Name: imaging calcium in drosophila at egg activation
Uploaded: 2016-08-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation at JoVE.com

我々は、この原稿の準備中に支援するためのローラ・バンプトン、アレックス・デビッドソン、リチャード・パートン、有田Acharyaさんに感謝しています。卵活性化の議論のためのマリアナWolfner。イメージングのサポートのためのマット・ウェイランド。実験室での一般的なサポートのためのナン胡。 この作品は、TTWにケンブリッジ、ISSFの大学[認可番号097814]によってサポートされていました。

注：特に明記しない限り、室温ですべてのステップを実行します。 1.解剖の準備注：ここで説明する手順は、E Gavis、プリンストン大学＆ワイルらに従っています。アル。18。 2日間の撮影前に、次の手順を実行します。 <ol><li>固形食品の約10ミリリットルを含むフライバイアルを取り、1コーナーに乾燥酵母の少量を追加し、1g未満で十分です。 注：フライバイアルまたは食品に関する情報は、「 ショウジョウバエのメンテナンス」19を参照してください。 </li><li>酵母を水和するために3滴の水 - 1を追加します。 </li><li> 45°の角度で脇バイアルを設定し、3許可 - 水を取るために酵母のための5分。 </li><li>酵母は水を吸収している間に、最近（myristoyを浮上している浴槽-VP16GAL4（GCaMP5と呼ばれる）によって駆動UASt- マイア GCaMP5 20を発現しているハエのボトルを選択GCaMP5のされた関連の形）が卵に膜にGECIをテザリングを介して、高い信号対雑音比を提供するために選ばれました。 </li><li> CO 2ガスを瓶の中にハエをAnaesthetize。ウェットフードでハエを失わないように、倒立ボトルを保つようにしてください。 </li><li> CO 2パッドの上に麻酔ハエヒントとソート10から15人の女性と解剖顕微鏡下で絵筆を使用して5人の男性。注：解剖のための健康的なメスを提供するために、男性を含めるための規格です。 </li><li>ステップ1.3からのバイアルの準備ができたら、バイアルに選択されたハエを追加します。ハエがアクティブになるまでバイアル水平を保つように注意してください。 </li><li>約36時間、25℃でバイアルを置きます。 </li><li>ボトルや廃棄にCO 2パッドから残りのハエを返します。 </li></ol> 2.解剖ショウジョウバエ卵巣注：ここで説明する手順は、ワイルらに従っています。アル。 <s&gt; 18アップ。 <ol><li> 36時間後、CO 2とyeastedバイアルからハエをanaesthetize。 </li><li>バイアル内部のハエを麻酔したら、解剖顕微鏡下でペイントブラシでソートするCO 2パッドの上にそれらを傾けます。 </li><li>女性を選択します。 </li><li>女性からの2の卵巣を分離します。完全な詳細なプロトコールについてはワイルらを参照してください。アル。18。要約すれ​​ば： <ol><li>第1.5、22×40ミリメートルカバースリップ上の酸素ハロカーボンオイル（シリーズ95）の小滴を置きます。 </li><li>腹部の前で鉗子で女性をつかみます。 </li><li>解剖顕微鏡下で女性を持ち、優しく女性の後部を削除するには、鉗子の第2のセットを使用します。 </li><li>第二の鉗子から後方組織を拭き取ってください。 </li><li>前方から腹部の後方への第2の鉗子を用いて腹腔に絞ります。時FEMAの外側にある半透明の卵巣が鉗子に固執する必要がありますル。 </li><li>油に卵巣をタッチします。 </li><li>鉗子を拭き取ることにより、鉗子から任意の組織を削除します。 </li><li> 3カバースリップ、1 flyから卵巣を含む各を得るために - これらの手順（2.4.7 2.4.1）を繰り返します。 </li></ol></li></ol> 3.単離個々の熟卵<ol><li> 4Xに設定倍率の標準的な解剖顕微鏡下では、ステップ2.4​​からの最初のカバースリップ上で、卵管を引き裂くことにより、2つの卵巣を分離します。 </li><li>任意の卵室を穿刺しないように注意しながら、単一の卵巣の中央に閉じたピンセットをご紹介します。 </li><li>次の閉じた鉗子に卵巣の中心​​部への標準的な解剖プローブを挿入します。 </li><li>ゆっくり成熟卵（ステージ14卵室）が配置された後極に向かって卵巣を介して解剖プローブをドラッグします。 </li><li>繰り返しは3.1ステップ - 3.4 2から5回は卵巣と卵の数のサイズによって異なります。 注：CO 2の追加</サブ&gt;は、通常、予め堆積卵よりも隆起した背の付属と大きく表示されます単一の卵の堆積を引き起こします。それは既に女性の内部で起動されているので、この卵は、イメージングのために破棄されるべきです。 注：成熟卵は卵巣結合組織から容易に分離する可能性があります。 </li><li>全く成熟した卵は卵巣の外側に表示されていない場合、解剖プローブとからかっ優しく続けます。 </li><li>カバースリップの中央に一列に5 - 成熟した卵子が卵巣の外側カバースリップ上に表示されたら、3を操縦。 注：最良の結果を得るために、穏やかに卵の側面に沿ってプローブを実行します。 注：これは卵に損傷を与えることができるよう背付属を引っ張ることは避けてください。 注：将来のイメージングセットアップに応じて、最大撮影領域のためのカバーガラスに垂直に200μm程度離れて卵を合わせます。 </li><li>整列一度、Fを使用して整列卵から離れて、それをドラッグすることで、卵巣組織の残りの部分を削除しますorceps。 </li><li>ワイプ医療のコーナーで軽くたたくことにより、余分な油を削除します。医療が接触するなどの成熟卵を拭くと成熟卵を触れないように注意してくださいが失われます。 </li><li>顕微鏡下でのサンプルの位置を簡単にするためにマーカーでカバースリップ上の十字線を描画します。 </li><li>安全な場所にカバーグラスをセットし、5休まカバースリップ上に準備された卵室を残す - 10分。これは、油中に解決する卵を可能にします。試料は、1時間後の切開まで使用することができます。 </li><li>それらの上に卵巣とカバースリップの残りのための3.11 - を繰り返して、3.1を繰り返します。 </li></ol> 4.イメージングのための準備<ol><li>室温に準備されたアクティベーションバッファ15を持参してください。 注：活性化緩衝液は低張性緩衝液である：3.3ミリモルのNaH 2 PO 4、16.6 mMのKH 2 PO 4、10mMの塩化ナトリウム、50mMのKClを、5％のポリエチレングリコール8,000は、2mMのCaCl 2を 、1を用いてpHを6.4にしました。 NaOHを5比：KOH。詳細についてはMahowald、1983年15を参照してください。活性化緩衝液のアリコートを2週間までヶ月と4℃で-20℃で保存することができます。 </li><li>慎重イメージング施設に準備されたカバースリップ、活性化バッファー及びガラスピペットを輸送。 注：広視野共焦点、スピニングディスク又は光学シート用顕微鏡を使用することができます。私たちは、倒立顕微鏡を使用することをお勧めします。私たちの代表的な結果は、共焦点顕微鏡を用いて得ました。 </li><li>全体の成熟卵を画像化するのに適した目的は、（ここでは：20X 0.7 NA）を選択すべきです。 </li><li>顕微鏡ステージ上に最初に準備されたカバースリップをマウントします。ステージ上にカバースリップを壊さないように注意してください。 </li><li>定性的には活性化のための成熟した卵室でビューのフィールドを選択します。画像は卵室または膜中のブレブ形成を有するものがパンクしないでください。 注意：手順4.6について - 4.7、ソフトウェアコマンドは、顕微鏡やメーカーによって異なります。 </li><li>設定された撮影パラ（ - 580から500nm）標準GFPの励起（488 nm）を発光のためメートル。また、成熟した卵と変位油を可視化し、配向するために、明視野ビューを設定。 </li><li>成熟卵が表示されている最低のZ平面を選択し、ステップ当たり40マイクロメートルで約2μmのために取られるフルZスタックを設定します。 Zスタックの取得の間に遅延がないようにパラメータを設定します。約30分間キャプチャする時系列を設定します。 </li></ol> 5.イメージングex vivoで卵活性化<ol><li>画像キャプチャを開始します。 </li><li>取得する2フルZ-スタック - 1のを待ちます。これは、活性化の前に成熟した卵子を示しています。 </li><li>ガラスピペットに活性化バッファーの約300μLを撤回。 </li><li>それは成熟した卵は、撮像されているの真上になるまでカバースリップ上記45°の角度で活性化緩衝液を含むガラスピペットの先端を位置決めし、ゆっくりとビーム経路にピペッ​​トを移動します。ガラスピペットべきオイルより2センチメートル - 1です。 </li><li>ガラスピペットから5秒未満で活性化緩衝液の2滴 - 1を追加します。これは、オイルを置換する必要があります。それは成熟卵の移動を引き起こすことができるように、過剰な活性化緩衝液を追加したり、ガラスピペットで卵に触れないようにしてください。これは目的とカバーガラスとの間に液浸油に形成するために、焦点面や気泡の変化を引き起こすことができるようにピペットでカバースリップに触れないように注意してください。 </li><li>画像取得時に活性化緩衝液を添加しながら、オイルが活性化緩衝液によって変位していることを確認するために、明視野チャンネルを確認してください。 注：これは、最初のビーム経路を壊すピペットによる影として表示されますが、また、小さな油滴の外観になります。一部の油滴は、実験の結果および画像品質に影響を与える成熟した卵子に関連付けられたままにすることができます。 </li><li> 5 - 油を活性化バッファー反復の最初の添加からずれていない場合は5.4ステップ0.6。 </li><li>油が正常に変位されると、時系列が完了するまで実行することができます。 注：これにより起動時の卵母細胞の膨潤に、いくつかの卵室は、活性化緩衝液を添加すると、ビューの焦点面またはフィールドの外に劇的に移動します。この状況では、取得を停止し、次のカバースリップをマウントします。 </li><li>画像シーケンスは、買収を完了した後、データを保存します。 </li></ol> 6.買収後の画像処理<ol><li>フィジー（http://fiji.sc/Downloads#Fiji）、または同等の画像処理ソフトウェアを使用して、データセットを開き、分析のために、関連するファイルを選択します。 </li><li>取得したデータの投影を構築するために選択します。画像&gt;スタック&gt; Z-プロジェクトを。 </li><li>スタートZ-スライスとストップZ-スライス、通常、セクション全体を選択します。一般的に「最大輝度」に設定投射型を選択します。シリーズ全体に選択した設定を適用するチェックボックス「すべての時間のフレーム」を確認してください。 </li><li>もし複数の蛍光チャネルは、色間の移動を可能にする複合体を作る、または画像のグレースケールを作るためにチャンネルツールを使用して、撮像されました。画像&gt;色&gt;チャンネルツールを選択します。 </li><li>画像の明るさを調整し、選択画像を対比&gt;&gt;明るさ/コントラストを調整します。 </li><li>単一のイメージをエクスポートするには、関連するフレームおよび[ファイル]&gt; [名前を付けて保存&gt; JPEG、または任意の好適なフォーマットにタイムスケールスライダーを移動します。 </li><li>保存し、エクスポートしたファイルの場所とタイトルを選択してください。 イメージングソフトウェアからフレームレートが画像にタイムスタンプを付与するために必要とされることに注意してください。 </li><li>選択ムービーとして時系列をエクスポートするには：[ファイル]&gt; [名前を付けて保存&gt; AVIファイルを、フレームレート（1秒あたり〜7フレーム）を選択します。 </li><li>保存し、エクスポートしたファイルの場所とタイトルを選択してください。 </li><li>フィジー形式で調整されたファイルを保存するには、[ファイル]&gt; [保存します。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

The first critical step in this protocol is isolating the mature eggs without damage. This can be achieved by gentile maneuvering of the eggs with the dissecting probe. Practice will enable this manipulation to be executed without damage to the eggs. A second crucial step is avoiding the loss of the sample when activation buffer is applied to the mature egg in oil. Application of the activation buffer should be done slowly and without contact with the coverslip. This step can be challenging if the microscope set-up does not allow for an easy access to the sample. Moving axillary parts of the microscope, such as a temperature incubator, is advisable. 
Modifications to this protocol can be made in order to visualize other fluorescently tagged factors, instead of Ca2+ at egg activation. More generally, different stages of Drosophila development or the results of adding a different buffer could be analyzed using this protocol. 
Troubleshooting may be required if the settings on the microscope are not optimal for visualizing the signal from the sample. This can be achieved by increasing or decreasing the laser power, altering capture range and adjusting the Z-stack parameters. Another issue might be eggs consistently moving out of the field of view upon the addition of activation buffer. If this happens regularly, allow the mature eggs to settle on the coverslips for a longer period of time, 15 to 20 minutes. Beware that using a higher viscosity oil will alter the displacement of the oil by activation buffer. 
This technique presented here is limited by the working distance of the objective, dehydration of the mature eggs and the ability to dissect the mature eggs without damage. However, when compared to in vivo imaging methods where the mature oocyte passes through the adult female and is deposited 13, our method enables more spatial resolution, the option to physically manipulate the mature egg before activation and the ability to test the role of egg activation without fertilization. 
There are many potential future applications of this technique, including testing reporter constructs for cellular components at egg activation and visualizing the Ca2+ wave in mutant backgrounds 14,24. Together with experimental and genetic tools, the ex vivo egg activation assay presented here enables the study of the trigger, propagation and downstream effects of the universally conserved Ca2+ wave.

卵（卵母細胞）の活性化における細胞内Caの変化2+濃度は、全ての研究生物1,2の保存コンポーネントです。このイベントは、細胞周期の再開と、記憶されたmRNAの翻訳などのCa 2+依存性プロセスの広い範囲を、開始します。細胞内Ca 2+濃度の一過性の変化を可視化するのCa 2+のためのこの要件にキー注目されています。 歴史的に、モデル生物は、その卵の大きさと可用性に基づいて卵活性化の研究のために選択しました。様々な可視化手法では、次のようにシステム内の細胞内Ca 2+濃度の変化に従って、定量化するために利用されてきた：メダカ3における発光タンパク質エクオリンを、このようなフラ-2ウニとハムスター4,5のようにの Ca 2+感受性蛍光色素;そして、カルシウムグリーン1デキストランアフリカツメガエル 6インチ遺伝的にコードされたカルシウム指標（GECIs）の生成および改良は、in vivo 7 中の Ca 2+動態を可視化する能力を変えてきました。これらの遺伝子構築物は、特定の組織で発現し、侵襲性の組織標本8の必要性を制限しています。 GCaMPsは、それらの高い親和性の Ca 2+、信号対雑音比及び9-11をカスタマイズするための能力に非常に有効であった緑色蛍光タンパク質（GFP）GECIsのベースクラスです。 Ca 2+の存在下では、GCaMP複合体は、カルモジュリンへのCa 2+の結合を開始し、コンフォメーション変化のシリーズを受けることGFP部品9の蛍光強度の増加をもたらします。 GCaMPsは広く、細胞内カルシウム12の変化を可視化するために、 ショウジョウバエの神経細胞の研究に使用されています。最近のアプリケーションシート成熟したショウジョウバエの卵中のCa 2+を可視化するGCaMP技術の上で卵活性化13,14で単一の一過性のCa 2+波を明らかにしました。 Ca 2+波は、ex vivoで活性化アッセイ13,14を用いてインビボ 13 またはより高い倍率で排卵時低倍率で視覚化することができます。 ex vivoでのアッセイでは、個々の成熟した卵母細胞を卵巣から単離し、低張溶液を用いて活性化され、in vivoで活性化15-17のイベントを再現することが示されている活性化緩衝液と呼ばれます。 このex vivoのアッセイは、薬理学的破壊、物理的な操作と遺伝的変異体を含む、異なる実験条件の下でのCa 2+波の容易な高解像度の可視化を可能にします。この記事では、ex vivo活性化及び目のための成熟したショウジョウバエの卵の調製を示しますGCaMPを使用してのCa 2+波を可視化するために使用する電子その後の顕微鏡。このアプローチは、Ca 2+波の開始と制御をテストし、下流の結果を調べるために使用することができます。

<table><tbody><tr><td>Dry active yeast</td><td>Fleischman&amp;rsquo;s</td><td>#2192</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>Various will work</td></tr><tr><td>Lamp</td><td>Mircotec Fibre optic</td><td>MF0-90</td><td>Various will work</td></tr><tr><td>Medical wipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>KLEW3020&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marker pen</td><td>Stabilo</td><td>841/46</td><td>OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4 mm</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; pad</td><td>&amp;nbsp;Genesee Scientific</td><td>59-114 (789060 Dutscher)</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip No. 1.5, 22 x 50 mm</td><td>International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm</td><td>Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon oil, series 95</td><td>Halocarbon Products Corp.</td><td>Distributor in Europe:</td><td></td></tr><tr><td>Solvadis (GMBH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oil 10 S</td><td>VWR Chemicals</td><td>24627.188</td><td>Can be used instead of Halocarbon oil, series 95</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient.</td></tr><tr><td>Probe</td><td>Fine Science Tools</td><td>10140-01</td><td></td></tr><tr><td>Glass pipette</td><td>Fisherbrand,</td><td>FB50251</td><td>Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150 mm length&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vial</td><td>Regina Industries</td><td>P1014</td><td>GPPS&amp;nbsp; 80 mm x 25 mm</td></tr></tbody></table>

imaging calcium in drosophila at egg activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

ここでは、ex vivoでの活性化のために成熟したショウジョウバエの卵を準備する方法を実証しています。 GECIを発現している卵は、卵の活性化および胚発生の始まり（ 図1）でのCa 2+動態のイメージングを可能にします。ミリストイル基の存在は特に、使用GCaMPによって、結果がわずかに質的な違い13 14を有してもよいことに留意すべきである。我々はまた、アクチン重合の阻害剤を添加することによって卵の活性化の間の機能的アクチンの役割を実証しています、活性化緩衝液（ 図2）14サイトカラシンD、。 卵活性化における細胞骨格のための要件が​​保存されています。 C.でエレガンスは、受精後、細胞骨格の構成要素は、第一の非対称分裂21,22のための一細胞胚を作製するために再編成されています。ウニ​​、cytoskeleの破壊でTALの再編成次の活性化は、収縮環の形成23を防止することにより、細胞周期に影響を与えることが示されています。 ショウジョウバエの卵活性化時の Ca 2+波とその下流の機能を媒介する際のアクチンの役割は完全には解明されないままです。 ショウジョウバエでは、 の Ca 2+波とアクチン細胞骨格の同時可視化は、このエクスビボ活性化アッセイを用いて達成することができます。複数のチャンネルの時系列を取得することができ、細胞内Ca 2+の動態を、卵母細胞（ 図3）におけるアクチンの組織の変化に一致させることができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig1.jpg" /> 図1：ex vivoでのショウジョウバエの卵活性化時系列でのシングルの Ca 2+波は、a。次UASt- myrGCaMP5を表現する ショウジョウバエの卵を成熟します活性化緩衝液（AH）のddition。細胞質のCaの上昇は約1.5ミクロン/秒の平均速度で2+後極（B）に由来し、伝搬する（BF）。波の開始は、典型的には、活性化緩衝液の添加の3分以内に観察されます。活性化に続いて、成熟した卵の細胞内カルシウムレベルは、レベル（G、H）活性化の事前に戻ります。補足ムービー1（合計時間33分）を参照してください。スケールバー=50μmです。 =40μmの最大投影。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig2.jpg" /> 図2：アクティベーションバッファ摂動CAにサイトカラシンDの追加2+ ex vivoでの波動伝播。時系列を10μg/ mlのサイトカラシンDの最終濃度（AH）を含む活性化緩衝液を添加した後UASt- myrGCaMP5を表現する ショウジョウバエの卵を成熟します。 Ca 2+波は後極（A）で開始される一方で、それが危険にさらされていると卵（F）の前方に到達していない（白矢じりは、波の前面を表します）。それ以上の Ca 2+の変化）を30分間にわたって観察されませんでした。補足ムービー2（合計時間30分）を参照してください。スケールバー=50μmです。 =40μmの最大投影。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig3.jpg" /> 図3：EでのアクチンおよびCa 2+の同時可視化ショウジョウバエのGGのアクティベーションex vivoでの。時系列は、活性化バッファー（AH）の添加後UASt- myrGCaMP5（シアン）とUASP -F-Tractin.tdTomato（マゼンタ）を発現するショウジョウバエの卵を成熟します。 Ca 2+波は後極から開始し、 図1のように回復します。アクチンが白矢頭（H 対 A）、時間の経過とともに変化しているように見えます。成熟卵の中心での Ca 2+シグナルの検出の欠如は、画像キャプチャ中にサンプルの移動によるものです。スケールバー=50μmです。 =40μmの最大投影。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

この記事では、 ショウジョウバエの卵活性化の間のCa 2+を可視化するための適応性のex vivoでのプロトコルについて説明します。

内イメージングカルシウム<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵活性化で

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

7.8K ビュー.  University of Cambridge. この記事では、 ショウジョウバエの卵活性化の間のCa 2+を可視化するための適応性のex vivoでのプロトコルについて説明します。 

ビデオ: Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

のアップライトイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;エッグチェンバース

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

発生生物学

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

の臭気誘発応答のカルシウムイメージングショウジョウバエ触角葉

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

神経科学

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and apoptosis, development and ageing, to neuronal synaptic plasticity and regeneration have been associated with Ryanodine receptors (RyRs). Despite the importance of calcium signaling, the exact mechanism of its function in early development is unclear. As an organism with a short gestational period, the embryos of Drosophila melanogaster are prime study subjects for investigating the distribution and localization of CICR associated proteins and their regulators during development. However, because of their lipid-rich embryos and chitin-rich chorion, their utility is limited by the difficulty of mounting embryos on glass surfaces. In this work, we introduce a practical protocol that significantly enhances the attachment of Drosophila embryo onto slides and detail methods for successful histochemistry, immunohistochemistry, and in-situ hybridization. The chrome alum gelatin slide-coating method and embryo pre-embedding method dramatically increases the yield in studying Drosophila embryo protein and RNA expression. To demonstrate this approach, we studied DmFKBP12/Calstabin, a well-known regulator of RyR during early embryonic development of Drosophila melanogaster. We identified DmFKBP12 in as early as the syncytial blastoderm stage and report the dynamic expression pattern of DmFKBP12 during development: initially as an evenly distributed protein in the syncytial blastoderm, then preliminarily localizing to the basement layer of the cortex during cellular blastoderm, before distributing in the primitive neuronal and digestion architecture during the three-gem layer phase in early gastrulation. This distribution may explain the critical role RyR plays in the vital organ systems that originate in from these layers: the suboesophageal and supraesophageal ganglion, ventral nervous system, and musculoskeletal system.

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Here, we describe a protocol for detection and localization of Drosophila embryo protein and RNA from collection to pre-embedding and embedding, immunostaining, and mRNA in situ hybridization.

初期ショウジョウバエ胚における免疫組織化学およびRNAのその場分布のためのプロトコル

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

Tracking Calcium in the Early Developmental Phases of C. elegans

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode Caenorhabditis elegans provides several unique advantages for the study of the OET as it is transparent and has an ordered gonad that produces one mature oocyte every ~23 min at 20 &#176;C. We have modified the genetically encoded calcium indicator jGCaMP7s to fluorescently indicate the moment of fertilization within a living organism. We have termed this reporter &#34;CaFE&#34; for Calcium during Fertilization in C. elegans. The CaFE reporter was&#160;engineered into a safe harbor locus in single copy, has no significant impact on physiology or fecundity, and produces a robust signal upon fertilization. Here, a series of protocols is presented for utilizing the CaFE reporter as an in vivo tool for dissecting the OET and embryogenesis. We include methods to synchronize worms, examine the effects of RNAi knockdown, mount worms for imaging, and to visualize calcium in oocytes and embryos. Additionally, we present the generation of additional worm strains to aid in this type of analysis. Demonstrating the utility of the CaFE reporter to visualize the timing of fertilization, we report that double ovulation occurs when ipp-5 is targeted by RNAi and that only the first oocyte undergoes immediate fertilization. Furthermore, the discovery of single-cell calcium transients during early embryogenesis is reported here, demonstrating that the CaFE reporter persists into early development. Importantly, the CaFE reporter in worms is simple enough to use for incorporation into course-based undergraduate research (CURE) laboratory classes. The CaFE reporter, coupled with the ordered gonad and ease of RNAi in worms, facilitates inquiry into the cell-cell dynamics required to regulate internal fertilization and early embryogenesis.

Here, we present protocols and tools for visualizing calcium during fertilization and early embryogenesis using a genetically encoded calcium reporter expressed in the germline of the model nematode C. elegans.

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

Ex Vivoショウジョウバエにおける内分泌シグナル伝達する脳の反応を可視化するためのカルシウム イメージング

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

ショウジョウバエメラメラノガスターにおける学習誘発シナプス可塑性の生体内光学カルシウムイメージング

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

カルシウムイメージングによる ショウジョウバエ のてんかん様イベントのモニタリング

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals worldwide. Despite the clinical importance of epilepsy, the functional analysis of neural activity in the central nervous system is still to be developed. Recent advancements in imaging technology, in combination with stable expression of genetically encoded calcium indicators, such as GCaMP6, have revolutionized the study of epilepsy at both brain-wide and single-cell resolution levels. Drosophila melanogaster has emerged as a tool for investigating the molecular and cellular mechanisms underlying epilepsy due to its sophisticated molecular genetics and behavioral assays. In this study, we present a novel and efficient protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The whole brain is prepared from cac, a well-known epilepsy gene, knockdown flies for calcium imaging with a confocal microscope to identify the neural activity as a follow-up to the bang-sensitive seizure-like behavior assay. The cac knockdown flies showed a higher rate of seizure-like behavior and abnormal calcium activities, including more large spikes and fewer small spikes than wild-type flies. The calcium activities were correlated to seizure-like behavior. This methodology serves as an efficient methodology in screening the pathogenic genes for epilepsy and exploring the potential mechanism of epilepsy at the cellular level.

著者スポットライト:てんかん研究の最近の進歩の技術と調査結果への洞察 

Here, we present a protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The protocol provides a valuable tool for investigating ictal events in adult Drosophila through ex vivo calcium imaging, allowing for exploration of the potential mechanisms of epilepsy at the cellular levels.

Ex Vivo(エクス・ビボ )てんかんのショウ ジョウバエ モデルに対するカルシウムイメージング

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...

Calcium Imaging in Individual Neurons Regulating Egg-Laying Behavior in Caenorhabditis elegans

Source: Ravi, B. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/56911">Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates a technique for calcium imaging in individual neurons of behaving Caenorhabditis elegans using genetically encoded fluorescent reporter proteins. It outlines the steps involved in imaging worm movement and measuring reporter fluorescence ratios from neurons to correlate intracellular calcium levels with neuronal activity and behavioral changes during egg-laying.

1. Strains, Culture Media, and Mounting of Animals

	Grow&#160;C. elegans&#160;worms at 20 &#176;C on standard 60-mm Nematode Growth Medium (NGM) agar ...

内イメージングカルシウム

要約

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のアップライトイメージング

の臭気誘発応答のカルシウムイメージングショウジョウバエ触角葉

初期ショウジョウバエ胚における免疫組織化学およびRNAのその場分布のためのプロトコル

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Ex Vivoショウジョウバエにおける内分泌シグナル伝達する脳の反応を可視化するためのカルシウムイメージング

ショウジョウバエメラメラノガスターにおける学習誘発シナプス可塑性の生体内光学カルシウムイメージング

Ex Vivo(エクス・ビボ )てんかんのショウジョウバエモデルに対するカルシウムイメージング

Ex Vivo(エクス・ビボ )てんかんのショウジョウバエモデルに対するカルシウムイメージング

Ex Vivo(エクス・ビボ )てんかんのショウジョウバエモデルに対するカルシウムイメージング

Calcium Imaging in Individual Neurons Regulating Egg-Laying Behavior in Caenorhabditis elegans

内イメージングカルシウム

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初期ショウジョウバエ胚における免疫組織化学およびRNAのその場分布のためのプロトコル

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Ex Vivo(エクス・ビボ )てんかんのショウ ジョウバエ モデルに対するカルシウムイメージング

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Calcium Imaging in Individual Neurons Regulating Egg-Laying Behavior in Caenorhabditis elegans

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Ex Vivo(エクス・ビボ )てんかんのショウジョウバエモデルに対するカルシウムイメージング

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