This work was supported by NIDDK grants DK098143 and DK101530 from the NIH (JPA), Stanford's Spectrum Child Health Research Institute (CHRI) and SPARK (UL1 TR001085, JPA).

このプロトコルは、スタンフォード大学医学部の施設内動物管理使用委員会（IACUC）に準じて行きました。膵島細胞複製の評価のための384ウェルプレートのウェル228を生成するのに十分である - （9週齢8）雄性Sprague Dawleyラット300 - Gに記載のプロトコルは、6つの250からの膵島単離のためにスケーリングされます。 1.材料の準備<ol><li> 15cmの組織培養皿28に3日間前にコンフルエントに維持804Gラット膀胱癌細胞の馴化培地を収集することによって、膵島の分離を開始する（RPMI1640 20 ml）をコーティング媒体を準備します。滅菌フィルターとストア（-20℃）後の使用のために馴化培地。 </li><li>手術器具を滅菌する（1 12センチメートル歯状の組織鉗子、1 11.5センチメートル細かいハサミ、1 14.5センチメートル手術用はさみ、2 16センチメートルの湾曲鉗子、1 12センチメートル湾曲した止血剤、1〜12センチメスハンドル）とinitの前に1 30メッシュの組織ふるいです膵島単離をiating。 </li><li> 60％を溶解することによって、膵臓消化溶液を準備し、精製クラスIの40％混合物：クラスIIコラゲナーゼ（300,000総コラゲナーゼ活性- 40万台）をカルシウムおよびマグネシウムを補充した1×ハンクス平衡塩溶液（HBSS）60ml中。氷上で1「22 G針と場所で10mlシリンジ（6）への膵臓消化バッファーの負荷10ミリリットル。 注：消化溶液の10mlを、ラットあたりに噴射されます。それに応じてスケール。 </li><li>ケタミンの1.3ミリリットル（100 mg / mlで）、キシラジンの0.2ミリリットル（100 mg / mlで）およびPBSの3ミリリットルを混合することにより、換気フード内で麻酔薬カクテルの4.5ミリリットルを準備します。膵島単離を開始する1時間以内に麻酔薬カクテルを準備します。 </li><li> HBSSの500ミリリットルに新生仔ウシ血清の25ミリリットルを追加することで、 洗浄バッファーを準備します。後で使用するために氷の上に洗浄バッファーを置きます。 </li><li>低グルコースのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、5の500ミリリットルである膵島媒体の1瓶を準備0 mlのウシ胎児血清（FBS）、ペニシリンの5,000単位/ ml及びストレプトマイシンの5,000μgの/ mlです。 </li><li> 2％FBS、2mMグルタミン、ペニシリンの5 mMグルコース、5000単位/ mlおよびストレプトマイシンの5,000μgの/ mlの機能/生存性溶液（500ミリリットル）から膵島機能媒体を準備します。後で使用するために膵島機能メディア （4℃）で保管してください。 </li><li> 1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）のミリリットル37.38 2.5 mLのロバ血清0.12 mLのトリトンX-100を添加することによって、ブロッキング緩衝液40ミリリットルを準備します。後で使用するためにストアブロッキングバッファー（4℃）。 </li><li>プロトコルを開始する前に必要な抗体を得ます。 注：PDX-1（TRITC）およびKi-67（FITC）の共染色は、一次β細胞複製のスクリーニングのために使用されます。 PDX（Cy5の）およびKi-67（FITC）染色、核（DAPI）と一緒に、追加のセルアイデンティティマーカー（TRITCインスリン、グルカゴン、ビメンチンまたはソマトスタチン）のための免疫蛍光染色を行い、系統特異的複製分析のため。代替担当者licationマーカー、 例えば 、PCNAは、使用してもよいです。 </li><li>四重に行われる各処理条件で228ウェルの治療計画を準備します。 （：666希釈DMSO 1）をウェルポジティブ（5-ヨードツベルシジン[1μM]またはジピリダモール[15μM]）および車両制御が含まれます。 </li></ol>膵臓の2灌流<ol><li>希釈された麻酔薬カクテル溶液（0.30ミリリットル/ 100g体重）の腹腔内注射によって、ラットを麻酔。ラットが完全に麻酔をかけ、有害な刺激に応答しなくなったら、頸椎脱臼を行います。 </li><li>ペーパータオルのスタック上に仰臥位（頭尾の向き）に安楽死させたラットを置き、70％エタノールで腹部をスプレー。 </li><li> U-切開（陰部の塩基）と腹腔を開き、腹腔を露出するように胸の上に吻側方向に皮膚を撤回。 </li><li>慎重に、湾曲した鉗子の2ペアを使用して十二指腸をつかむ共通Bの十二指腸エントリを見つけますイルダクト（オッディの括約筋）とは、湾曲した止血剤と乳頭で十二指腸開口部をクランプします。 </li><li>総胆管乳頭をクランプし、湾曲した鉗子を使用して肝臓に近い胆管をつかむために使用される湾曲した止血剤を持ち上げます。胆管を分離し、公開するために、湾曲鉗子で鈍的切開を使用してください。 </li><li>ヘッド近位と足の先端でラットを再配置します。 </li><li> 膵臓の消化液で嚢胞と共通の肝管の接合部に総胆管（CBD）で、またはちょうど遠位にカニューレを挿入10ミリリットル注射器を-loaded、ゆっくりと膵臓の消化溶液の10ミリリットルを注入。注入しながら、メスハンドルにCBDをサポートしています。ダクトと膵臓は膨らまに失敗した場合、針の位置を変更します。 </li><li>下行結腸、腸、胃と脾臓からそれを分離するために、湾曲鉗子と細かいハサミを使用して膨張した膵臓を削除します。 5 mlを含む50mlチューブ中で、氷上で膨張した膵臓を置き<eメートル&gt;膵臓消化溶液。 注：最大膵島収量については、各50ミリリットルの消化管で30分と場所のみ1または2の膵臓内のすべての膵臓を集めます。 </li></ol>膵臓の3解離<ol><li>いったんすべて膵臓が採取され、15分間37℃の水浴中に消化管を置きます。静かにチューブを3分毎に渦巻きます。 </li><li> 15分後、精力的にチューブを（垂直方向）を10回振ると冷 ​​洗浄緩衝液 10mlを追加します。精力的にチューブをさらに5回振って、氷上に置きます。 </li><li>冷洗浄緩衝液で50mlに消化管を記入し、チューブを5回転倒混和します。 </li><li> 4℃で1分間97×gでチューブを遠心し、上清を捨てます。ペレット化した組織を落とさないように注意してください。 </li><li> 25ミリリットルの洗浄緩衝液を加え、穏やかにボルテックスして組織を再懸濁。繰り返しをさらに2回3.4と3.5を繰り返します。 </li><li>目の上に30メッシュの組織ふるいを置きerile 250ミリリットルのビーカーとふるい上に組織懸濁液を注ぎます。 洗浄バッファーの追加の20ミリリットルでの消化管を洗浄し、メッシュの上に注ぎます。未消化膵臓および脂肪組織は、この段階で除去されます。 </li><li> 2新鮮な50mlチューブ中に濾過材を注ぎ、4℃で1分間、97×gで回転させて組織をペレット。上清をデカントし反転チューブは、過剰なバッファを排出します。 </li></ol>島の4精製<ol><li>ペレット化した膵臓組織に冷たいポリス/ジアトリゾ酸ナトリウム溶液20ml（1.119グラム/ mlの濃度）を追加します。均一にそっとピペットで5回上下各管の内容物を再懸濁。 </li><li>静かに10ミリリットルのHBSSとポリス/ジアトリゾ酸ナトリウム水溶液を重ねます。ゆっくり管壁に沿ってHBSSを追加することで、シャープな液体界面を維持します。 </li><li>緩加速とブレーキなしで15分間（4℃）560×gで消化された膵臓を遠心。 </li><li>共同10ミリリットルのピペットを使用して、インターフェイスからの膵島層llect、新鮮な50mlチューブに島を置きます。この段階で島をプールしないでください。 </li><li> 4℃で140×gで1分間、各50mlチューブやスピンに洗浄緩衝液の40ミリリットルを追加します。 </li><li>上清を捨て、チューブを数回反転させて、洗浄緩衝液 50ml中のプールされた膵島を再懸濁します。ペレット中に膵島を収集するために、4℃で97×gで1分間チューブを遠心します。 </li><li> 洗浄緩衝液を捨て、洗浄を繰り返します。組織培養フードの中に島を持参し、上清を吸引除去します。 </li><li> 膵島培地 6ml中膵島の各チューブを再懸濁します。 </li><li> 6ウェル組織培養皿のウェルに各50ミリリットルチューブから膵島を転送します。ウェルの中央に島を収集し、顕微鏡下で膵島の品質と純度を観察するために6ウェルディッシュを渦巻。 </li><li>手動で1ミリリットルピペットを用いて膵島を収集し、隣接に選ばれた膵島を転送よく膵島メディアの6ミリリットルを含みます。膵島旋回を繰り返し、&gt; 90％の純度が達成されるまで、ピッキング。 </li><li> 膵島培地 20mlを含む10cmの組織培養皿に精製された膵島を転送します。 </li><li>組織培養インキュベーターに入れ島（37℃、5％CO 2）で一晩（ 図1A）。 </li><li>膵島細胞、コートウェル当たり804G馴化培地40μlの384ウェルプレートのウェルを、めっきの製造において。組織培養インキュベーター中で一晩インキュベートします。 </li></ol> 5.分散および膵島細胞のメッキ<ol><li>次の日は、静かに、セルスクレーパーで10cmの皿から膵島を切り離し、50ミリリットルチューブに膵島を移します。 </li><li>室温で22×gで1分間遠心分離することにより、島をペレット。上清を吸引除去します。 </li><li>温かいPBS 20mlで膵島を洗浄し、上記のようにデカント。 </li><li> 0.25％トリプシンで膵島（ラット膵臓あたり150μLを再サスペンド）と37℃で10分間インキュベートします。ピペットアップ膵島ダウン10時間インキュベーションの5および10分後、1 mlピペットを用いて。 </li><li> 10分後、完全な消化を保証し、血球計数器を使用して、膵島細胞をカウントするために顕微鏡下でトリプシン処理した膵島の20μlのサンプルを評価します。 5分であり、ピペットを上下に10回以上 - 未消化の島が残っている場合は、追加の3のためのインキュベーションを続けます。必要に応じて繰り返します。 注：典型的な収量は〜125,000である - ラット15万膵島細胞。 </li><li>インキュベーターから804G馴化培地でコーティングされた384ウェルプレートを取り外し、12ウェルマニホールドアスピレーターを使用してメディアを削除します。 </li><li> 膵島機能培地 1ml当たり45,000細胞の密度で膵島細胞を懸濁し、マルチチャンネルピ ​​ペット（図1B）でウェルあたり70μL（3150細胞）をプレート。 注：外側のウェルに位置するβ細胞がNと列にプレート使用行Cの周囲に向かって移動する傾向があるので46匹のラットから単離した膵島細胞を228ウェルプレートに21に。 </li><li>細胞接着を可能にするために、48時間組織培養インキュベーター中でプレートを置き。 </li></ol> 6.膵島細胞培養処理、固定および染色<ol><li> 膵島機能の培地中の 2倍の濃度で（処理条件は、四重に行われている）は、車両および化合物の200μlのを準備します。マルチウェルピペッティングを容易にするために、滅菌96ウェルプレート中の化合物を配置します。 </li><li>慎重に12ウェルマニホールドアスピレーターで膵島培地を除去し、12ウェルピペットを用いて膵島機能媒体（35μL/ウェル）と交換してください。 （図1C）を乾燥させるリスクを制限するために、一度に1行からメディアを取り外し、交換してください。 </li><li> 2倍の化合物溶液35μlの/ウェルを転送することにより、治療を開始します。 48時間の治療期間のためのインキュベーターにプレートを返します。 </li><li>処理の48時間後、プレートを反転させて処理媒体をデカント。&lt;/李&gt; <li>静かに1×PBS（1分）のウェルあたり50μlの膵島細胞を洗浄します。マルチチャンネルピペットを用いてPBSを加えます。 </li><li> PBSをデカントし、1×PBSで希釈し、冷4％パラホルムアルデヒド（PFA）のウェルあたり50μLを追加することにより、細胞を固定。 4℃で15分間細胞をインキュベートします。 </li><li> PFAを除去するためにプレートを反転させ、ゆっくりと上記のようにウェルあたりPBSを60μlを添加することによって、細胞を3回（各5分）洗浄します。 </li><li>ホルムアミド14.25ミリリットルと0.75ミリリットル0.15 Mクエン酸ナトリウム（pHが6）を混合して15ミリリットル抗原回復溶液を調製します。使用直前に、抗原回復溶液を作ります。 </li><li>プレートを反転させたウェルからPBSを削除し、各ウェルに60μlの抗原回復ソリューションを追加します。 45分間70℃の水浴中でプレートを加熱します。マルチウェルプレートの反りを防ぐために、このインキュベーション中、プレートの上に加熱ブロックを配置します。 注意：水は、プレートスカートハーフウェイアップでなければなりません。プレートが水没するべきではありません。 </li><li&gt;は水浴からプレートを取り外して、常温で20分間冷却します。プレートは目視検査によって反っていないことを確認します。 </li><li> 1×PBSのウェルあたり60μlの3回（各5分）で細胞を洗浄。マルチチャンネルピペットを用いてPBSを加え、プレートを反転させ、PBSをデカント。 </li><li>ブロッキング緩衝液をウェルあたり40μLを添加し、室温で30分間インキュベートし、マルチチャンネルピペットを使用。プレートを反転し、デカントすることによりブロッキングバッファーを削除します。 </li><li>そしてヤギ抗ヒトPDX-1（1：100）：マウス抗ヒトのKi-67（200 1）40μlの追加を各ウェルにブロッキング緩衝液中に希釈した抗体を、4℃で一晩インキュベートします。 </li><li>翌日、抗体溶液をデカントし、上記のように1×PBSで3回（各5分）で細胞を洗浄します。 PBSをデカント。 </li><li>ブロッキング緩衝液中のビオチン化ロバ抗マウスIgGおよびローダミン結合ロバ抗ヤギIgG：希釈（200 1）のウェルあたり40μLを加えます。 1時間インキュベート室温で。 </li><li> 1×PBSで3回、5分ごとに細胞を洗浄。各ウェルにフルオレセイン結合ストレプトアビジン：（ブロッキング緩衝液中で400 1）で希釈し、40μlのを追加します。室温で30分間インキュベートします。 </li><li> 1×PBSで3回、5分ごとに細胞を洗浄。 DAPIのウェルあたり40μlの（ブロッキング緩衝液で300 nM）を添加し、室温で15分間インキュベートします。 </li><li> 1×PBSで2回細胞を洗浄し、PBS 1×40μlの細胞を残します。プレートは現在、分析する準備ができました。 </li></ol> 7.β-細胞複製の分析注：アッセイプロトコルは、β細胞の複製を測定するために使用される高含量スクリーニング顕微鏡のために確立されなければなりません。その最も単純な組成物では、このプロトコルは、識別マーカーはβ細胞（PDX-1 +β細胞）の定義に使用され、複製マーカー（KI-67）細胞分裂イベントを定義するために使用される2色アッセイです。 <ol><li> averagに基づいてオブジェクト（β細胞）を同定β細胞の核（図2A）の予想される画素領域内：近似円（幅&lt;1.6長）内のPDX-1染色（549 nmのフィルター）の電子蛍光強度。 </li><li>次に、PDX-1 +領域（図2B）内の平均蛍光強度（485 nmのフィルター）に基づいて複製イベント（のKi-67-陽性）を識別するための設定を確立。 注：露光時間は、画像全体の画素強度の比較を可能にするために修正する必要があります。アッセイプロトコルパラメータは、マシンの呼び出しが一貫悪影響データの品質に影響を与える可能性がある非特異的な染色、破片および細胞凝集体を除外するように調整されています。 </li><li>精度と限界可変性を最大化するために、ウェルあたり500β細胞の最小値を分析します。 注： - 3％のラット膵島培養における基底β細胞複製指数は0.5であることが期待されます。一般的に、ウェルあたり40の画像は、500β細胞を識別するのに十分以上のものです。 </li><li>分析の前にプレート全体を、選択されたネガ型（DMSO処理）および陽性対照分析（5-ヨードツベルシジン[1μM]またはジピリダモール[15μM]）をアッセイプロトコルの妥当性を評価するために井戸を処置されました。アッセイが正しく確立されると、正の対照化合物は、β細胞の複製の割合の少なくとも2倍の増加を誘導します。 </li><li>アッセイプロトコルが検証された後、プレート全体をお読みください。 </li></ol>

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+screening+for+secreted+proteins+that+modulate+glucose+handling+identifies+interleukin-6+family+members+as+potent+hypoglycemic+agents.">In vivo screening for secreted proteins that modulate glucose handling identifies interleukin-6 family members as potent hypoglycemic agents.</a> PLoS One. 7 (9), e44600 (2012).</li><li>Izumi, K., Hirao, Y., Hopp, L., Oyasu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+induction+of+ornithine+decarboxylase+in+urinary+bladder+carcinoma+cells.">In vitro induction of ornithine decarboxylase in urinary bladder carcinoma cells.</a> Cancer Res. 41 (2), 405-409 (1981).</li><li>Serup, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeodomain+protein+IPF-1/STF-1+is+expressed+in+a+subset+of+islet+cells+and+promotes+rat+insulin+1+gene+expression+dependent+on+an+intact+E1+helix-loop-helix+factor+binding+site.">The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site.</a> Biochem J. 310, 997-1003 (1995).</li><li>Szabat, M., Luciani, D. S., Piret, J. M., Johnson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+adult+beta-cells+revealed+using+a+Pdx1/insulin+dual-reporter+lentivirus.">Maturation of adult beta-cells revealed using a Pdx1/insulin dual-reporter lentivirus.</a> Endocrinology. 150 (4), 1627-1635 (2009).</li><li>Rieck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+hepatocyte+nuclear+factor-4alpha+initiates+cell+cycle+entry,+but+is+not+sufficient+to+promote+beta-cell+expansion+in+human+islets.">Overexpression of hepatocyte nuclear factor-4alpha initiates cell cycle entry, but is not sufficient to promote beta-cell expansion in human islets.</a> Mol Endocrinol. 26 (9), 1590-1602 (2012).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+mellitus--advances+and+challenges+in+human+beta-cell+proliferation.">Diabetes mellitus--advances and challenges in human beta-cell proliferation.</a> Nat Rev Endocrinol. 11 (4), 201-212 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

β細胞の成長と再生を制御する分子経路を研究するための実験方法は、糖尿病の研究者のための重要なツールです。ここで、β細胞複製の小分子の刺激を同定および特徴付けるラット膵島ベースのスクリーニングプラットフォームが提供されます。 このプロトコルのほとんどの側面を容易に経験豊富な研究者によって行われているが、いくつかの手順は、特定の技術を必...

糖尿病は、破壊されたグルコース恒常性の一般的なエンドポイントを共有する疾患のコレクションを含みます。糖尿病のサブタイプの病原性のメカニズムは異なっているが、それらは減少したβ細胞量、 すなわち 、インスリン産生能力1,2の損失の結果を共有します。現在、糖尿病の治療戦略は、外因性インスリン、インスリン感受性のインスリン産生または増強の薬理学的刺激、およびまれに、膵島または膵臓全体3,4の移植の慢性投与に依存しています。残念ながら、これらの戦略の成功は短命であり、および/または十分に内因性インスリン産生の機能を再現することができません。 β細胞の再生を刺激するための方法の開発の有用性にもかかわらず、そのような手法は存在しません。したがって、主要な糖尿病の研究の目標は、新しいβ細胞を生成するために、または内因性β細胞量5を展開するための方法を開発することです</sup&gt;。このような胚性幹細胞などの再生可能エネルギー源からのβ細胞の再生が進んでいるが、安全性と効率性の懸念は、成熟β細胞の拡大、優先度6,7を含む代替戦略の追求を行います。重要なことには、in vivoでの新β細胞の主な供給源は、既存のβ細胞ではなく、特殊な前駆細胞8,9です。 β細胞は、制限された複製能力を有するように見えるが、β細胞量（〜30％）のわずかな増加は、多くの糖尿病患者のグルコースホメオスタシスを回復するのに十分であり得ます。また、β細胞量のその場の薬理学的刺激に潜在的に安価でスケーラブルな治療戦略です。本明細書中でβ細胞の増殖を刺激する小分子を同定し、特徴づけるためのハイコンテントスクリーニング方法が提供されます。 インビトロ実験方法の様々な遺伝子産物および/ ​​または分子THAを同定することができますトンの一次β細胞の複製を促進します。 β細胞複製の誘導を測定するための初期の努力は、特定の処理条件10に対応してアルデヒドチオニンまたはインスリン染色された集団内の[3 H]チミジン取り込み、BrdU取り込みや有糸分裂体を測定するために胎児げっ歯類膵臓培養または無傷の単離された膵島培養を使用しました11。これらのin vitroでのアプローチと密接な変異体は、それらのいくつかの制限があります。著名な欠陥が成熟β細胞とは異なり、高い基礎β細胞の複製速度を表示し、明確な方法12で調節成長している、胎児細胞の（1）の使用が含まれます。 （2）β細胞の複製イベントの実験に依存する裁定の主観的な性質; （3）β細胞の複製イベントの実験に依存カウントの労力と時間集約的な性質は、実験的なスループットを遅らせます。 （4）核取り込み/染色/外観を使用することはあっても、複製を識別するためにTSおよびβ細胞を同定するための非重複細胞質染色はβ細胞に近接する非β細胞複製イベントの誤帰属につながります。 より最近では、成熟一次β細胞は、β細胞の複製13-16の過剰発現導入遺伝子の影響だけでなく、遺伝子産物または化合物の治療を評価するために使用されてきました。しかし、これらの研究はまた、複製イベント、β細胞の同定および/ ​​またはスループットを制限する労働集約型の手順、 例えば 、細胞または無傷の膵島の個々のスライドウェルめっきの細胞質staining-または非特異的な方法の主観的なカウントに依存していますパラフィン包埋し、処理17。なお、本明細書に提示1に似たイメージベースのヒトβ細胞複製のスクリーニング方法は、18を公開されています。しかしながら、このアッセイの使用の成功が実証されておらず、一次スクリーニングのためのヒト膵島の使用が広くFEAではないかもしれませんsible。 複製促進物質を同定するための代替戦略は、β細胞株の増殖の誘導を評価することです。初期の努力は、MIN6細胞またはINS 13分の832細胞14,19-21形質転換β-細胞株を使用していました。しかし、これらの細胞株は、気ままな成長を示し、高分化型β細胞22に少し似ていません。したがって、成長誘導能力は、最小限の不明確関連性と再現することが困難な場合があります。細胞株ベースのスクリーニングのための改良された戦略は、テトラサイクリン（ドキシサイクリン）の非存在下での増殖停止依存SV40のT抗原の発現23,24ある細胞を「可逆的に形質転換された」利用します。しかし、これらの細胞はドキシサイクリンの除去の際に「正常な」β細胞様の状態に戻すかどうかは不明です。残念ながら、これらの細胞の使用は、即時の有用性を有するとは思われない一般的な成長促進化合物をもたらしました24。全体的に、最小限の自発的複製活性を示す細胞型の成長調節を研究するための細胞系の使用が制限された適用性を有していてもよいです。 本明細書に提示β細胞複製スクリーニングプラットフォームは、マルチ、成熟した初代ラットβ細胞は、系統制限成長促進活動の識別を可能にするために、可能な限り生体内増殖調節、混合細胞型組成物の膵島細胞培養で保持することを利用しますバイアスを排除し、スループットを容易にするために、スループットと自動分析を最大化するために、書式設定型ウェル。このプラットフォームの使用の成功は、β細胞の複製25,26を促進するいくつかの化合物の同定を可能にしました。さらに、アッセイは、β細胞の複製の分子調節に機構的洞察を提供するために、構造活性相関研究および化学エピスタシス実験に使用されてきました。提示プラットフォームが正常にfoが適応されましたRβ細胞複製のレンチウイルスのRNAiベースの調査は25の経路。アッセイの制限事項は、（一次細胞の使用）スケーラビリティを制限含まれ、むしろ抗体ベースのイメージングおよび一次膵島の使用、使用に関連した（アッセイは、ヒト膵島研究のために適合させることができるけれども）は、ヒト膵島細胞、費用よりもげっ歯類の使用画像収集および分析機能を備えた自動顕微鏡の利用時に自動化された画像の取得と依存性を容易にするために、分散した島（破壊された膵島アーキテクチャ）の。遺伝子産物またはその場での β細胞の再生を刺激する化合物を同定するための容易なin vivoでのスクリーニング方法が理想的であろうが、このようなプラットフォームは、まだ27利用できません。したがって、記載プラットフォームはβ細胞複製のほとんどの側面を調査することに興味の研究者に適しています。

<table><tbody><tr><td>250 g male Male Sprague Dawly Rat</td><td>Charles River</td><td>Stain # 400</td><td></td></tr><tr><td>12 cm teeth tisuue forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11021-12</td><td></td></tr><tr><td>11.5 cm fine scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>14.5 cm surgical scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-14</td><td></td></tr><tr><td>16 cm curved forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-16</td><td></td></tr><tr><td>12 cm curved hepostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13011-12</td><td></td></tr><tr><td>12 cm scalpel handle</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Tissue sieve-30 mesh</td><td>Bellco Glass</td><td>1985-85000</td><td></td></tr><tr><td>Cizyme RI, 375,000 CDA units</td><td>VitaCyte</td><td>005-1030</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt solution (Ca&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt;)</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine HCl (200 mg/20 ml)</td><td>JHP Pharmaceuticals</td><td>NDC# 42023-113-10</td><td>to make anesthetic cocktail&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Xylazine (5 g/50 ml)</td><td>LLOYD</td><td>NADA# 139-236</td><td>to make anesthetic cocktail&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>H-1077</td><td>to make histopaque 1100</td></tr><tr><td>Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>H-1119</td><td>to make histopaque 1100</td></tr><tr><td>Newborn Calf Serum 500 ml</td><td>Hyclone</td><td>SH30118.03</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt solution</td><td>Hyclone</td><td>SH30268.01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium/Low Glucose&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>Functionality/Viability Solution&amp;nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>99-768-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 media&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30096.01</td><td>to make conditioned medium</td></tr><tr><td>804G rat bladder carcinoma cell-line</td><td>Available upon request</td><td></td><td>to make conditioned medium</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Qualified</td><td>Gibco</td><td>26160</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax-I</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml)&amp;nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670049</td><td></td></tr><tr><td>Formamide 500 ml</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP227-500</td><td></td></tr><tr><td>Antigen Unmasking Solution 250 ml (pH 6.0)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3300</td><td>to make 0.15 M Sodium Sitrate solution</td></tr><tr><td>Dextrose, Anhydrous</td><td>EMD Chemicals</td><td>DX0145-1</td><td>to make 1 M glucose solution</td></tr><tr><td>Nomal Donkey Serum (Powder)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-human Ki67 antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>556003</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-human PDX-1 antibody</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF2419</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody</td><td>Dako</td><td>2016-08</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody</td><td>Dako</td><td>2014-06</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody</td><td>Dako</td><td>2011-08</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal chicken anti-vimentin antibody</td><td>abcam</td><td>ab24525</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-065-150</td><td></td></tr><tr><td>StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S32354</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-025-147</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-025-148</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-025-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-175-148</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-175-147</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-175-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-175-155</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Millipore</td><td>S7113</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Reagent Reservoir 25 ml</td><td>Sorenson BioScience</td><td>39900</td><td></td></tr><tr><td>384 well, black/clear, tissue culture treated plate</td><td>BD Falcon</td><td>353962</td><td></td></tr><tr><td>96 well, black/clear, tissue culture treated plate</td><td>Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Multi-channel pipettor</td><td>Costar</td><td>4880</td><td></td></tr><tr><td>12-channel vaccume aspirator</td><td>Drummond</td><td>3-000-096</td><td></td></tr><tr><td>Cell Scraper</td><td>Falcon</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Water Bath Model 2223&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>High-content screening instrument: ArrayScan VTI</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a high-content in vitro pancreatic islet &#946;-cell replication discovery platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

β細胞またはα-細胞複製を評価するために、四色アッセイプロトコルが必要とされます。まず、オブジェクトは、DAPI染色（チャンネル1、386ナノメートル）によって識別されます。次に、β細胞（イベント1）がカウントされます：PDX-1 +（チャネル2、650 nm）を核周囲インスリン（チャネル3、549 nm）を同時発現するオブジェクトを。その後、複製β細胞（イベン?...

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A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

糖尿病研究分野のための重要な課題は、膵島β細胞の複製を調節する分子機構を理解し、β細胞の再生を刺激するための方法を開発することです。本明細書中の小分子のβ細胞の複製を促進する活性を同定および評価するためのハイコンテントスクリーニング方法が提供されます。

ハイコンテンツ<em&gt;インビトロ</em&gt;膵島β細胞の複製ディスカバリー・プラットフォーム

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

a-high-content-vitro-pancreatic-islet-cell-replication-discovery

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

11.1K ビュー.  Stanford University School of Medicine. 糖尿病研究分野のための重要な課題は、膵島β細胞の複製を調節する分子機構を理解し、β細胞の再生を刺激するための方法を開発することです。本明細書中の小分子のβ細胞の複製を促進する活性を同定および評価するためのハイコンテントスクリーニング方法が提供されます。 

ビデオ: A High-content In Vitro Pancreatic Islet β-cell Replication Discovery Platform

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. However, it is still unknown whether stem and progenitor cells exist in the adult pancreas. Research strategies using cre-lox lineage-tracing in adult mice have yielded results that either support or refute the idea that beta cells can be generated from the ducts, the presumed location where adult pancreatic progenitors may reside. These in vivo cre-lox lineage-tracing methods, however, cannot answer the questions of self-renewal and multi-lineage differentiation-two criteria necessary to define a stem cell. To begin addressing this technical gap, we devised 3-dimensional colony assays for pancreatic progenitors. Soon after our initial publication, other laboratories independently developed a similar, but not identical, method called the organoid assay. Compared to the organoid assay, our method employs methylcellulose, which forms viscous solutions that allow the inclusion of extracellular matrix proteins at low concentrations. The methylcellulose-containing assays permit easier detection and analyses of progenitor cells at the single-cell level, which are critical when progenitors constitute a small sub-population, as is the case for many adult organ stem cells. Together, results from several laboratories demonstrate in vitro self-renewal and multi-lineage differentiation of pancreatic progenitor-like cells from mice. The current protocols describe two methylcellulose-based colony assays to characterize mouse pancreatic progenitors; one contains a commercial preparation of murine extracellular matrix proteins and the other an artificial extracellular matrix protein known as a laminin hydrogel. The techniques shown here are 1) dissociation of the pancreas and sorting of CD133+Sox9/EGFP+ ductal cells from adult mice, 2) single cell manipulation of the sorted cells, 3) single colony analyses using microfluidic qRT-PCR and whole-mount immunostaining, and 4) dissociation of primary colonies into single-cell suspensions and re-plating into secondary colony assays to assess self-renewal or differentiation.

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro colony assays to detect self-renewal and differentiation of progenitor cells isolated from adult murine pancreas are devised. In these assays, pancreatic progenitors give rise to cell colonies in 3-dimensional space in methylcellulose-containing semi-solid medium. Protocols for handling single cells and characterization of individual colonies are described.

インビトロコロニーアッセイでトライ強力な前駆細胞を特徴付けるための大人のマウスの膵臓から分離されました

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

発生生物学

Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets

Glucose homeostasis is primarily controlled by the endocrine hormones insulin and glucagon, secreted from the pancreatic beta and alpha cells, respectively. Functional beta cell mass is determined by the anatomical beta cell mass as well as the ability of the beta cells to respond to a nutrient load. A loss of functional beta cell mass is central to both major forms of diabetes 1-3. Whereas the declining functional beta cell mass results from an autoimmune attack in type 1 diabetes, in type 2 diabetes, this decrement develops from both an inability of beta cells to secrete insulin appropriately and the destruction of beta cells from a cadre of mechanisms. Thus, efforts to restore functional beta cell mass are paramount to the better treatment of and potential cures for diabetes.
Efforts are underway to identify molecular pathways that can be exploited to stimulate the replication and enhance the function of beta cells. Ideally, therapeutic targets would improve both beta cell growth and function. Perhaps more important though is to identify whether a strategy that stimulates beta cell growth comes at the cost of impairing beta cell function (such as with some oncogenes) and vice versa.
By systematically suppressing or overexpressing the expression of target genes in isolated rat islets, one can identify potential therapeutic targets for increasing functional beta cell mass 4-6. Adenoviral vectors can be employed to efficiently overexpress or knockdown proteins in isolated rat islets 4,7-15. Here, we present a method to manipulate gene expression utilizing adenoviral transduction and assess islet replication and beta cell function in isolated rat islets (Figure 1). This method has been used previously to identify novel targets that modulate beta cell replication or function 5,6,8,9,16,17.

This protocol allows one to identify factors that modulate functional beta cell mass to find potential therapeutic targets for the treatment of diabetes. The protocol consists of a streamlined method to assess islet replication and beta cell function in isolated rat islets following manipulation of gene expression with adenoviruses.

Adenovirally形質分離されたげっ歯類膵島におけるレプリケーションおよびβ細胞機能を評価する

Glucose homeostasis is primarily controlled by the endocrine hormones insulin and glucagon, secreted from the pancreatic beta and alpha cells, ...

医学

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within pancreatic islets and act in a coordinated fashion to maintain glucose homeostasis. It is becoming increasingly clear that interactions between transmembrane proteins on the surfaces of adjacent beta cells are important determinants of beta-cell function.
Elucidation of the roles of particular transcellular interactions by knockdown, knockout or overexpression studies in cultured beta cells or in vivo necessitates direct perturbation of mRNA and protein expression, potentially affecting beta-cell health and/or function in ways that could confound analyses of the effects of specific interactions. These approaches also alter levels of the intracellular domains of the targeted proteins and may prevent effects due to interactions between proteins within the same cell membrane to be distinguished from the effects of transcellular interactions.
Here a method for determining the effect of specific transcellular interactions on the insulin secreting capacity and responsiveness of beta cells is presented. This method is applicable to beta-cell lines, such as INS-1 cells, and to dissociated primary beta cells. It is based on coculture models developed by neurobiologists, who found that exposure of cultured neurons to specific neuronal proteins expressed on HEK293 (or COS) cell layers identified proteins important for driving synapse formation. Given the parallels between the secretory machinery of neuronal synapses and of beta cells, we reasoned that beta-cell functional maturation might be driven by similar transcellular interactions. We developed a system where beta cells are cultured on a layer of HEK293 cells expressing a protein of interest. In this model, the beta-cell cytoplasm is untouched while extracellular protein-protein interactions are manipulated. Although we focus here primarily on studies of glucose-stimulated insulin secretion, other processes can be analyzed; for example, changes in gene expression as determined by immunoblotting or qPCR.

Transcellular protein interactions are important determinants of pancreatic beta-cell function. Detailed here is a method&#x2014;adapted from a coculture model of synaptogenesis&#x2014;for investigating how specific transmembrane proteins influence insulin secretion. Transfected HEK293 cells express proteins of interest; beta cells do not need to be transfected or otherwise directly perturbed.

膵β細胞によるインスリン分泌に影響を及ぼす細胞外タンパク質相互作用の共培養分析

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, including insulin-secreting &#946; cells, are differentiated from common endocrine progenitors during the embryonic stage. Immature endocrine cells expand via cell proliferation and mature during a long postnatal developmental period. However, the mechanisms underlying these processes are not clearly defined. Single-cell RNA-sequencing is a promising approach for the characterization of distinct cell populations and tracing cell lineage differentiation pathways. Here, we describe a method for the single-cell RNA-sequencing of isolated pancreatic &#946; cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases.

We describe a method for the isolation of endocrine cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases followed by single-cell RNA sequencing. This method allows analyses of pancreatic endocrine lineage development, cell heterogeneity and transcriptomic dynamics.

マウス膵臓内分泌細胞の単一細胞トランスクリプトーム解析

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the pancreatic &#946;-cells. In addition, biomaterial particles, hydrogels, and scaffolds also provide a unique opportunity to administer sustained, controllable drug delivery to &#946;-cells in culture and in transplanted tissue models. These technologies allow the study of candidate &#946;-cell proliferation factors using intact islets and a translationally relevant system. Moreover, determining the effectiveness and feasibility of candidate factors for stimulating &#946;-cell proliferation in a culture system is critical before moving forward to in vivo models. Herein, we describe a method to co-culture intact mouse islets with biodegradable compound of interest (COI)-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres for the purpose of assessing the effects of sustained in situ release of mitogenic factors on &#946;-cell proliferation. This technique describes in detail how to generate PLGA microspheres containing a desired cargo using commercially available reagents. While the described technique uses recombinant human Connective tissue growth factor (rhCTGF) as an example, a wide variety of COI could readily be used. Additionally, this method utilizes 96-well plates to minimize the amount of reagents necessary to assess &#946;-cell proliferation. This protocol can be readily adapted to use alternative biomaterials and other endocrine cell characteristics such as cell survival and differentiation status.

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

無傷のマウスの膵島のβ細胞のマイトジェンの持続的投与<em&gt; ex vivoで</em&gt;生分解性ポリ（乳酸-co-グリコール酸）微小球を使用して

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

生物工学

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Into Pancreatic Beta-Cell Precursors in a 2D Culture System

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to diabetes. hPSC-derived insulin-secreting cells can be generated for cell therapy and disease modeling,&#160;however,&#160;with limited efficiency and functional properties. hPSC-derived pancreatic progenitors that are precursors to beta cells and other endocrine cells, when co-express the two transcription factors PDX1 and NKX6.1, specify the progenitors to functional, insulin-secreting beta cells both in vitro and in vivo. hPSC-derived pancreatic progenitors are currently used for cell therapy in type 1 diabetes patients as part of clinical trials. However, current procedures do not generate a high proportion of NKX6.1 and pancreatic progenitors, leading to co-generation of non-functional endocrine cells and few glucose-responsive, insulin-secreting cells. This work thus developed an enhanced protocol for generating hPSC-derived pancreatic progenitors that maximize the co-expression of PDX1 and NKX6.1 in a 2D monolayer. The factors such as cell density, availability of fresh matrix, and dissociation of hPSC-derived endodermal cells are modulated that augmented PDX1 and NKX6.1 levels in the generated pancreatic progenitors and minimized commitment to alternate hepatic lineage. The study highlights that manipulating the cell&#39;s physical environment during in vitro differentiation can impact lineage specification and gene expression. Therefore, the current optimized protocol facilitates the scalable generation of PDX1 and NKX6.1 co-expressing progenitors for cell therapy and disease modeling.

The present protocol describes an enhanced method to increase the co-expression of PDX1 and NKX6.1 transcription factors in pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells (hPSCs) in planar monolayers. This is achieved by replenishing the fresh matrix, manipulating cell density, and dissociating the endodermal cells.

2D培養系におけるヒト多能性幹細胞の膵臓ベータ細胞前駆体への分化

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to ...

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-Producing Islet Clusters

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and diabetes treatment. However, challenges remain in obtaining stem cell-derived beta cells that adequately mimic native human beta cells. Building upon previous studies, hPSC-derived islet cells have been generated to create a protocol with improved differentiation outcomes and consistency. The protocol described here utilizes a pancreatic progenitor kit during Stages 1-4, followed by a protocol modified from a paper previously published in 2014 (termed "R-protocol" hereafter) during Stages 5-7. Detailed procedures for using the pancreatic progenitor kit and 400 &#181;m diameter microwell plates to generate pancreatic progenitor clusters, R-protocol for endocrine differentiation in a 96-well static suspension format, and in vitro characterization and functional evaluation of hPSC-derived islets, are included. The complete protocol takes 1 week for initial hPSC expansion followed by ~5 weeks to obtain insulin-producing hPSC islets. Personnel with basic stem cell culture techniques and training in biological assays can reproduce this protocol.

The differentiation of stem cells into islet cells provides an alternative solution to conventional diabetes treatment and disease modeling. We describe a detailed stem cell culture protocol that combines a commercial differentiation kit with a previously validated method to aid in producing insulin-secreting, stem cell-derived islets in a dish.

ヒト多能性幹細胞のインスリン産生膵島クラスターへの分化

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

マウス膵島の単離と細胞内cAMP測定法

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

生物学

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a mixed cell population in a structured architecture that impacts function, and human islets are widely variable in cell type composition. Current frequently used methods to study cultured islets include molecular studies performed on whole islets, lumping disparate islet cell types together, or microscopy or molecular studies on dispersed islet cells, disrupting islet architecture. For in vivo islet studies, paraffin-embedded pancreas sectioning is a powerful technique to assess cell-specific outcomes in the native pancreatic environment. Studying post-culture islets by paraffin sectioning would offer several advantages: detection of multiple outcomes on the same islets (potentially even the exact-same islets, using serial sections), cell-type-specific measurements, and maintaining native islet cell-cell and cell-substratum interactions both during experimental exposure and for analysis. However, existing techniques for embedding isolated islets post-culture are inefficient, time consuming, prone to loss of material, and generally produce sections with inadequate islet numbers to be useful for quantifying outcomes. Clinical pathology laboratory cell block preparation facilities are inaccessible and impractical for basic research laboratories. We have developed an improved, simplified bench-top method that generates sections with robust yield and distribution of islets. Fixed islets are resuspended in warm histological agarose gel and pipetted into a flat disc on a standard glass slide, such that the islets are distributed in a plane. After standard dehydration and embedding, multiple (10+) 4 - 5 &#181;m sections can be cut from the same islet block. Using this method, histological&#160;and immunofluorescent analyses can be performed on mouse, rat, and human islets. This is an effective, inexpensive, time-saving approach to assess cell-type-specific, intact-architecture outcomes from cultured islets.

Ex vivo pancreatic islet studies are important for diabetes research. Existing techniques to study cultured islets in their native 3-dimensional architecture are time consuming, inefficient, and infrequently used. This work describes a new, simple, and efficient method for generating high-quality paraffin sections of whole cultured islets.

パラフィン セクションの埋め込み膵島

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

ヒト偽島における細胞内シグナル伝達イベントとホルモン分泌

Human Pseudoislet System for Synchronous Assessment of Fluorescent Biosensor Dynamics and Hormone Secretory Profiles

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, have a central role in the control of glucose homeostasis through the secretion of insulin by beta cells, which lowers blood glucose, and glucagon by alpha cells, which raises blood glucose. Intracellular signaling pathways, including those mediated by cAMP, are key for regulated alpha and beta cell hormone secretion. The 3D islet structure, while essential for coordinated islet function, presents experimental challenges for mechanistic studies of the intracellular signaling pathways in primary human islet cells. To overcome these challenges and limitations, this protocol describes an integrated live-cell imaging and microfluidic platform using primary human pseudoislets generated from donors without diabetes that resemble native islets in their morphology, composition, and function. These pseudoislets are size-controlled through the dispersion and reaggregation process of primary human islet cells. In the dispersed state, islet cell gene expression can be manipulated; for example, biosensors such as the genetically encoded cAMP biosensor, cADDis, can be introduced. Once formed, pseudoislets expressing a genetically encoded biosensor, in combination with confocal microscopy and a microperifusion platform, allow for the synchronous assessment of fluorescent biosensor dynamics and alpha and beta cell hormone secretory profiles to provide more insight into cellular processes and function.

著者スポットライト:疑似島プロトコルによる膵島の異常と機能の調査 

This protocol describes a method for the synchronous acquisition and co-registration of intracellular signaling events and the secretion of insulin and glucagon by primary human pseudoislets using the adenoviral delivery of a cyclic adenosine monophosphate (cAMP) biosensor, a cAMP difference detector in situ (cADDis), and a microperifusion system.

蛍光バイオセンサーの動態とホルモン分泌プロファイルの同期評価のためのヒト偽島システム

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, ...

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インビトロコロニーアッセイでトライ強力な前駆細胞を特徴付けるための大人のマウスの膵臓から分離されました

Adenovirally形質分離されたげっ歯類膵島におけるレプリケーションおよびβ細胞機能を評価する

膵β細胞によるインスリン分泌に影響を及ぼす細胞外タンパク質相互作用の共培養分析

マウス膵臓内分泌細胞の単一細胞トランスクリプトーム解析

無傷のマウスの膵島のβ細胞のマイトジェンの持続的投与

2D培養系におけるヒト多能性幹細胞の膵臓ベータ細胞前駆体への分化

ヒト多能性幹細胞のインスリン産生膵島クラスターへの分化

マウス膵島の単離と細胞内cAMP測定法

パラフィンセクションの埋め込み膵島

蛍光バイオセンサーの動態とホルモン分泌プロファイルの同期評価のためのヒト偽島システム

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インビトロコロニーアッセイでトライ強力な前駆細胞を特徴付けるための大人のマウスの膵臓から分離されました

Adenovirally形質分離されたげっ歯類膵島におけるレプリケーションおよびβ細胞機能を評価する

膵β細胞によるインスリン分泌に影響を及ぼす細胞外タンパク質相互作用の共培養分析

マウス膵臓内分泌細胞の単一細胞トランスクリプトーム解析

無傷のマウスの膵島のβ細胞のマイトジェンの持続的投与

2D培養系におけるヒト多能性幹細胞の膵臓ベータ細胞前駆体への分化

ヒト多能性幹細胞のインスリン産生膵島クラスターへの分化

マウス膵島の単離と細胞内cAMP測定法

パラフィン セクションの埋め込み膵島

蛍光バイオセンサーの動態とホルモン分泌プロファイルの同期評価のためのヒト偽島システム

パラフィンセクションの埋め込み膵島