This work was supported by the Marie Curie International Reintegration Grant (EP7). P. D. acknowledges the support of the Israel Council for Higher Education.

1. İpucu Modifikasyon <ol><li> Satınalma silisyum nitrür (Si 3 N 4) silikon uçları ile AFM dirsekleri (~ 2 nm nominal konsol yarıçapı). </li><li> 20 dakika boyunca, susuz etanol içinde daldırma her AFM konsol temizleyin. Oda sıcaklığında kurutun. Daha sonra 5 dakika boyunca O 2 plazmaya maruz bırakılmasıyla konsol davranın. </li><li> 15 oranında (3 cm) ihtiva eden bir çözelti metiltrietoksilan ve 3- (aminopropil) trietoksisilan, yukarıda Temiz ipuçlarını askıya alınması: 1 (hacim / hacim) bir atıl atmosfer (azot ya da argon ya da) altında bir desikatör içinde ve desikatörde bağlamak bir vakum pompası. 2 saat için vakum karışık silan bileşimleri, bu iki tür bir tek tabaka oluşturulur. </li><li> sıcak bir plaka üzerinde ipuçları yerleştirmek için (bu işlem için üretilmiş) metalik bir ucu tutucu kullanın. Daha sonra atmosfer şartları altında 70 ° C&#39;de 10 dakika süre ile ipuçları kurutun. Kullanmadan önce, etanol kullanılarak sıcak plaka, metal tutucu ve cımbız temizleyin. </li><li> oda t ipuçlarını soğutmakemperature, ve daha sonra 1 saat boyunca% 0.5 (h / h) trietilamin ihtiva eden kloroform içinde 5 mM konsantrasyonda Floroenilmetiloksikarbonil-PEG-N-hidroksi-çözeltisi (Fmoc-PEG-NHS, MW 5,000 Da) de içine ipuçları batırmak oda sıcaklığı. </li><li> 5 dakika boyunca kloroform içinde ipuçlarını daldırma ve daha sonra ilave 5 dakika boyunca dimetilformamit (DMF) içinde daldırma. PEG molekülüne Fmoc grubunun korumasının kaldırılması için, 30 dakika süre ile, DMF içinde% 20 piperidin (h / h) ipuçlarını daldırma. 4 dakika için ve daha sonra, ilave 4 dakika süreyle N-metil-2-pirolidon (NMP) içinde DMF içinde ipuçlarını batırın. üç kez daldırma sıralı tekrarlayın. </li><li> Amino asitlerin bağlanması için, N-ucu korumalı amino asit (AA) / diizopropiletilamin (DIPEA) / 2- (1 H-benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetrametilüronyum hexafluophosphate ihtiva eden bir çözelti içine sokmak ipuçları 1.5 saat boyunca 5 ml NMP içinde 30 mM bir toplam konsantrasyonda 1: 1: 1 arasında bir molar oranda (HBTU). </li><li> Peptit bağlama, bir 5 ml çözelti cont içine ipuçları daldırmakorunan peptidin 40 mg Tahliye (N terminal ve yan zincir, örneğin Fmoc-Gln (Trt) -Pro-Ala-Ser (tBu) -Ser (tBu) -Arg için (PBF) -Tyr (tBu) -COOH). , 15 mg 2- (1H-benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetrametilüronyum heksaflorofosfat (HBTU), ve 2 saat boyunca NMP içinde DIPEA 5 ml. </li><li> 4 dakika boyunca NMP içinde ipuçlarını batırın. Daha sonra, asetil grubu ile oyma serbest / tepkimemiş NH2 koruma molar oranı 4 asetik anhidrit / DIPEA karışımı 30 dakika boyunca ipuçları daldırma: 1 ile NMP içinde 0.65 M bir toplam konsantrasyonu. </li><li> Peptid bağlantı için, iki ek adımları uygulayın. <ol><li> Peptit yan zincirleri korumasının kaldırılması, 1 saat boyunca% 95 TFA,% 2.5 triizopropilsilan ve% 2.5 su ihtiva eden bir çözelti içine ipuçları sokmak ve sonra kloroform ve DMF yıkama için. </li><li> 30 dakika süre ile, DMF içinde% 20 piperidin (h / h) içine ipuçları, peptidin Fmoc grubunun çıkarılması sokmak için. </li></ol></li><li> Sıralı peptit / aminoasit-işlevselleştirme daldırmaKloroform,% 50 etanol ve su (amino asit) (peptitler) DMF ya da NMP içinde dört dakika her biri d ipuçları. Nihayet havada ucu kurutun. </li></ol> 2. Yüzey Hazırlama <ol><li> mika hazırlayın. seloteyip kullanarak her kullanımdan önce yüzeyler (9.9 mm çap) bölmektedir. Ardından, üçlü damıtılmış su (TDW) ile yüzeyleri yıkayın. </li><li> TiO2 -kaplı silikon hazırlayın. <ol><li> Bir elmas kalem kullanarak 2 cm kareler halinde silikon gofret (100) kesin. </li><li> aseton ile doldurulmuş bir 15 ml test tüpü içinde yerleştirilmesidir ve bir ultrason banyosu içinde beş dakika için sonikasyon. Daha sonra, izopropanol ile doldurulmuş bir 15 ml test tüpü içinde, bu yüzey koyun ve 5 dakika için sonikasyon. azot kullanılarak substrat kurutun. </li><li> % 5 (ağırlık / hacım) bir solüsyonu hazırlamak için, etanol içinde yüzey aktif madde (örneğin, Byk-348) içinde çözülür. Daha sonra, 2 ml% 30 TiO2 dispersiyona sürfaktan çözeltisinin 0.02 ml. </li><li> Elde edilen çözelti itibaren, 0-cast damla.Temiz bir Si alt-tabaka 2 ml. </li><li> Havada 2 saat boyunca 250 ° C &#39;de, bu açılan döküm yüzeyleri yeniden birleşir. 41 </li></ol></li></ol> 3. Tek-molekül Kuvvet Spektroskopi Ölçümleri <ol><li> piyasada mevcut iki bileşenli yapıştırıcı ile AFM metalik sahibine istenen yüzey takın. küçük bir petri şeklindedir AFM, cam tutucu metalik tutucu yerleştirin. Tris tamponu (50 mM, pH = 7.4) ya da arzu edilen herhangi bir ortam ile bu tutucu doldurun. Sonra, ucu tutucu altında AFM sahnede tutucu yerleştirin. </li><li> % 10 kadar mutlak belirsizlikle (AFM yazılım dahil) ısı dalgalanma yöntemi 26 ile 10 ile 30 pN / nm arasında değişen yay sabitleri AFM konsol kalibre edin. </li><li> Bir sıkıştırma ile alt-tabaka ile temas edene kadar alt-tabaka, amino asit ya da peptid-işlevselleştirilmiş ucu yaklaşarak etkileşim kuvveti ölçmek~ 200 pN kuvvet ve hemen ardından ~ 200 nm bir mesafe için 0.1 ile 0.8 mm / s, çeşitli hızlarda ucu geri çekin. </li></ol> 4. Veri Analizi <ol><li> fotodiyot hassasiyeti (V / m) çarpılması ve deneysel olarak belirlenen yay sabiti kullanılarak (V) zorlamak için saptırma değerleri dönüştürmek. 42 Bu AFM yazılım tarafından otomatik olarak yapılır. <ol><li> Eğrilerin tek molekül olaylar, kayıt yüzlerce (800-1,500) ile FD eğrileri elde etmek. Bir tek-molekül eğrisinde iki tepe elde: İlk tepe ucu ve yüzey ve yüzey ile molekülün belirli bir etkileşim ikinci zirve tekabül arasındaki non-spesifik etkileşimler gösterir. FD eğrisi, bu iki tepe daha ihtiva ettiğinde, en olası güç hesaplamasına atın. NOT: Sadece tek yapışma olaylar (10 eğrilerin% 30) bir hesaba alınır. 43 </li></ol></li><li&gt; sonra histogramları hazırlamak için kullanılan yükleme oranları, bir dizi elde etmek için hemen önce rüptür için açık yükleme hızı, solucan benzeri zinciri (WLC) modeli 44 ile mesafe eğrileri vs uygun en az 50 kuvveti hesaplamak için belirgin yükleme oranları. alt tabakadan konsol ayırdıktan sonra yürürlüğe atlama gelen peptitler / amino asitler ve yüzey arasındaki unbinding kuvvetleri türevi. </li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Protokolde 1.3, 1.4 ve 1.7 detaylı özenle ve çok hassas bir şekilde yapılmalıdır Adım. adım 1.3, uç silan karışımı ile silanizasyon işlemi bir inert atmosfer (nemsiz) içinde yapılmalıdır temas etmemelidir. 45 Bu çok tabakalı oluşmasını önlemek için ve silan moleküller nemi kolayca mevcudiyetinde hidrolize için yapılır. 45 Aşama 1.4, sıcaklık ve zaman düzgün bir şekilde muhafaza edilmelidir. adım 1.5 başlama...

proteinler ve inorganik mineraller arasındaki etkileşim ayırt edici özelliklere sahip kompozit malzeme yapısına yol açar. Bu yüksek mekanik mukavemet ve eşsiz optik özellikleri olan malzemeler içerir. Örneğin, 1, 2, maden hidroksiapatit protein kollajen kombinasyonu, farklı işlevler için yumuşak ya da sert kemik ya oluşturur. 3 Kısa peptitler de yüksek özgüllük ile inorganik maddeler bağlayabilirsiniz. 4, bu peptidlerin 5, 6 özgüllük, kristaller, 9 nano yapılı malzemeler imal, 8, 7, yeni manyetik ve elektronik malzeme tasarımında büyütmek için kullanılmaktadır 10 ve sentezleme nanopartiküller. 11 Bu nedenle bize geliştirilmiş adsorptif özellikleri olan yeni kompozit malzemeler tasarlamak sağlayacak peptidler veya proteinler ve inorganik maddeler arasındaki etkileşimleri altında yatan mekanizma anlamak. bir bağışıklık tepkisi ile implant interfaz proteinleri aracılık beri ek olarak, daha iyi inorganik maddelerle proteinlerin etkileşimlerini anlamak implantları tasarım yeteneğimizi artıracak. İnorganik yüzeyler ile etkileşim proteinleri içeren diğer önemli alan zehirli maddelerin imalatı olduğunu. 12, 13, 14, 15 Biyolojik kirlilik organizmalar, bir yüzeye eklemek hangi istenmeyen bir işlemdir. Bu bizim hayatımızın birçok zararlı etkileri vardır. Örneğin, tıbbi cihazlarda bakteri biyolojik kirlenme hastane kaynaklı enfeksiyonların yol açar. teknelerle büyük gemilerde deniz organizmalarının biyolojik kirlenme artar<html> yakıt tüketimi. 12, 16, 17, 18 Tek moleküllü kuvveti Spektroskopisi (SMFs), bir AFM yoluyla doğrudan bir amino asit ya da bir alt-tabaka ile bir peptid arasındaki etkileşimi ölçebilir. Bu faj gösterimi, 27, 28 olarak 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 başka yöntemler kuartz kristali mikro-(QCM) 29 veya yüzey plazmon rezonans (SPR) 29, 30, 31, 32,ref &quot;&gt; 33 ölçü toplu olarak, inorganik yüzeylere peptidlerin ve proteinlerin etkileşimleri. 34, 35, 36 Bu durum, bu yöntem ile elde edilen sonuçlar molekül veya agrega toplulukları ilgili olduğu anlamına gelir. SMFs olarak, bir ya da çok az moleküller AFM ucuna sabitlenir ve istenen alt-tabaka ile etkileşimleri ölçülür. Bu yaklaşım yüzeyinden proteini çekerek protein katlanmasını incelemek için genişletilebilir. Buna ek olarak, hücreler ve proteinler ve bunların ligandlarına antikorların bağlanma arasındaki etkileşimi ölçmek için kullanılabilir. 37, 38, 39, 40 Bu kağıt silanol kimyası kullanılarak AFM ucu peptid veya amino asit ya takmak için nasıl ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. Buna ek olarak, kağıt kuvvet ölçümleri gerçekleştirmek için nasıl ve analiz açıklarSonuçlar.

<table><tbody><tr><td>Silicon nitride (Si&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;) AFM cantilevers with silicon tips</td><td>Bruker (Camarilo, CA, USA)</td><td></td><td>MSNL10, nominal cantilevers radius ~2 nm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Methyltriethoxysilane&amp;nbsp;</td><td>Acros Organics (New Jersey, USA)</td><td></td><td>For Silaylation of the AFM tip&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>3-(Aminopropyl) triethoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel)</td><td></td><td>For Silaylation of the AFM tip</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel)</td><td></td><td>Used for peptide deprotection</td></tr><tr><td>N-Ethyldiisopropylamine</td><td>Alfa-Aesar (Lancashire, UK)</td><td></td><td>Used for tip modification</td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Alfa-Aesar (Lancashire, UK)</td><td></td><td>Used for tip modification</td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>Alfa-Aesar (Lancashire, UK)</td><td></td><td>Used for tip Fmoc deprotection</td></tr><tr><td>Fluorenylmethyloxycarbonyl-PEG-N-hydroxysuccinimide&amp;nbsp; (Fmoc-PEG-NHS)</td><td>Iris Biotech GmbH (Deutschland, Germany)</td><td></td><td>Used as the covalent flexible linker&amp;nbsp; (MW = 5,000 Da)</td></tr><tr><td>2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU)</td><td>Alfa Aser (Heysham, England)</td><td></td><td>Used as a coupling reagent.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>N-methyl-2-pyrrolidone (NMP)</td><td>Acros Organics (New Jersey, USA)</td><td></td><td>Used as Solvent in Tip modification procedure</td></tr><tr><td>DMF (dimethylformamide)</td><td>Merck (Darmstadt, Germany)</td><td></td><td>Used as Solvent in Tip modification procedure</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Bio-Lab (Jerusalem, Israel)</td><td></td><td>Used as Solvent in Tip modification procedure</td></tr><tr><td>Ethanol (Anhydrous)</td><td>Gadot (Netanya, Israel)</td><td></td><td>Used as Solvent in Tip modification procedure</td></tr><tr><td>Trifluoro acetic acid (TFA)</td><td>Merck (Darmstadt, Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Merck (Darmstadt, Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptides</td><td>GL Biochem (Shanghai, China).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenylalanine and Tyrosine&amp;nbsp;</td><td>Biochem (Darmstadt, Germany)&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% TiO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; dispersion in the mixture of solvent 2-(2-Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP)</td><td>Applied Vision Laboratories (Jerusalem, Israel)</td><td></td><td>(30%) in the mixture of solvent 2-(2 Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP). Used for TiO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; substrate preparation</td></tr><tr><td>Mica substrates</td><td>TED PELLA, INC. (Redding, California, USA)</td><td></td><td>9.9 mm diameter</td></tr></tbody></table>

insights into the interactions of amino acids and peptides with inorganic materials using single-molecule force spectroscopy

proteinler veya peptidler ve inorganik maddeler arasındaki etkileşimler çok ilginç işlemlere yol açar. Örneğin, mineral proteinleri birleştiren benzersiz özellikleri ile kompozit malzeme oluşumuna yol açar. Buna ek olarak, biyolojik kirlenmeye istenmeyen proses yüzeylerinde biyomoleküllerin ağırlıklı proteinlerin adsorpsiyonu ile başlatılır. Bu organik tabaka, bakteriler için bir yapışma tabakası ve onları yüzeyle etkileşim sağlar. Organik-inorganik arayüzünde etkileşimleri yöneten temel güçleri anlama araştırma birçok alanda bu nedenle önemlidir ve optik, mekanik ve biyomedikal uygulamalar için yeni malzemelerin tasarımına yol açabilir. Bu çalışma, peptitler veya amino asitler ve iyi tanımlanmış inorganik yüzeyler ya arasındaki yapışma kuvvetini ölçmek için bir AFM kullanan tek molekül kuvvet spektroskopisi teknik gösterilmiştir. Bu teknik AFM için biyomolekülü takmak için bir protokol içeriratomik kuvvet mikroskobu ile kovalent esnek bağlayıcı ve tek-molekül kuvvet spektroskopisi ölçümleri yoluyla ipucu. Buna ek olarak, bu ölçümlerin analiz dahildir.

Şekil 1 ucu modifikasyonu prosedürü sergiler. İlk aşamada, bir plazma işleme silisyum nitrür uç yüzeyini değiştirir. ucu OH gruplarını sunar. Bu gruplar daha sonra silan ile reaksiyona girer. Bu aşamanın sonunda, uç yüzey serbest -NH2 grupları ile karşılanacaktır. Bu, serbest aminler daha sonra Fmoc -PEG-NHS, kovalent bir bağlayıcı ile reaksiyona girer. PEG bağlayıcının Fmoc grubu pipyridine, koruma bozucu bir reaktif ile çıkarıl...

Watch this Scientific Journal Video about Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Burada bir atomik kuvvet mikroskopu (AFM) ile tek bir molekül kuvveti spektroskopi ölçümleri ile iyi tanımlanmış bir inorganik yüzey ve ya peptitler veya amino asitler arasındaki etkileşimlerin kuvvetini ölçmek için bir protokol mevcut. ölçümü ile elde edilen bilgiler, daha peptid inorganik madde interfazda anlamak önemlidir.

Tek Molekül Kuvvetleri Spektroskopisi kullanarak İnorganik Malzemelerle Amino Asitler ve Peptitler Etkileşimi içine Trendleri

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

insights-into-interactions-amino-acids-peptides-with-inorganic

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Chemistry

8.0K Görüntüleme.  The Hebrew University of Jerusalem.  Burada bir atomik kuvvet mikroskopu (AFM) ile tek bir molekül kuvveti spektroskopi ölçümleri ile iyi tanımlanmış bir inorganik yüzey ve ya peptitler veya amino asitler arasındaki etkileşimlerin kuvvetini ölçmek için bir protokol mevcut. ölçümü ile elde edilen bilgiler, daha peptid inorganik madde interfazda anlamak önemlidir. 

Video: Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Manyetik cımbız kullanarak Multiplexed Tek molekül Kuvvetleri Proteoliz Ölçümleri

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Biyomühendislik

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

Kuvvet spektroskopisi bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak tek Protein moleküllerinin

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Biyokimya

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. At the same time the AFM tip is passivated to prevent unspecific interactions between the tip and the substrate, which is a prerequisite to study single molecules attached to the AFM tip. Analyses to determine the adhesion force, the adhesion length, and the free energy of these molecules on solid surfaces and bio-interfaces are shortly presented and external references for further reading are provided. Example molecules are the poly(amino acid) polytyrosine, the graft polymer PI-g-PS and the phospholipid POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine). These molecules are desorbed from different surfaces like CH3-SAMs, hydrogen terminated diamond and supported lipid bilayers under various solvent conditions. Finally, the advantages of force spectroscopic single molecule experiments are discussed including means to decide if truly a single molecule has been studied in the experiment.

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

Atomik Kuvvet Spektroskopi Tek Molekül Yapışma incelenmesi

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

Mühendislik

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

AFM-tabanlı Tek-molekül Kuvvetleri Spektroskopisi ile cellulosome Reseptör-ligand Sistemleri Araştırılması

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with neurodegenerative conditions such as Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s diseases. In particular low molecular weight aggregates, amyloid oligomers, have been shown to possess generic cytotoxic properties and are implicated as neurotoxins in many forms of dementia. We illustrate the use of methods based on atomic force microscopy (AFM) to address the challenging task of characterizing the morphological, structural and chemical properties of these aggregates, which are difficult to study using conventional structural methods or bulk biophysical methods because of their heterogeneity and transient nature. Scanning probe microscopy approaches are now capable of investigating the morphology of amyloid aggregates with sub-nanometer resolution. We show here that infrared (IR) nanospectroscopy (AFM-IR), which simultaneously exploits the high resolution of AFM and the chemical recognition power of IR spectroscopy, can go further and enable the characterization of the structural properties of individual protein aggregates, and thus offer insights into the aggregation mechanisms. Since the approach that we describe can be applied also to the investigations of the interactions of protein assemblies with small molecules and antibodies, it can deliver fundamental information to develop new therapeutic compounds to diagnose or treat neurodegenerative disorders.

We describe the application of infrared nanospectroscopy and high-resolution atomic force microscopy to visualize the process of protein self-assembly into oligomeric aggregates and amyloid fibrils, which is closely associated with the onset and development of a wide range of human neurodegenerative disorders.

Bireysel Protein Agregalarının Kızılötesi Nanospektroskopi ve Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Karakterizeleştirilmesi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled protein polymerization process is always a challenge. Here, we have developed an enzymatic methodology for constructing polymerized protein step by step in a rationally-controlled sequence. In this method, the C-terminus of a protein monomer is NGL for protein conjugation using OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) while the N-terminus was a cleavable TEV (tobacco etch virus) cleavage site plus an L (ENLYFQ/GL) for temporary N-terminal protecting. Consequently, OaAEP1 was able to add only one protein monomer at a time, and then the TEV protease cleaved the N-terminus between Q and G to expose the NH2-Gly-Leu. Then the unit is ready for next OaAEP1 ligation. The engineered polyprotein is examined by unfolding individual protein domain using atomic force microscopy-based single-molecule force spectroscopy (AFM-SMFS). Therefore, this study provides a useful strategy for polyprotein engineering and immobilization.

Here, we present a protocol to conjugate protein monomer by enzymes forming protein polymer with a controlled sequence and immobilize it on the surface for single-molecule force spectroscopy studies.

OaAEP1-Tek Moleküllü Kuvvet Spektroskopisi İçin Polimerize Proteinin Aracılı Enzimatik Sentezi ve Immobilizasyonu

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and surfaces. For a true single molecule experiment, covalent attachment of the probe molecule is essential because only then can hundreds of force-extension traces with one and the same single molecule be obtained. Many traces are in turn necessary to prove that a single molecule alone is probed. Additionally, passivation is crucial for preventing unwanted interactions between the single probe molecule and the AFM cantilever tip as well as between the AFM cantilever tip and the underlying surface. The functionalization protocol presented here is reliable and can easily be applied to a variety of polymers. Characteristic single molecule events (i.e., stretches and plateaus) are detected in the force-extension traces. From these events, physical parameters such as stretching force, desorption force and desorption length can be obtained. This is particularly important for the precise investigation of stimuli-responsive systems at the single molecule level. As exemplary systems poly(ethylene glycol) (PEG), poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) and polystyrene (PS) are stretched and desorbed from SiOx (for PEG and PNiPAM) and from hydrophobic self-assembled monolayer surfaces (for PS) in aqueous environment.

Covalent attachment of probe molecules to atomic force microscopy (AFM) cantilever tips is an essential technique for the investigation of their physical properties. This allows us to determine the stretching force, desorption force and length of polymers via AFM-based single molecule force spectroscopy with high reproducibility.

AFM tabanlı Kuvvet Spektroskopisi için Tek Moleküllerin Kovalent Eki

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and ...

Kimya

Ensemble Force Spectroscopy by Shear Forces

Single-molecule techniques based on fluorescence and mechanochemical principles provide superior sensitivity in biological sensing. However, due to the lack of high throughput capabilities, the application of these techniques is limited in biophysics. Ensemble force spectroscopy (EFS) has demonstrated high throughput in the investigation of a massive set of molecular structures by converting mechanochemical studies of individual molecules into those of molecular ensembles. In this protocol, the DNA secondary structures (i-motifs) were unfolded in the shear flow between the rotor and stator of a homogenizer tip at shear rates up to 77796/s. The effects of flow rates and molecular sizes on the shear forces experienced by the i-motif were demonstrated. The EFS technique also revealed the binding affinity between DNA i-motifs and ligands. Furthermore, we have demonstrated a click chemistry reaction that can be actuated by shear force (i.e., mechano-click chemistry). These results establish the effectiveness of using shear force to control the conformation of molecular structures.

Ensemble force spectroscopy (EFS) is a robust technique for mechanical unfolding and real-time sensing of an ensemble set of biomolecular structures in biophysical and biosensing fields.

Kesme Kuvvetleri ile Topluluk Kuvveti Spektroskopisi

Single-molecule techniques based on fluorescence and mechanochemical principles provide superior sensitivity in biological sensing. However, due to the ...

A Fourier Transform Infrared Spectroscopy Technique to Study Peptide Self-Assembly

To prepare a self-assembly solution, dissolve 1 milligram of the lyophilized peptide powder in a mixture of 20% acetonitrile and 10-millimolar HEPES in a 1.5-milliliter microcentrifuge tube. Then, vortex the assembly solution and leave the sample to assemble at room temperature.
When the peptide assembly reaches maturation, dry 8 to 10 microliters of the assembly solution as a thin film on the attenuated total reflection diamond crystal, and monitor the disappearance of a large and broad water peak from 1,640 to 1,630 inverse centimeters as the dry film forms.
Acquire background and infrared spectra from 1,500 to 1,800 inverse centimeters, averaging 50 scans with a 2-inverse centimeter resolution, subtracting the background scans prior to each sample scan.
The infrared signature for beta-sheet assembly should be observed as a sharp peak between 1,625 and 1,635 inverse centimeters.