Estamos muy agradecidos a Laura Bampton, Alex Davidson, Richard Parton, Arita Acharya de asistencia durante la preparación de este manuscrito; Mariana Wolfner para los debates sobre la activación del huevo; Matt Wayland para el apoyo de imágenes; y Nan Hu para apoyo general en el laboratorio. Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Cambridge, ISSF a TTW [número de concesión 097814].

Nota: Llevar a cabo todas las medidas a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario. 1. Preparación para la disección Nota: Los pasos descritos aquí están de acuerdo con E. Gavis, la Universidad de Princeton y Weil et al. al. 18. Realice los pasos siguientes dos días antes de la proyección de imagen. <ol><li> Tomar un vial mosca que contiene aproximadamente 10 ml de alimento sólido y añadir una pequeña cantidad de levadura seca a una esquina, a menos de 1 g es suficiente. Nota: Para obtener información acerca de los viales de moscas o comida ver &#39;Mantenimiento de Drosophila&#39; 19. </li><li> Añadir 1 - 3 gotas de agua para hidratar la levadura. </li><li> Dejar reposar el vial en un ángulo de 45 ° y permita 3 - 5 min para que la levadura para tomar el agua. </li><li> Mientras que la levadura está absorbiendo el agua, seleccionar una botella de moscas que expresan UASt- GCaMP5 myr 20 impulsado por bañera-VP16GAL4 (referido como GCaMP5) que han surgido recientemente (a myristoyRELAClONADAS forma de la GCaMP5 fue elegido para proporcionar una alta relación señal a ruido a través de la inmovilización del GECI a la membrana en el huevo). </li><li> Anestesiar las moscas en la botella con gas CO2. Asegúrese de mantener la botella invertida a fin de no perder las moscas en la comida húmeda. </li><li> Inclinar las moscas anestesiadas sobre un bloque de CO 2 y tipo 10 - 15 hembras y 5 machos utilizando un pincel con un microscopio de disección. Nota: Es estándar para incluir los machos para proporcionar hembras saludables para la disección. </li><li> Cuando el vial de la etapa 1.3 está listo, añadir las moscas seleccionados al vial. Tenga cuidado de mantener la horizontal vial hasta que las moscas se vuelven activos. </li><li> Coloque el vial a 25 ° C durante aproximadamente 36 horas. </li><li> Devolver los restantes moscas de la plataforma de CO 2 a la botella o descarte. </li></ol> 2. Disección de Drosophila ovarios Nota: Los pasos descritos aquí están de acuerdo con Weil et al. Alabama. <shasta&gt; 18. <ol><li> Después de 36 horas, anestesiar las moscas del vial yeasted con CO2. </li><li> Una vez que las moscas dentro del vial se anestesian propina en la almohadilla de CO 2 que ser resuelto con un cepillo de pintura con un microscopio de disección. </li><li> Seleccione una hembra. </li><li> Aislar los dos ovarios de la hembra. Para el protocolo completo y detallado ver Weil et al. al. 18. En resumen: <ol><li> Coloque una pequeña gota de aceite de hidrocarburo halogenado oxigenada (serie 95) en un 1,5 N, 22 x 40 mm cubreobjetos. </li><li> Agarrar a la hembra con unas pinzas en la parte anterior del abdomen. </li><li> Celebración de las mujeres bajo el microscopio de disección, utilice el segundo conjunto de pinzas para eliminar suavemente la parte posterior de la hembra. </li><li> Limpie el tejido posterior de la segunda pinza. </li><li> Estrújalo la cavidad abdomen con las segundas pinzas de la anterior a la posterior del abdomen. Los dos ovarios opacos deben atenerse a las pinzas cuando se encuentre fuera de la FEMALe. </li><li> Tocar los ovarios en el aceite. </li><li> Eliminar cualquier tejido de los fórceps frotando las pinzas. </li><li> Repita estos pasos (2.4.1 - 2.4.7) para obtener tres cubreobjetos, cada uno de los ovarios que contienen de una mosca. </li></ol></li></ol> 3. Aislamiento de óvulos maduros individual <ol><li> Bajo un microscopio de disección estándar con la ampliación fijado a 4X, en el primer cubreobjetos desde el paso 2.4, separar los dos ovarios rasgando el oviducto. </li><li> Introducir un par de pinzas cerradas en el centro de un solo ovario, teniendo cuidado de no perforar ningún cámaras de huevos. </li><li> Inserte una sonda de disección estándar en el centro del ovario al lado de las pinzas cerradas. </li><li> arrastrar suavemente la sonda de disección a través del ovario hacia el polo posterior, donde se encuentran los óvulos maduros (etapa 14 cámaras de huevos). </li><li> Repetir los pasos 3.1 - 3.4 2-5 veces dependiendo del tamaño del ovario y el número de huevos. Nota: La adición de CO 2 </sub&gt; típicamente causa la deposición de un solo huevo que aparecerá más grande con apéndices dorsales planteadas que los huevos depositados previamente. Este huevo debe ser desechada para la imagen, puesto que ya se ha activado dentro de la hembra. Nota: los huevos maduros son propensos a separarse fácilmente del tejido conectivo del ovario. </li><li> Si no hay óvulos maduros son visibles fuera del ovario, continuará burlas con la sonda de disección con suavidad. </li><li> Una vez que los huevos maduros son visibles en el cubreobjetos fuera del ovario, maniobrar 3-5 en una línea en el centro del cubreobjetos. Nota: Para obtener los mejores resultados, ejecute la sonda suavemente a lo largo del lado de los huevos. Nota: Evite tirar de los apéndices dorsales ya que esto puede dañar el huevo. Nota: Dependiendo de la imagen futura creación, alinear los huevos de aproximadamente 200 micras aparte perpendicular a la cubreobjetos de área máxima de imagen. </li><li> Una vez alineado, eliminar el resto del tejido ovárico arrastrándolo fuera de los huevos alineados utilizando el forceps. </li><li> Eliminar el exceso de aceite frotando con la esquina de una toallita médica. Tenga cuidado de no tocar los huevos maduros con el médico toallita huevos maduros que están en contacto se perderán. </li><li> Dibuje una cruz sobre el cubreobjetos con un marcador para simplificar la localización de la muestra bajo el microscopio. </li><li> Ajuste el cubreobjetos en un lugar seguro y dejar las cámaras de huevos preparados en el cubreobjetos para descansar durante 5 - 10 minutos a. Esto permite que el huevo se asiente en el aceite. Las muestras se pueden utilizar hasta 1 hora después de la disección. </li><li> Repetir los pasos 3.1 hasta 3.11 para el resto de los cubreobjetos con ovarios en ellos. </li></ol> 4. Preparación de la Imagen <ol><li> Llevar tampón de activación preparado 15 a temperatura ambiente. Nota: tampón de activación es un tampón hipotónico: 3,3 mM NaH 2 PO 4, 16.6 mM KH 2 PO 4, NaCl 10 mM, KCl 50 mM, 5% de polietilenglicol 8000, 2 mM CaCl 2, se llevó a pH 6,4 con una 1: relación de 5 de NaOH: KOH.Para obtener más información, véase Mahowald de 1983 15. Alícuotas de tampón de activación se pueden almacenar a -20 ° C durante meses y a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas. </li><li> transportar cuidadosamente preparados, cubreobjetos tampón de activación y pipetas de vidrio para la instalación de imágenes. Nota: Un campo amplio, confocal, disco giratorio o un microscopio de lámina de luz se pueden utilizar. Recomendamos el uso de un microscopio invertido. Nuestros resultados representativos se obtuvieron usando un microscopio confocal. </li><li> Un objetivo adecuado para obtener imágenes de todo el óvulo maduro debe ser elegido (en este caso: 20X 0,7 NA). </li><li> Montar la primera cubreobjetos preparado a la platina del microscopio. Tenga cuidado de no romper los cubreobjetos en el escenario. </li><li> Cualitativamente seleccionar un campo de visión con una cámara de huevos maduros para la activación. Imagen No pinchado cámaras de huevos o aquellos con formación de vesículas en la membrana. Nota: Para ver los pasos 4.6 - 4.7, los comandos de software variarán dependiendo de microscopio y el fabricante. </li><li> Conjunto de imágenes párrafometros para la excitación estándar GFP (488 nm) y emisión (500 - 580 nm). También configurar una vista de campo brillante con el fin de visualizar y orientar el óvulo maduro y aceite desplazado. </li><li> Seleccione el más bajo de Z-plano en el que los óvulos maduros son visibles y establecer un Z-pila completa que se aplicará a 40 micras, con aproximadamente 2 micras por paso. Establecer los parámetros de lo que no hay retraso entre la adquisición de Z-pila. Establecer las series de tiempo para capturar durante aproximadamente 30 min. </li></ol> La activación ex vivo de imágenes 5. Huevo <ol><li> Iniciar la captura de imágenes. </li><li> Espere a 1 - 2 completos Z-pilas para ser adquiridos. Esto muestra el óvulo maduro antes de la activación. </li><li> Retirar aproximadamente 300 l de tampón de activación en una pipeta de vidrio. </li><li> Colocación de la punta de la pipeta de vidrio que contiene tampón de activación en un ángulo de 45 ° por encima del cubreobjetos, mueva lentamente la pipeta en la trayectoria del haz hasta que está directamente encima del óvulo maduro está formando la imagen. La pipeta de vidrio debeser de 1 - 2 cm por encima del petróleo. </li><li> Añadir 1 - 2 gotas de tampón de activación en menos de 5 segundos desde la pipeta de vidrio. Esto debería desplazar el aceite. Evitar la adición de exceso de tampón de activación o tocar el huevo con la pipeta de vidrio, ya que puede causar el desplazamiento del óvulo maduro. Tenga cuidado de no tocar el cubreobjetos con la pipeta ya que esto puede causar un cambio en el plano focal o burbujas de aire para formar en el aceite de inmersión entre el objetivo y el cubreobjetos. </li><li> Mientras que la adición de tampón de activación durante la adquisición de imagen, compruebe el canal de campo brillante para asegurar que el aceite ha sido desplazado por el tampón de activación. Nota: Esto primera aparecer como una sombra debido a la pipeta romper la trayectoria del haz, pero también dará lugar a la aparición de pequeñas gotitas de aceite. Algunas gotas de aceite pueden permanecer asociado con el óvulo maduro que afectará a los resultados experimentales y calidad de imagen. </li><li> Si el aceite no se desplaza de la adición inicial de repetición de tampón de activación pasos 5,4-50.6. </li><li> Una vez que el aceite se desplaza con éxito, permitirá a las series de tiempo hasta su finalización. Nota: Debido a la hinchazón de los ovocitos en la activación, algunas cámaras de huevos se moverán de manera espectacular fuera del plano focal o campo de visión después de la adición de tampón de activación. En esta situación, detener la adquisición y montar la siguiente cubreobjetos. </li><li> Después de la secuencia de imágenes se ha completado la adquisición, guardar los datos. </li></ol> 6. posteriores a la adquisición de Procesamiento de Imágenes <ol><li> Abra el conjunto de datos utilizando Fiji (http://fiji.sc/Downloads#Fiji), o el software de procesamiento de imágenes equivalentes, y seleccione los archivos relevantes para el análisis. </li><li> Para construir una proyección de los datos adquiridos seleccionar: Imagen&gt; Pilas&gt; Z-proyecto. </li><li> Seleccionar un comienzo Z-rebanada y una parada de Z-rebanada, por lo general toda la sección. Seleccione un tipo de proyección, usualmente la &#39;Max Intensidad&#39;. Compruebe casilla &#39;Todo Marcos de tiempo&#39; para aplicar los ajustes seleccionados para toda la serie. </li><li> Simás de un canal de fluorescencia ha sido fotografiado, utilice la herramienta de canales para permitir el movimiento entre los colores, hacer un compuesto, o hacer que la escala de grises de la imagen. Seleccionar Imagen&gt; Colores&gt; herramienta de Canales. </li><li> Para ajustar el brillo de la imagen y contraste seleccione Imagen&gt; Ajustar&gt; Brillo / Contraste. </li><li> Para exportar una sola imagen, mover cursor escala de tiempo de fotograma correspondiente y seleccione Archivo&gt; Guardar como&gt; JPEG, o cualquier formato preferido. </li><li> Seleccione una ubicación y título para el archivo exportado, a continuación, guardar. Nota La velocidad de fotogramas del software de imágenes será requerido para dar una indicación de la hora en la imagen. </li><li> Para exportar la serie de tiempo como una película, seleccione: Archivo&gt; Guardar como&gt; AVI, a continuación, seleccione la velocidad de fotogramas (~ 7 fotogramas por segundo). </li><li> Seleccione una ubicación y título para el archivo exportado, a continuación, guardar. </li><li> Para guardar el archivo en formato ajustado Fiji, seleccione Archivo&gt; Guardar. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

The first critical step in this protocol is isolating the mature eggs without damage. This can be achieved by gentile maneuvering of the eggs with the dissecting probe. Practice will enable this manipulation to be executed without damage to the eggs. A second crucial step is avoiding the loss of the sample when activation buffer is applied to the mature egg in oil. Application of the activation buffer should be done slowly and without contact with the coverslip. This step can be challenging if the microscope set-up does not allow for an easy access to the sample. Moving axillary parts of the microscope, such as a temperature incubator, is advisable. 
Modifications to this protocol can be made in order to visualize other fluorescently tagged factors, instead of Ca2+ at egg activation. More generally, different stages of Drosophila development or the results of adding a different buffer could be analyzed using this protocol. 
Troubleshooting may be required if the settings on the microscope are not optimal for visualizing the signal from the sample. This can be achieved by increasing or decreasing the laser power, altering capture range and adjusting the Z-stack parameters. Another issue might be eggs consistently moving out of the field of view upon the addition of activation buffer. If this happens regularly, allow the mature eggs to settle on the coverslips for a longer period of time, 15 to 20 minutes. Beware that using a higher viscosity oil will alter the displacement of the oil by activation buffer. 
This technique presented here is limited by the working distance of the objective, dehydration of the mature eggs and the ability to dissect the mature eggs without damage. However, when compared to in vivo imaging methods where the mature oocyte passes through the adult female and is deposited 13, our method enables more spatial resolution, the option to physically manipulate the mature egg before activation and the ability to test the role of egg activation without fertilization. 
There are many potential future applications of this technique, including testing reporter constructs for cellular components at egg activation and visualizing the Ca2+ wave in mutant backgrounds 14,24. Together with experimental and genetic tools, the ex vivo egg activation assay presented here enables the study of the trigger, propagation and downstream effects of the universally conserved Ca2+ wave.

Un cambio en el Ca intracelular 2 + concentración en la activación del huevo (ovocito) es un componente conservado de todos los organismos estudiados 1,2. Este evento inicia una amplia gama de procesos dependientes de Ca2 +, incluyendo la reanudación del ciclo celular y la traducción de mRNAs almacenados. Debido a esta necesidad de Ca2 +, la visualización de los cambios transitorios en las concentraciones intracelulares de Ca2 + ha sido de gran interés. Históricamente, se seleccionaron los organismos modelo para los estudios sobre la activación del huevo en función del tamaño y la disponibilidad de sus huevos. Diversos enfoques de visualización se han utilizado para seguir y cuantificar los cambios en intracelular de Ca 2 + concentraciones en estos sistemas, entre ellos: la aequorina fotoproteína en peces medaka 3; Ca 2+ tintes fluorescentes sensibles como la Fura-2 en el erizo de mar y el hámster 4,5; y calcio verde-1-dextrano en Xenopus 6. La generación y mejora de los indicadores de calcio codificados genéticamente (Gecis) ha transformado la capacidad de visualizar Ca 2+ dinámica in vivo 7. Estas construcciones genéticas se expresan en tejidos específicos y limitan la necesidad de preparaciones de tejidos invasivos 8. GCaMPs son una proteína fluorescente (GFP) con base en la clase verde de Gecis que han sido muy eficaces debido a su alta afinidad de Ca2 +, y la capacidad de relación señal-ruido para ser personalizadas 9-11. En presencia de Ca2 +, el complejo GCaMP sufre una serie de cambios de conformación, a partir de la unión de Ca2 + a la calmodulina, que resulta en un aumento de la intensidad de fluorescencia del componente GFP 9. GCaMPs se han utilizado ampliamente en la investigación sobre las neuronas de Drosophila para visualizar cambios en el calcio intracelular 12. Los últimos applicatien GCaMP de la tecnología para la visualización de Ca2 + en los huevos maduros de Drosophila ha revelado un solo transitoria 2+ onda de CA en la activación del huevo 13,14. La ola de Ca2 + puede ser visualizado a bajo aumento durante la ovulación in vivo 13 o con mayor ampliación usando un ensayo de activación ex vivo 13,14. En el ensayo ex vivo, los oocitos maduros individuales están aisladas de los ovarios y se activan utilizando una solución hipotónica, referidos como tampón de activación, que se ha demostrado para recapitular los acontecimientos de la activación in vivo 15-17. Este ensayo ex vivo permite la fácil alta resolución de visualización de la onda 2 + Ca bajo diferentes condiciones experimentales incluyendo la interrupción farmacológica, manipulaciones físicas y mutantes genéticos. Este artículo demuestra la preparación de huevos maduros de Drosophila para la activación ex vivo e ªe microscopía posterior se utiliza para visualizar la onda de Ca 2+ usando GCaMP. Este enfoque puede ser utilizado para probar la iniciación y el control de la onda de Ca2 + y de sondear los resultados de aguas abajo.

<table><tbody><tr><td>Dry active yeast</td><td>Fleischman&amp;rsquo;s</td><td>#2192</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>Various will work</td></tr><tr><td>Lamp</td><td>Mircotec Fibre optic</td><td>MF0-90</td><td>Various will work</td></tr><tr><td>Medical wipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>KLEW3020&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marker pen</td><td>Stabilo</td><td>841/46</td><td>OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4 mm</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; pad</td><td>&amp;nbsp;Genesee Scientific</td><td>59-114 (789060 Dutscher)</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip No. 1.5, 22 x 50 mm</td><td>International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm</td><td>Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon oil, series 95</td><td>Halocarbon Products Corp.</td><td>Distributor in Europe:</td><td></td></tr><tr><td>Solvadis (GMBH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oil 10 S</td><td>VWR Chemicals</td><td>24627.188</td><td>Can be used instead of Halocarbon oil, series 95</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient.</td></tr><tr><td>Probe</td><td>Fine Science Tools</td><td>10140-01</td><td></td></tr><tr><td>Glass pipette</td><td>Fisherbrand,</td><td>FB50251</td><td>Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150 mm length&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vial</td><td>Regina Industries</td><td>P1014</td><td>GPPS&amp;nbsp; 80 mm x 25 mm</td></tr></tbody></table>

imaging calcium in drosophila at egg activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Aquí hemos demostrado cómo preparar los huevos maduros de Drosophila para la activación ex vivo. Los huevos que expresan un GECI permitir imágenes de Ca 2+ en la dinámica de la activación del huevo y el inicio del desarrollo embrionario (Figura 1). Debe tenerse en cuenta que dependiendo de la GCaMP utilizado, específicamente la presencia de un grupo miristoilo, los resultados pueden tener ligeras diferencias cualitativas 13 14. También hemos demostrado un papel para la actina funcional durante la activación del huevo por la adición de un inhibidor de la polimerización de actina, citocalasina D, al tampón de activación (figura 2) 14. Un requisito para el citoesqueleto a la activación del huevo se conserva. En C. elegans, después de la fertilización, los componentes del citoesqueleto se reorganiza para preparar el embrión de una célula de la primera división asimétrica 21,22. En el erizo de mar, la alteración de cytoskeleTal re-organización después de la activación se ha demostrado que afecta el ciclo celular mediante la prevención de la formación del anillo contráctil 23. El papel de la actina en la mediación de una ola de Ca2 + y su función en la activación del huevo aguas abajo en Drosophila aún no se ha aclarado completamente. En Drosophila, co-visualización del Ca 2+ onda y del citoesqueleto de actina se puede conseguir utilizando este ensayo de activación ex vivo. Series de tiempo de múltiples canales puede ser adquirida y la dinámica del Ca2 + intracelular se puede emparejar con cambios en la organización de la actina en el ovocito (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig1.jpg" /> Figura 1:. A Single Ca 2+ onda en serie Drosophila huevo Tiempo de activación de la ex vivo maduro Drosophila huevo expresar UASt- myrGCaMP5 después de la unaddition de tampón de activación (AH). El aumento de Ca 2+ citoplasmático se origina en el polo posterior (B) y se propaga (BF) con una velocidad media de aproximadamente 1,5 micras / seg. Iniciación de la onda se observa típicamente dentro de 3 min de la adición de tampón de activación. Después de la activación, los niveles de calcio intracelulares del óvulo maduro vuelve a los niveles (G, H) de activación pre. Ver película suplementario 1 (tiempo total de 33 min). Barras de escala = 50 m. Proyección max = 40 micras. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig2.jpg" /> Figura 2: La adición de citocalasina D para la activación del búfer perturba Ca2+ propagación de las ondas. Series de tiempo de madurar ex vivo Drosophila huevo expresar UASt- myrGCaMP5 tras la adición de tampón de activación que contiene 10 mg / ml de citocalasina D concentración final (AH). Mientras que la onda de Ca2 + se inicia en el polo posterior (A), se ve comprometida y no llega a la parte anterior del huevo (F) (puntas de flecha en blanco denotan la parte delantera de la ola). No se observaron más cambios Ca 2+ durante 30 min). Ver película suplementario 2 (tiempo total de 30 minutos). Barras de escala = 50 m. Proyección max = 40 micras. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig3.jpg" /> Figura 3: Co-visualización de actina y Ca 2+ en ELa activación gg en serie de Drosophila. Tiempo de madurar ex vivo Drosophila huevo expresar UASt- myrGCaMP5 (Cian) y UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) tras la adición de tampón de activación (AH). La 2+ onda Ca inicia desde el polo posterior y se recupera como en la Figura 1. Actina parece estar cambiando con el tiempo, las puntas de flecha blanca (A vs H). La falta de detección de la señal de Ca2 + en el centro del huevo maduro es debido al movimiento de la muestra durante la captura de imagen. Barras de escala = 50 m. Proyección max = 40 micras. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Este artículo describe un protocolo adaptable ex vivo para la visualización de Ca 2+ durante la activación del huevo en Drosophila.

El calcio de imágenes en<em&gt; Drosophila</em&gt; En la activación del huevo

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

7.8K vistas.  University of Cambridge.  Este artículo describe un protocolo adaptable ex vivo para la visualización de Ca 2+ durante la activación del huevo en Drosophila. 

Video: Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Imaging Upright de<em&gt; Drosophila</em&gt; Cámaras de huevo

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

El calcio de la imagen del olor de respuestas evocadas en el Drosophila Lóbulo antenal

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Neurociencias

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and apoptosis, development and ageing, to neuronal synaptic plasticity and regeneration have been associated with Ryanodine receptors (RyRs). Despite the importance of calcium signaling, the exact mechanism of its function in early development is unclear. As an organism with a short gestational period, the embryos of Drosophila melanogaster are prime study subjects for investigating the distribution and localization of CICR associated proteins and their regulators during development. However, because of their lipid-rich embryos and chitin-rich chorion, their utility is limited by the difficulty of mounting embryos on glass surfaces. In this work, we introduce a practical protocol that significantly enhances the attachment of Drosophila embryo onto slides and detail methods for successful histochemistry, immunohistochemistry, and in-situ hybridization. The chrome alum gelatin slide-coating method and embryo pre-embedding method dramatically increases the yield in studying Drosophila embryo protein and RNA expression. To demonstrate this approach, we studied DmFKBP12/Calstabin, a well-known regulator of RyR during early embryonic development of Drosophila melanogaster. We identified DmFKBP12 in as early as the syncytial blastoderm stage and report the dynamic expression pattern of DmFKBP12 during development: initially as an evenly distributed protein in the syncytial blastoderm, then preliminarily localizing to the basement layer of the cortex during cellular blastoderm, before distributing in the primitive neuronal and digestion architecture during the three-gem layer phase in early gastrulation. This distribution may explain the critical role RyR plays in the vital organ systems that originate in from these layers: the suboesophageal and supraesophageal ganglion, ventral nervous system, and musculoskeletal system.

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Here, we describe a protocol for detection and localization of Drosophila embryo protein and RNA from collection to pre-embedding and embedding, immunostaining, and mRNA in situ hybridization.

Un protocolo para la inmunohistoquímica y la distribución in situ de ARN dentro del embrión temprano de Drosophila

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

<meta charset="utf8"></head><body>Seguimiento del calcio en las primeras fases de desarrollo de C. elegans

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode Caenorhabditis elegans provides several unique advantages for the study of the OET as it is transparent and has an ordered gonad that produces one mature oocyte every ~23 min at 20 &#176;C. We have modified the genetically encoded calcium indicator jGCaMP7s to fluorescently indicate the moment of fertilization within a living organism. We have termed this reporter &#34;CaFE&#34; for Calcium during Fertilization in C. elegans. The CaFE reporter was&#160;engineered into a safe harbor locus in single copy, has no significant impact on physiology or fecundity, and produces a robust signal upon fertilization. Here, a series of protocols is presented for utilizing the CaFE reporter as an in vivo tool for dissecting the OET and embryogenesis. We include methods to synchronize worms, examine the effects of RNAi knockdown, mount worms for imaging, and to visualize calcium in oocytes and embryos. Additionally, we present the generation of additional worm strains to aid in this type of analysis. Demonstrating the utility of the CaFE reporter to visualize the timing of fertilization, we report that double ovulation occurs when ipp-5 is targeted by RNAi and that only the first oocyte undergoes immediate fertilization. Furthermore, the discovery of single-cell calcium transients during early embryogenesis is reported here, demonstrating that the CaFE reporter persists into early development. Importantly, the CaFE reporter in worms is simple enough to use for incorporation into course-based undergraduate research (CURE) laboratory classes. The CaFE reporter, coupled with the ordered gonad and ease of RNAi in worms, facilitates inquiry into the cell-cell dynamics required to regulate internal fertilization and early embryogenesis.

<meta charset="utf8"></head><body>Visualización in vivo de transitorios de calcio durante la fertilización y el desarrollo temprano en C. elegans

Here, we present protocols and tools for visualizing calcium during fertilization and early embryogenesis using a genetically encoded calcium reporter expressed in the germline of the model nematode C. elegans.

Visualización in vivo de transitorios de calcio durante la fertilización y el desarrollo temprano en C. elegans

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

Ex Vivo Proyección de imagen de calcio para la visualización de las respuestas cerebrales a la señalización endocrina en Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Monitoreo de eventos epileptiformes en Drosophila a través de imágenes de calcio

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals worldwide. Despite the clinical importance of epilepsy, the functional analysis of neural activity in the central nervous system is still to be developed. Recent advancements in imaging technology, in combination with stable expression of genetically encoded calcium indicators, such as GCaMP6, have revolutionized the study of epilepsy at both brain-wide and single-cell resolution levels. Drosophila melanogaster has emerged as a tool for investigating the molecular and cellular mechanisms underlying epilepsy due to its sophisticated molecular genetics and behavioral assays. In this study, we present a novel and efficient protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The whole brain is prepared from cac, a well-known epilepsy gene, knockdown flies for calcium imaging with a confocal microscope to identify the neural activity as a follow-up to the bang-sensitive seizure-like behavior assay. The cac knockdown flies showed a higher rate of seizure-like behavior and abnormal calcium activities, including more large spikes and fewer small spikes than wild-type flies. The calcium activities were correlated to seizure-like behavior. This methodology serves as an efficient methodology in screening the pathogenic genes for epilepsy and exploring the potential mechanism of epilepsy at the cellular level.

Autor destacado: Perspectivas sobre las técnicas y los hallazgos de los avances recientes en la investigación de la epilepsia 

Here, we present a protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The protocol provides a valuable tool for investigating ictal events in adult Drosophila through ex vivo calcium imaging, allowing for exploration of the potential mechanisms of epilepsy at the cellular levels.

Ex Vivo Imágenes de calcio para el modelo de epilepsia de Drosophila

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...

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Resumen

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Visualización in vivo de transitorios de calcio durante la fertilización y el desarrollo temprano en C. elegans

Visualización in vivo de transitorios de calcio durante la fertilización y el desarrollo temprano en C. elegans

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Ex Vivo Proyección de imagen de calcio para la visualización de las respuestas cerebrales a la señalización endocrina en Drosophila

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Ex Vivo Imágenes de calcio para el modelo de epilepsia de Drosophila

Ex Vivo Imágenes de calcio para el modelo de epilepsia de Drosophila