016/C</td><td></td></tr><tr><td>Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-2526</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 HR 10/300</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid: MSP1E3D1</td><td>Addgene</td><td>20066</td><td></td></tr><tr><td>Bacteria: BL21DE3</td><td>NEB</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2</td><td>Protein Science Facility, KI, Solna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purification Matrix: ATP agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2767</td><td></td></tr><tr><td>Purification Matrix: HisTrap HP-5 mL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>Lipid: POPC</td><td>Avanti polar lipids</td><td>850457C</td><td>25 mg/mL in chloroform</td></tr><tr><td>Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>13 mm syringe filter: 0.2 &amp;mu;m</td><td>Pall life sciences</td><td>PN 4554T</td><td></td></tr><tr><td>Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31648</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma Aldrich</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>Detergent: Sodium cholate hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6445-10G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Cholate</td><td></td><td></td><td>500 mM Sodium cholate. Resuspend in miliQ water and store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Lipid Stock</td><td></td><td></td><td>50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl. &lt;bt /&gt;Store at 4 &amp;deg;C for a week; or&lt;br/&gt; Store -80 &amp;deg;C for a month, after purging the solution with nitrogen.</td></tr><tr><td>MSP standard buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA. &lt;br /&gt;Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2001</td><td>50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8</td></tr><tr><td>Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2002</td><td>50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8, 0.002% Coomassie G-250</td></tr><tr><td>Non-Denaturaing Electrophoresis 4x Sample loading Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2003</td><td>50 mM Bis-Tris, pH 7.2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S</td></tr><tr><td>Denaturaing Electrophoresis Running Buffer</td><td></td><td></td><td>In-house recipe: 25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1% (w/v) SDS</td></tr><tr><td>Denaturaing Electrophoresis 5x Sample loading Buffer</td><td></td><td></td><td>In-house recipe: 0.05% (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8, 20% (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS, 10 mM 2-mercaptoethanol</td></tr><tr><td>Terrific broth</td><td></td><td></td><td>Tryptone - 12.0 g, Yeast Extract - 24.0 g, 100 mL 0.17 M KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; and 0.72 M K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, Glycerol - 4 mL.&lt;br /&gt;Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 mL and autoclaved seperately. KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; and K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium.</td></tr></tbody></table>

method to visualize and analyze membrane interacting proteins by transmission electron microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

私たちが提案する方法はmonotopic膜タンパク質が結合するための膜表面を提供するために、ナノディスクの作成に依存します。ナノディスクの脂質二重層に埋め込まない膜貫通タンパク質が存在しないように、ナノディスクは、ここでは「空のナノディスク」（ 図2A）と表記されています。これらは、2 MSP1E3D1の足場タンパク質とPOPC 8の約2...

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透過型電子顕微鏡による膜相互作用タンパク質の可視化および分析方法 |生化学 |ビデオ

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

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13.1K ビュー.  Karolinska Institutet. Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

ビデオ: Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium homeostasis, particularly store-operated calcium entry, which is critical to maintaining proper function of synaptic vesicle release and intracellular signaling pathways. Accordingly, TRPC channels have been implicated in a variety of human diseases including cardiovascular disorders such as cardiac hypertrophy, neurodegenerative disorders such as Parkinson&#39;s disease, and neurologic disorders such as spinocerebellar ataxia. Therefore, TRPC channels represent a potential pharmacologic target in human diseases. However, the molecular mechanisms of gating in these channels are still unclear. The difficulty in obtaining large quantities of stable, homogeneous, and purified protein has been a limiting factor in structure determination studies, particularly for mammalian membrane proteins such as the TRPC ion channels. Here, we present a protocol for the large-scale expression of mammalian ion channel membrane proteins using a modified baculovirus gene transfer system and the purification of these proteins by affinity and size-exclusion chromatography. We further present a protocol to collect single-particle cryo-electron microscopy images from purified protein and to use these images to determine the protein structure. Structure determination is a powerful method for understanding the mechanisms of gating and function in ion channels.

This protocol describes techniques used to determine ion channel structures by cryo-electron microscopy, including a baculovirus system used to efficiently express genes in mammalian cells with minimum effort and toxicity, protein extraction, purification, and quality checking, sample grid preparation and screening, as well as data collection and processing.

式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオン チャネル TRPC3 の精製

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

生化学

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved structures are folded into various shapes to form a dynamic network depending on the cellular conditions. Visualization of this network between mitochondria and ER has been attempted using super-resolution fluorescence imaging and light microscopy; however, the limited resolution is insufficient to observe the membranes between the mitochondria and ER in detail. Transmission electron microscopy provides good membrane contrast and nanometer-scale resolution for the observation of cellular organelles; however, it is exceptionally time-consuming when assessing the three-dimensional (3D) structure of highly curved organelles. Therefore, we observed the morphology of mitochondria and ER via correlative light-electron microscopy (CLEM) and volume electron microscopy techniques using enhanced ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining. An en bloc staining method, ultrathin serial sectioning (array tomography), and volume electron microscopy were applied to observe the 3D structure. In this protocol, we suggest a combination of CLEM and 3D electron microscopy to perform detailed structural studies of mitochondria and ER.

We present a protocol to study the distribution of mitochondria and endoplasmic reticulum in whole cells after genetic modification using correlative light and volume electron microscopy including ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining, serial sectioning of cells with and without the target gene in the same section, and serial imaging via electron microscopy.

相関光と体積電子顕微鏡によるミトコンドリアと小体網膜イメージング

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

膜蛋白質相互作用解析用のネイティブ細胞膜ナノ粒子システム

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

インタクトな機能的な膜タンパク質へのヌクレオチド結合をリアルタイムで測定

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

膜タンパク質の構造動力学を調べるその場で部位特異的蛍光標識を持つ

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

生物学

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

電子クラ​​イオトモグラフィーによるミトコンドリアにおけるATP合成酵素二量体の可視化

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

蛍光プロテアーゼ保護を使用して膜タンパク質のトポロジの決定（FPP）

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable efforts have been made in this field, but techniques enabling automated high-throughput transport analysis in combination with solvent-free lipid bilayer techniques required for the analysis of membrane transporters are rare. This class of transporters however is crucial in cell homeostasis and therefore a key target in drug development and methodologies to gain new insights desperately needed.
The here presented manuscript describes the establishment and handling of a novel biochip for the analysis of membrane protein mediated transport processes at single transporter resolution. The biochip is composed of microcavities enclosed by nanopores that is highly parallel in its design and can be produced in industrial grade and quantity. Protein-harboring liposomes can directly be applied to the chip surface forming self-assembled pore-spanning lipid bilayers using SSM-techniques (solid supported lipid membranes). Pore-spanning parts of the membrane are freestanding, providing the interface for substrate translocation into or out of the cavity space, which can be followed by multi-spectral fluorescent readout in real-time. The establishment of standard operating procedures (SOPs) allows the straightforward establishment of protein-harboring lipid bilayers on the chip surface of virtually every membrane protein that can be reconstituted functionally. The sole prerequisite is the establishment of a fluorescent read-out system for non-electrogenic transport substrates.
High-content screening applications are accomplishable by the use of automated inverted fluorescent microscopes recording multiple chips in parallel. Large data sets can be analyzed using the freely available custom-designed analysis software. Three-color multi spectral fluorescent read-out furthermore allows for unbiased data discrimination into different event classes, eliminating false positive results.
The chip technology is currently based on SiO2 surfaces, but further functionalization using gold-coated chip surfaces is also possible.

The presented protocol describes the analysis of membrane protein mediated transport on the single transporter level using pore-spanning solvent-free lipid bilayers. This is achieved by the creation of bulk produced nanopore array chips, combined with highly parallel data acquisition and analysis, enabling the future establishment of membrane protein effector screenings.

単一のタンパク質解像度で高並列ナノ細孔チップシステムにより分析膜輸送プロセス

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and spatial resolution on the order of ms and nm, respectively. We have developed a time-resolved electron microscopy technique, &#34;flash-and-freeze,&#34; that induces cellular events with optogenetics and visualizes the resulting membrane dynamics by freezing cells at defined time points after stimulation. To demonstrate this technique, we expressed channelrhodopsin, a light-sensitive cation channel, in mouse hippocampal neurons. A flash of light stimulates neuronal activity and induces neurotransmitter release from synaptic terminals through the fusion of synaptic vesicles. The optogenetic stimulation of neurons is coupled with high-pressure freezing to follow morphological changes during synaptic transmission. Using a commercial instrument, we captured the fusion of synaptic vesicles and the recovery of the synaptic vesicle membrane. To visualize the sequence of events, large datasets were generated and analyzed blindly, since morphological changes were followed in different cells over time. Nevertheless, flash-and-freeze allows the visualization of membrane dynamics in electron micrographs with ms temporal resolution.

We developed a novel technique in electron microscopy, &#34;flash-and-freeze,&#34; that enables the visualization of membrane dynamics with ms temporal resolution. This technique combines the optogenetic stimulation of neurons with high-pressure freezing. Here, we demonstrate the procedures and describe the protocols in detail.

フラッシュとフリーズ：電子顕微鏡でメンブレンダイナミクスをキャプチャするために新しい技術

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

透過電子顕微鏡用小型サンプル準備

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法

要約

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式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオンチャネル TRPC3 の精製

相関光と体積電子顕微鏡によるミトコンドリアと小体網膜イメージング

膜蛋白質相互作用解析用のネイティブ細胞膜ナノ粒子システム

インタクトな機能的な膜タンパク質へのヌクレオチド結合をリアルタイムで測定

膜タンパク質の構造動力学を調べるその場で部位特異的蛍光標識を持つ

電子クライオトモグラフィーによるミトコンドリアにおけるATP合成酵素二量体の可視化

蛍光プロテアーゼ保護を使用して膜タンパク質のトポロジの決定（FPP）

単一のタンパク質解像度で高並列ナノ細孔チップシステムにより分析膜輸送プロセス

フラッシュとフリーズ：電子顕微鏡でメンブレンダイナミクスをキャプチャするために新しい技術

透過電子顕微鏡用小型サンプル準備

透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法

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相関光と体積電子顕微鏡によるミトコンドリアと小体網膜イメージング

膜蛋白質相互作用解析用のネイティブ細胞膜ナノ粒子システム

インタクトな機能的な膜タンパク質へのヌクレオチド結合をリアルタイムで測定

膜タンパク質の構造動力学を調べるその場で部位特異的蛍光標識を持つ

電子クラ​​イオトモグラフィーによるミトコンドリアにおけるATP合成酵素二量体の可視化

蛍光プロテアーゼ保護を使用して膜タンパク質のトポロジの決定（FPP）

単一のタンパク質解像度で高並列ナノ細孔チップシステムにより分析膜輸送プロセス

フラッシュとフリーズ：電子顕微鏡でメンブレンダイナミクスをキャプチャするために新しい技術

透過電子顕微鏡用小型サンプル準備

式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオンチャネル TRPC3 の精製

電子クライオトモグラフィーによるミトコンドリアにおけるATP合成酵素二量体の可視化