This work was supported by the Marie Curie International Reintegration Grant (EP7). P. D. acknowledges the support of the Israel Council for Higher Education.

1.ヒント修正<ol><li>購入窒化シリコン（Si 3 N 4）、シリコンチップとAFMカンチレバー（〜2nmの公称カンチレバー半径）。 </li><li> 20分間無水エタノールに浸漬して、各AFMカンチレバーを清掃してください。室温で乾燥しました。その後、5分間O 2プラズマにそれらを暴露することによってカンチレバーを扱います。 </li><li> 15の割合で（3センチ）を含む溶液メチルトリエトキシシラン、3-（アミノプロピル）トリエトキシシラン上記のきれいなヒントをサスペンド：1（v / v）の不活性雰囲気（窒素やアルゴンのいずれか）の下でデシケーター中とにデシケーターを接続真空ポンプ。混合したシラン化合物のこれら2つのタイプの単層を形成するために2時間真空。 </li><li>ホットプレート上でのヒントを配置する（このプロセスのために作製）金属製のチップホルダーを使用します。その後、大気条件下で、70℃で10分間のヒントを乾燥させます。使用前に、エタノールを使用して、ホットプレート、金属製のホルダーとピンセットを清掃してください。 </li><li>部屋tでのヒントをクールemperature、その後で1時間、0.5％（v / v）のトリエチルアミンを含有するクロロホルム中の5 mMの濃度で、フルオレ-PEG-N-ヒドロキシカルボニル（Fmoc-PEG-NHS、MW 5,000 Da）での溶液にチップを浸漬室温。 </li><li> 5分間クロロホルムでヒントを浸漬した後、さらに5分間、ジメチルホルムアミド（DMF）中に浸します。結合したPEG分子のFmoc基を脱保護するために、30分間DMF中の20％ピペリジン（v / v）の中にヒントを浸します。 4分間DMF中でチップを浸漬した後、N-メチル-2-ピロリドン（NMP）中でさらに4分間。 3回浸漬シーケンシャルを繰り返します。 </li><li>アミノ酸のカップリングのために、N末端保護アミノ酸（AA）/ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）/ 2-（1H-ベンゾトリアゾール-1-イル）-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムhexafluophosphateを含む溶液にチップを浸漬1.5時間5mLのNMP中の30mMの総濃度で、1：1：1のモル比で（HBTU）。 </li><li>ペプチドカップリングのために、5 mL溶液の続きにヒントを浸し保護されたペプチド40mgのaining（N末端及び側鎖、例えばのFmoc-Glnを（Trtの）-Pro-ALA-のSer（tBuで）-Ser（tBuで）-Arg（PBF）-Tyr（tBuで）-COOHを。） 、15mgの2-（1H-ベンゾトリアゾール-1-イル）-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HBTU）、および2時間NMP中DIPEA 5mLの。 </li><li> 4分間のNMP中のヒントを浸します。 1及びNMP中0.65 Mの合計濃度：次に、アセチル基によってリーマ無料/未反応NH 2を保護するために、モル比4で無水酢酸/ DIPEAの混合物中で30分間のヒントを浸します。 </li><li> ペプチドカップリングのために、二つの追加の手順を実行します。 <ol><li> 、ペプチドの側鎖を脱保護し、1時間、95％TFA、2.5％のトリイソプロピルシラン、2.5％の水を含む溶液にチップを浸漬し、次いで、クロロホルムおよびDMFで洗浄するためです。 </li><li> 30分間DMF中の20％ピペリジン（v / v）の中にチップを、ペプチドのFmoc基を除去浸漬するためです。 </li></ol></li><li>順次ペプチド/アミノ酸 - 官能ディップDMF（ペプチド）またはNMP（アミノ酸など）、クロロホルム、50％のエタノールと水の4つの分間、Dヒント。最後に、空気中のチップを乾燥させます。 </li></ol> 2.表面の準備<ol><li>マイカを準備します。スコッチテープを使用して、各使用前に基質（9.9ミリメートルの直径）を切断します。その後、三重蒸留水（TDW）で表面を洗います。 </li><li> TiO 2被覆シリコンを準備します。 <ol><li>ダイヤモンドペンを用いて2cmの正方形にシリコンウェハ（100）を切断します。 </li><li>アセトンを充填した15mLの試験管内に基板を配置し、超音波浴中で5分間、それを超音波処理します。次いで、イソプロパノールを充填した15 mLの試験管にこの表面を置き、5分間、それを超音波処理。窒素を使用して基板を乾燥させます。 </li><li> 5％（重量/容量）溶液を調製し、エタノール中の界面活性剤（ 例えば 、BYK-348）を溶解します。その後、2 mLの30の％のTiO 2分散液に界面活性剤溶液の0.02 mLを加え。 </li><li>得られた溶液から、ドロップキャスト0を。清浄なSi基板上に2 mLです。 </li><li>空気中で2時間、250℃でこれらのドロップキャスト表面をアニール。 41 </li></ol></li></ol> 3.シングル分子力分光測定<ol><li>市販の二成分接着剤でAFMの金属製のホルダーに所望の表面を取り付けます。小さなペトリ皿のように形作られているAFM、ガラスホルダーに金属製のホルダーを配置します。トリス緩衝液（50mMのpH = 7.4）、または任意の媒体と、このホルダーを記入してください。そして、チップホルダ以下AFMステージ上にホルダーを配置します。 </li><li>約10％の絶対的な不確実性（AFMソフトウェアに含まれる）熱揺らぎ法26を使用して10から30 PN / nmの範囲のバネ定数とAFMカンチレバーのキャリブレーションを行います。 </li><li>それが圧縮された基板に接触するまで、基板にアミノ酸又はペプチド官能先端に近づくことにより、相互作用の力を測定〜200 pNでの力と直ちに〜200nmの距離のために、0.1〜0.8ミクロン/秒から、様々な速度で先端を撤回。 </li></ol> 4.データ解析<ol><li>フォトダイオードの感度（V / m）を乗算し、実験的に決定されたばね定数を使用して強制的に偏向値（V）に変換します。 42これは、AFMソフトウェアによって自動的に行われます。 <ol><li> 1単一分子イベントとFD曲線を得るためには、曲線の数百（800-1,500）を記録。単一分子曲線に2つのピークを取得します。最初のピークは、表面と分子の特異的な相互作用に先端部と表面と第2のピークに相当するとの間の非特異的な相互作用を示しています。 FD曲線は、これら2つのピークを超えて含有する場合、最も可能性の力の計算からそれらを捨てます。 注：つだけ接着イベントは（曲線の10〜30％の）考慮されます。 43 </li></ol></li><li&gt;は、その後のヒストグラムを調製するために使用された積載率のセットを取得する直前に破裂に明らか負荷率、ワームのようなチェーン（WLC）モデル44との距離曲線対フィット少なくとも50の力を計算するために、見かけの負荷率。基板からカンチレバーを分離した後力のジャンプからのペプチド/アミノ酸と表面との間のバインド解除力を求めよ。 </li></ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

1.3の手順、プロトコル1.4と1.7は、大規模な注意を払って、非常に穏やかな方法で行われるべきです。ステップ1.3において、チップは、シラン混合物と接触してはならず、シラン化処理は、不活性雰囲気（無水）で行われるべきです。 45これは、多層の形成を防止するために、シラン分子が容易に水分の存在下で加水分解を受けるために行われます。 45 <...

タンパク質および無機鉱物との間の相互作用は、独特の特性を有する複合材料の構築につながります。これは、高い機械的強度、または独自の光学特性を有する材料を含みます。例えば、 図1、 図2は 、鉱物ヒドロキシアパタイトとタンパク質コラーゲンの組み合わせは、異なる機能のための軟質または硬質の骨のいずれかを生成します。 3短いペプチドはまた、特異性の高い無機材料をバインドすることができます。 4、5、これらのペプチドの6特異性は、結晶を成長させる、9ナノ構造材料を製造する、8、7、新たな磁気及び電子材料を設計するために使用されています、 10とナノ粒子を合成します。 図11は、ペプチドまたはタンパク質と無機材料との間の相互作用の根底にあるメカニズムを理解することは、したがって、私たちは改善された吸着特性を持つ新しい複合材料を設計することができるようになります。免疫応答とインプラントの間期は、タンパク質によって媒介されるので、また、より良い無機物質とタンパク質の相互作用を理解することは、インプラントを設計する当社の能力を向上させます。無機表面と相互作用するタンパク質が関与するもう一つの重要な領域は、防汚材料の製造です。 12、13、14、15生物付着生物が表面に付着する望ましくないプロセスです。それは私たちの生活に多くの有害な影響を与えます。例えば、医療機器上の細菌の生物付着は、院内感染につながります。ボートや大型船舶の海洋生物の生物付着が増加します<html>燃料の消費量。 12、16、17、18 単一分子力分光法（SMFS）は、AFMを用いて、直接アミノ酸または基質とペプチドの間の相互作用を測定することができます。このようなファージディスプレイ、27、28と19、20、21、22、23、24、25、26他の方法 水晶微量天秤（QCM）29または表面プラズモン共鳴（SPR）29、30、31、32、REF &quot;&gt; 33小節バルク中の無機表面へのペプチドおよびタンパク質の相互作用。34、35、36 これは、これらの方法により得られた結果は、分子または凝集体の集合に関連することを意味します。 SMFSでは、1つまたは非常に少数の分子は、AFMチップに固定されており、所望の基材との相互作用が測定されます。このアプローチは、表面からのタンパク質を引っ張ることによって、タンパク質のフォールディングを研究するために拡張することができます。また、細胞タンパク質およびそれらのリガンドに対する抗体の結合との間の相互作用を測定することができます。 37、38、39、40本稿では、シラノール化学を用いてAFMチップにペプチドまたはアミノ酸のいずれかを接続する方法を詳細に説明しています。また、紙は力の測定を実行する方法および分析する方法について説明します結果。

<table><tbody><tr><td>Silicon nitride (Si&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;) AFM cantilevers with silicon tips</td><td>Bruker (Camarilo, CA, USA)</td><td></td><td>MSNL10, nominal cantilevers radius ~2 nm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Methyltriethoxysilane&amp;nbsp;</td><td>Acros Organics (New Jersey, USA)</td><td></td><td>For Silaylation of the AFM tip&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>3-(Aminopropyl) triethoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel)</td><td></td><td>For Silaylation of the AFM tip</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel)</td><td></td><td>Used for peptide deprotection</td></tr><tr><td>N-Ethyldiisopropylamine</td><td>Alfa-Aesar (Lancashire, UK)</td><td></td><td>Used for tip modification</td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Alfa-Aesar (Lancashire, UK)</td><td></td><td>Used for tip modification</td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>Alfa-Aesar (Lancashire, UK)</td><td></td><td>Used for tip Fmoc deprotection</td></tr><tr><td>Fluorenylmethyloxycarbonyl-PEG-N-hydroxysuccinimide&amp;nbsp; (Fmoc-PEG-NHS)</td><td>Iris Biotech GmbH (Deutschland, Germany)</td><td></td><td>Used as the covalent flexible linker&amp;nbsp; (MW = 5,000 Da)</td></tr><tr><td>2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU)</td><td>Alfa Aser (Heysham, England)</td><td></td><td>Used as a coupling reagent.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>N-methyl-2-pyrrolidone (NMP)</td><td>Acros Organics (New Jersey, USA)</td><td></td><td>Used as Solvent in Tip modification procedure</td></tr><tr><td>DMF (dimethylformamide)</td><td>Merck (Darmstadt, Germany)</td><td></td><td>Used as Solvent in Tip modification procedure</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Bio-Lab (Jerusalem, Israel)</td><td></td><td>Used as Solvent in Tip modification procedure</td></tr><tr><td>Ethanol (Anhydrous)</td><td>Gadot (Netanya, Israel)</td><td></td><td>Used as Solvent in Tip modification procedure</td></tr><tr><td>Trifluoro acetic acid (TFA)</td><td>Merck (Darmstadt, Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Merck (Darmstadt, Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptides</td><td>GL Biochem (Shanghai, China).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenylalanine and Tyrosine&amp;nbsp;</td><td>Biochem (Darmstadt, Germany)&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% TiO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; dispersion in the mixture of solvent 2-(2-Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP)</td><td>Applied Vision Laboratories (Jerusalem, Israel)</td><td></td><td>(30%) in the mixture of solvent 2-(2 Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP). Used for TiO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; substrate preparation</td></tr><tr><td>Mica substrates</td><td>TED PELLA, INC. (Redding, California, USA)</td><td></td><td>9.9 mm diameter</td></tr></tbody></table>

insights into the interactions of amino acids and peptides with inorganic materials using single-molecule force spectroscopy

タンパク質またはペプチドと無機材料との間の相互作用は、いくつかの興味深いプロセスにつながります。例えば、無機物でタンパク質を結合する独特の特性を有する複合材料の形成をもたらします。また、生物付着の好ましくないプロセスが表面上の生体分子、主にタンパク質の吸着によって開始されます。この有機層は、細菌のための接着層であり、それらは表面と相互作用することを可能にします。有機 - 無機界面での相互作用を支配する基本的な力を理解することは、研究の多くの分野のためには重要であると、光学機械的および生物医学的用途のための新しい材料の設計につながる可能性があります。本稿では、ペプチドまたはアミノ酸と明確に定義された無機表面のいずれかとの間の接着力を測定するために、AFMを利用して単一分子力分光法の技法を示しています。この技術は、AFMに生体分子を付着するためのプロトコルを含みます原子間力顕微鏡による共有結合柔軟なリンカーおよび単一分子力分光測定を通じて先端。また、これらの測定値の分析が含まれます。

図1は、先端変更手順を示します。第1のステップでは、プラズマ処理は、窒化シリコンチップの表面を変化させます。先端はOH基を提示します。これらのグループはその後、シランと反応します。このステップの終了時に、チップの表面は、遊離-NH 2基により覆われます。これらの遊離アミンは、その後のFmoc -PEG-NHS、共有結合性リンカーと反応し?...

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Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

ここでは、原子間力顕微鏡（AFM）を用いて、単一分子力分光測定によって明確に定義された無機表面のいずれかのペプチドまたはアミノ酸との間の相互作用の力を測定するためのプロトコルを提示します。測定から得られた情報は、より良好なペプチド無機材料相間を理解することが重要です。

単一分子力分光法を用いて無機材料とアミノ酸とペプチドの相互作用への洞察

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

insights-into-interactions-amino-acids-peptides-with-inorganic

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Chemistry

8.0K ビュー.  The Hebrew University of Jerusalem. ここでは、原子間力顕微鏡（AFM）を用いて、単一分子力分光測定によって明確に定義された無機表面のいずれかのペプチドまたはアミノ酸との間の相互作用の力を測定するためのプロトコルを提示します。測定から得られた情報は、より良好なペプチド無機材料相間を理解することが重要です。 

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Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

磁気ピンセットを用いた多重化単分子フォースタンパク質分解測定

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

生物工学

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子の力分光法

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

生化学

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. At the same time the AFM tip is passivated to prevent unspecific interactions between the tip and the substrate, which is a prerequisite to study single molecules attached to the AFM tip. Analyses to determine the adhesion force, the adhesion length, and the free energy of these molecules on solid surfaces and bio-interfaces are shortly presented and external references for further reading are provided. Example molecules are the poly(amino acid) polytyrosine, the graft polymer PI-g-PS and the phospholipid POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine). These molecules are desorbed from different surfaces like CH3-SAMs, hydrogen terminated diamond and supported lipid bilayers under various solvent conditions. Finally, the advantages of force spectroscopic single molecule experiments are discussed including means to decide if truly a single molecule has been studied in the experiment.

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

原子間力分光法による単一分子の接着性を調査

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

工学

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

力の単一分子分光法のための蛋白質の共有結合固定

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with neurodegenerative conditions such as Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s diseases. In particular low molecular weight aggregates, amyloid oligomers, have been shown to possess generic cytotoxic properties and are implicated as neurotoxins in many forms of dementia. We illustrate the use of methods based on atomic force microscopy (AFM) to address the challenging task of characterizing the morphological, structural and chemical properties of these aggregates, which are difficult to study using conventional structural methods or bulk biophysical methods because of their heterogeneity and transient nature. Scanning probe microscopy approaches are now capable of investigating the morphology of amyloid aggregates with sub-nanometer resolution. We show here that infrared (IR) nanospectroscopy (AFM-IR), which simultaneously exploits the high resolution of AFM and the chemical recognition power of IR spectroscopy, can go further and enable the characterization of the structural properties of individual protein aggregates, and thus offer insights into the aggregation mechanisms. Since the approach that we describe can be applied also to the investigations of the interactions of protein assemblies with small molecules and antibodies, it can deliver fundamental information to develop new therapeutic compounds to diagnose or treat neurodegenerative disorders.

We describe the application of infrared nanospectroscopy and high-resolution atomic force microscopy to visualize the process of protein self-assembly into oligomeric aggregates and amyloid fibrils, which is closely associated with the onset and development of a wide range of human neurodegenerative disorders.

赤外線ナノ分光法と原子間力顕微鏡による個々のタンパク質凝集物の特徴付け

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled protein polymerization process is always a challenge. Here, we have developed an enzymatic methodology for constructing polymerized protein step by step in a rationally-controlled sequence. In this method, the C-terminus of a protein monomer is NGL for protein conjugation using OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) while the N-terminus was a cleavable TEV (tobacco etch virus) cleavage site plus an L (ENLYFQ/GL) for temporary N-terminal protecting. Consequently, OaAEP1 was able to add only one protein monomer at a time, and then the TEV protease cleaved the N-terminus between Q and G to expose the NH2-Gly-Leu. Then the unit is ready for next OaAEP1 ligation. The engineered polyprotein is examined by unfolding individual protein domain using atomic force microscopy-based single-molecule force spectroscopy (AFM-SMFS). Therefore, this study provides a useful strategy for polyprotein engineering and immobilization.

Here, we present a protocol to conjugate protein monomer by enzymes forming protein polymer with a controlled sequence and immobilize it on the surface for single-molecule force spectroscopy studies.

OaAEP1-媒介酵素合成と単分子力分光法のための重合タンパク質の固定化

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and surfaces. For a true single molecule experiment, covalent attachment of the probe molecule is essential because only then can hundreds of force-extension traces with one and the same single molecule be obtained. Many traces are in turn necessary to prove that a single molecule alone is probed. Additionally, passivation is crucial for preventing unwanted interactions between the single probe molecule and the AFM cantilever tip as well as between the AFM cantilever tip and the underlying surface. The functionalization protocol presented here is reliable and can easily be applied to a variety of polymers. Characteristic single molecule events (i.e., stretches and plateaus) are detected in the force-extension traces. From these events, physical parameters such as stretching force, desorption force and desorption length can be obtained. This is particularly important for the precise investigation of stimuli-responsive systems at the single molecule level. As exemplary systems poly(ethylene glycol) (PEG), poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) and polystyrene (PS) are stretched and desorbed from SiOx (for PEG and PNiPAM) and from hydrophobic self-assembled monolayer surfaces (for PS) in aqueous environment.

Covalent attachment of probe molecules to atomic force microscopy (AFM) cantilever tips is an essential technique for the investigation of their physical properties. This allows us to determine the stretching force, desorption force and length of polymers via AFM-based single molecule force spectroscopy with high reproducibility.

AFMベースの力分光法のための単一分子の共有結合

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and ...

化学

Ensemble Force Spectroscopy by Shear Forces

Single-molecule techniques based on fluorescence and mechanochemical principles provide superior sensitivity in biological sensing. However, due to the lack of high throughput capabilities, the application of these techniques is limited in biophysics. Ensemble force spectroscopy (EFS) has demonstrated high throughput in the investigation of a massive set of molecular structures by converting mechanochemical studies of individual molecules into those of molecular ensembles. In this protocol, the DNA secondary structures (i-motifs) were unfolded in the shear flow between the rotor and stator of a homogenizer tip at shear rates up to 77796/s. The effects of flow rates and molecular sizes on the shear forces experienced by the i-motif were demonstrated. The EFS technique also revealed the binding affinity between DNA i-motifs and ligands. Furthermore, we have demonstrated a click chemistry reaction that can be actuated by shear force (i.e., mechano-click chemistry). These results establish the effectiveness of using shear force to control the conformation of molecular structures.

Ensemble force spectroscopy (EFS) is a robust technique for mechanical unfolding and real-time sensing of an ensemble set of biomolecular structures in biophysical and biosensing fields.

せん断力によるアンサンブル力分光法

Single-molecule techniques based on fluorescence and mechanochemical principles provide superior sensitivity in biological sensing. However, due to the ...

A Fourier Transform Infrared Spectroscopy Technique to Study Peptide Self-Assembly

To prepare a self-assembly solution, dissolve 1 milligram of the lyophilized peptide powder in a mixture of 20% acetonitrile and 10-millimolar HEPES in a 1.5-milliliter microcentrifuge tube. Then, vortex the assembly solution and leave the sample to assemble at room temperature.
When the peptide assembly reaches maturation, dry 8 to 10 microliters of the assembly solution as a thin film on the attenuated total reflection diamond crystal, and monitor the disappearance of a large and broad water peak from 1,640 to 1,630 inverse centimeters as the dry film forms.
Acquire background and infrared spectra from 1,500 to 1,800 inverse centimeters, averaging 50 scans with a 2-inverse centimeter resolution, subtracting the background scans prior to each sample scan.
The infrared signature for beta-sheet assembly should be observed as a sharp peak between 1,625 and 1,635 inverse centimeters.