この作品は、テキサス大学のマクガバン医学部小児科から健康NIDDK助成金（K01DK092320）とスタートアップ資金の国立研究所によってサポートされていました。

以下のプロトコルは、施設ケアと使用委員会（：HSC-AWC-13から135のプロトコル番号）として機能し、実験動物医学動物福祉委員会、のためのヒューストンのセンターでテキサス大学健康科学センターによって承認されています。 腎臓を標的とする注射用の1割球の同定および選択を<ol><li>胚を生成する前に、胚における初期の細胞分裂の方向性を理解するために、アフリカツメガエルの開発21の正常な表を使用しています。 Xenbase 11上のアフリカツメガエルの初期の発達段階の代わりに、アクセス図。 </li><li>マイクロインジェクションの対象とされる割球を選択するXenbase 11上のインタラクティブアフリカツメガエル細胞運命のマップにアクセスします。 </li><li>単一細胞胚は暗く着色された動物極と白と卵黄のようなある植物極を、持っていることを確認します。なお、卵黄eとして知られている保護膜、nvelope、胚をカバーしています。 </li><li>最初の切断は、典型的には、胚の左側と右側との間で発生していることに注意してください。これらの細胞は、前腎系統に均等に寄与する。 </li><li>第二の切断は4細胞期胚につながる、胚の背側と腹側の半分を分割することに注意してください。背側細胞が小さく、腹側細胞（ 図2Aおよび図3A）未満の顔料を持っています。 <ol><li>左右に、背側よりも発展途上の腎臓に多くを貢献（D;小型、軽量細胞）割球（ 図2A）、腹側割球（大、ダーク細胞V）を特定します。 </li><li> 4細胞期胚に注入する場合は、左腎臓（ 図3Aおよび第3節）を標的とするために、左腹側割球を注入します。 </li></ol></li><li>第三の開裂は、8細胞胚を生じ、動物および植物の側面を二等分します。この時点で、4動物割球[左右の腹があります（V1）と背側（D1）]と4植物腹左右の割球[（V2）と背側（D2）]（ 図2Bおよび図3B）。 <ol><li>腹、植物割球（V2）を見つけます。これらの割球は、この段階で、他の細胞（ 図2B）を開発し、腎臓に多くを貢献しています。 8細胞期胚の左腎臓を標的とするために、左V2の割球（ 図3B及び第3項）に注入。 </li></ol></li><li>第四及び第五の切断は、動物や植物割球を二分することに注意してください。二つの子孫は16細胞期胚を生じ、各割球から生成されます。細胞は、その前身にちなんで命名されています。例えば、8細胞期からV2の割球は、16細胞期（ 図2C）でV2.1とV2.2の子孫を生じさせます。 16細胞期でのV2.2セルは、発展途上の腎臓に貢献する細胞の大部分を提供します。 </li><li> （注）第六及び第七の切断は、32セルエンブリーになりますO。ここでも、2子孫は、その前身で、次の名前が付けられ、各割球から生成されています。例えば、16細胞期からV2.2の割球は、32細胞期でのV2.2.1およびV2.2.2を生じさせます。そこ細胞は（植物に動物から）A、B、C、およびDの4行で識別される32細胞期での代替的な命名システムであり、4列に1、2、3、及び4（AS背側から腹側へ）。このように、開発前腎に最も貢献V2.2.2の割球は、この代替ネーミングシステム（ 図2D）の下でC3と呼ばれています。 </li></ol>胚の作製<ol><li> Dejelly液（pH 8.0から2パーセントシステイン、NaOHを）の50ミリリットルを準備します。 </li><li>標準的なプロトコル14に従って、単一の男性のカエルからの両方の精巣を分離します。 0.1MのNaCl、2 mMの塩化カリウム、1mMのMgSO 4を、2 mMの、10ミリリットル精巣ストレージソリューション（1×マークの改変リンガー[MMRで満たされた60ミリメートルペトリ皿に精巣を配置CaCl 2、5mMのHEPES pH8の、0.1mMのEDTA] 12、1％ウシ血清アルブミン、50μg/ mlのゲンタマイシン）。 4°Cで睾丸を保管してください。 注： - 4℃で10日間が、受精率が長く精巣が格納されている減少する精巣は約7のために保存することができます。 </li><li>標準的なプロトコル14に従って卵を得るために、女性のカエルを絞ります。 100ミリメートルペトリ皿に卵を収集します。余分な水分をオフに注ぎます。 </li><li>それは鉗子やカミソリの刃を使用して、精巣ストレージソリューションでありながら、精巣の1/4をカット。卵を含むペトリ皿に精巣の一部を転送します。精巣が格納されているどのくらいの精巣の大きさを考慮するために使用される精巣部分のサイズを調整し、どのように多くの卵を受精されるべきです。一般的に卵の一方のクラッチを肥やすためにたて解剖精巣の1/3に¼を使用しています。 </li><li>鉗子やカミソリの刃を使用して小片に精巣部分をカットします。十分な0.3XのMMRを追加します。卵をカバーするペトリ皿に+を30mg / mlのゲンタマイシン。ミックスする皿にMMRを旋回。 </li><li>受精は室温で行われるようにするために約30分を待ちます。動物半球（胚の着色された側）が有効受精時に胚の上に座ることに注意してください。そして、トランスファーピペットを用いて、ペトリ皿からMMRを削除します。胚をカバーするために皿に十分なDejellyソリューションを追加します。 </li><li>次の数分間にわたって、静かに断続的に料理を旋回。この時点で皿の激しく振盪は、軸の欠陥を引き起こす可能性があります。 &#160;胚上のゼリーコートが溶解し、そして胚が渦巻く中に皿の中央に集まるだろう。胚が密接に皿の中央で互いに接触されると、転送ピペットでDejellyソリューションを削除します。より長い5分間Dejellyソリューションで胚を放置しないでください、または胚が破損する恐れがあります。 </li><li> 0.3Xで5回 - dejellied胚3を洗います慎重に注ぐまたはMMRオフピペッティングし、新しいMMRと皿を充填することによってMMRは、+ 30 mg / mlでのゲンタマイシン。皿からMMRのすべてを削除しないでください、または胚が破損する恐れがあります。 </li><li>トランスファーピペットを用いて、ペトリ皿から任意の未受精卵や精巣の部分を削除します。 </li><li> 14と22℃の間の胚を培養します。 注：より低い温度で成長した胚は、より高い温度で成長した胚よりもゆっくりと開発しています。発達段階のタイミングはXenbase 22で見つけることができます。 <ol><li>その開発外空間に、ペトリ皿内の単一の受精から胚の場所の半分を14℃に維持し、ペトリ皿中の胚の他の半分を18℃に維持しました。これは、単一の受精から4細胞もしくは8細胞胚に注射二組のを可能にします。 </li></ol></li></ol>注射液および胚のマイクロインジェクションの調製<ol><li> 0.01を含む注射液を調製NG / NL膜結合型赤色蛍光タンパク質（MEM-RFP）のmRNA 9胚は4セルまたは8細胞期に開発されています。注射する準備が整うまで氷上で注射液を保管してください。 </li><li>プル」800への熱＃2の値を設定します。針プラーケースの上部に揃え交換チューブの上部で、ニードルプラーに交換用ガラス毛細管、および650プレスへのプル値「7のロード「針を引っ張るためのボタン。これは、単一の7から2針を作成する「ガラス毛細管。 </li><li>デュモンのピンセットで引っ張っ針の先端をチョキンと切ります。 注意：針を引っ張った後、先端が閉じ封入されていると切り開かなければなりません。それが切断された針のポイントに近い、より小さな直径針の先端になります。先端の直径は、ここで使用されるマイクロインジェクションシステムとの注入量には影響しませんが、大径の先端は、胚を損傷する可能性が高いです。 </li><li>メートルスリップ針の背面上にicropipetteコレット。次に、コレットの背後にある針の背面に大きな穴Oリングをスリップ。 </li><li>針で気泡を取得しないように注意しながら、27ゲージの皮下注射針を使用して、鉱物油と針を埋めます。 </li><li>プランジ​​ャーにインストールされている白いプラスチック製スペーサーの大きな穴に針を座席、マイクロインジェクターのプランジャーの上に針をスリップ。プランジ​​ャは白いスペーサー、大きな穴Oリング、およびコレットに続くマイクロインジェクターの身体に最も近い小さなOリングを、持っている必要があります。コレットを締めて、針を固定します。それが適切に確保されていることを確認するために、針をゆっくりと引き出します。 </li><li> 2ビープ音がなくなるまで長押しすると、マイクロインジェクターコントロールボックスの「空」のボタンを押し続けます。 </li><li>パラフィルムの一部の上に注射液のピペット3μlの。パラフィルム上の注射液のビードに針の先端を挿入します。長押しすると、microiのボタンを「埋める」開催しますnjectorコントロールボックスは、針への注射液を描画します。 </li><li> 500ミクロンのポリエステルミリグラム/ mlのゲンタマイシン30 + 0.3XのMMRで5％フィコールとメッシュの裏地付き60ミリメートルペトリ皿を埋めます。皿に30 4細胞もしくは8細胞期胚 - 慎重に20をピペット。 </li><li>髪のループ14を使用して、割球が注入されるように胚を操作すると、針に直面しています。 4細胞胚または8細胞期胚の左側V2の割球の左腹側割球は、針を向くように、左腎臓を標的とするために、胚をラインアップ。 </li><li>皿中の各胚の選択割球に注射液の10 NLを注入します。 注：ペトリ皿の底部にメッシュが胚を安定化し、それらを安定化するためのヘアループを使用せずに注入できるように、圧延するのを防止します。 </li><li>転送は、0.3XのMMR +を30mg / mlのゲンタマイシン、5％フィコールで満たされている培養プレートのウェルに胚を注入しました。注入された胚をインキュベート癒すために注入された割球を可能にするために、少なくとも1時間16℃で秒。 </li><li>ステージ9（前原腸形成する）ことにより、0.3XのMMR + 30 mg / mlでのゲンタマイシンで満たされた新しい培養プレートのウェルに癒さ胚を移します。 </li><li> 40 21 -胚がステージ38に到達するまで22°C - 14で胚をインキュベートします。 </li></ol> 4.固定および胚の免疫染色<ol><li> MOPS / EGTA /硫酸マグネシウムを50mlを調製/ホルムアルデヒド緩衝液[MEMFA：100mMのMOPS（pH7.4）中、2mMのEGTA、1mMの硫酸マグネシウム、3.7％（v / v）のホルムアルデヒド]。 </li><li>ガラスバイアル中で40胚 - 20段38 - トランスファーピペットを使用して、10を置きます。混合するためにバイアルと反転バイアルに100％エタノールに10μlの5％のベンゾカインを追加します。胚を麻酔するために10分を待ちます。 </li><li>ガラスピペットを用いて、バイアルからMMRを削除します。同時に複数のバイアルを処理する場合は、バイアルを24ウェル細胞培養プレート中で直立に保持することができます。 </li><li>ガラス管とMEMFAでバイアルを埋めます。室温で1時間、3次元ロッキングプラットフォーム上でバイアルを置きます。 </li><li>ガラスピペットを用いて、バイアルからMEMFAを削除します。 100％のメタノールでバイアルを記入してください。室温で10分間、三次元揺動プラットフォーム上でバイアルを置き。この洗浄ステップをもう一度繰り返し、-20℃で100％のメタノールで一晩胚を格納します。 </li><li>調製1×リン酸緩衝生理食塩水、ウシ血清アルブミン、トリトン（PBT）：1×PBS、2ミリグラム/ mlのウシ血清アルブミン、0.1％トリトンX-100。 </li><li> 1と10％ヤギ血清と1×PBT：マウスモノクローナル4A6抗体の5希釈（、中間遠位及び連結細管20の膜を標識する）、マウスモノクローナル抗体3G8の午前1時30希釈の一次抗体溶液を準備します（近位尿細管20のラベルの内腔へ）、および1：ウサギポリクローナルRFP抗体の250希釈（MEM-RFPトレーサーを標識します）。 4℃で保存。 </li><li> secondaを準備RY抗体溶液：10％ヤギ血清で1×PBT、1：500のAlexa 488ヤギ抗マウスIgG（ストック濃度を2mg / mlで標識4A6及び3G8）は、1：500のAlexa 555ヤギ抗ウサギIgG（ストック濃度2 mg / mlで、MEM-RFPトレーサーを標識します）。光から保護するためにホイルでチューブをカバーし、4℃で保管してください。 </li><li>また、染色後の一次および二次抗体を収集し、今後の実験に再利用するために4℃で保存します。抗体は、再利用のために保存される場合、0.01％アジ化ナトリウムを加えます。 </li><li>確立されたプロトコル18を使用して胚を免疫染色。 </li></ol>ターゲット前腎組織の胚および分析5.可視化<ol><li>正しい割球は、1Xでの蛍光実体顕微鏡下でトレーサーの蛍光を見ることにより、注入されたことを確認するために免疫染色した胚を選別（胚全体を表示する）と5X倍率（腎臓を表示します）。我々にマルチウェルガラスプレートに胚を置きますカットオフチップで転送ピペットを用いて1×PBTで満たさLLS。髪のループを持つ胚を操作します。遺伝子の過剰発現やノックダウン分析のための胚の左側に前腎に同時注入トレーサーの存在を持つ胚（ 図3C、Fおよび図4C、F）のみを使用してください。 </li><li>ガラスバイアルに胚を配置し、マレーのクリアでバイアルを充填することによって：代わりに、マレーのクリア（1部のベンジルアルコール2部の安息香酸ベンジル）で胚をオフにします。ガラスウェルプレートを使用して胚を視覚化します。 注：マレーのクリアは、有機溶媒であり、取り扱いに注意する必要があります。手袋を着用し、唯一のマレーのクリアでガラスバイアルとピペットを使用しています。 </li><li> 3週間 - 2のための1X PBTで4℃で保存胚。胚の長期保存のために、室温で10分間、100％メタノールで2回洗浄することにより、胚を脱水します。 100％メタノール中で-20℃で胚を保管してください。 </li></ol>

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	<li>Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+for+the+study+of+kidney+development:+Use+of+the+pronephros+in+the+analysis+of+organ+induction+and+patterning.">Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning.</a> Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).</li><li>Brandli, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+molecular+anatomy+of+the+Xenopus+pronephric+kidney.">Towards a molecular anatomy of the Xenopus pronephric kidney.</a> Int. J. Dev. Biol. 43 (5), 381-395 (1999).</li><li>Hensey, C., Dolan, V., Brady, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+pronephros+as+a+model+system+for+the+study+of+kidney+development+and+pathophysiology.">The Xenopus pronephros as a model system for the study of kidney development and pathophysiology.</a> Nephrol. Dial. Transplant. 17, 73-74 (2002).</li><li>Carroll, T., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergism+between+Pax-8+and+lim-1+in+embryonic+kidney+development.">Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development.</a> Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).</li><li>Zhou, X., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximo-distal+specialization+of+epithelial+transport+processes+within+the+Xenopus+pronephric+tubules.">Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric tubules.</a> Dev. Biol. 271 (2), 322-338 (2004).</li><li>Raciti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+pronephric+kidney+revealed+by+large-scale+gene+expression+mapping.">Organization of the pronephric kidney revealed by large-scale gene expression mapping.</a> Genome Biol. 9 (5), 84 (2008).</li><li>Moody, S. A., Kline, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+fate+during+cleavage+of+frog+(Xenopus+laevis)+blastomeres.">Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres.</a> Anat. Embryol. Berl. 182 (4), 347-362 (1990).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+stage+of+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 16-cell stage of Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell+stage+of+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 32-cell stage of Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).</li><li>Bauer, D. V., Huang, S., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cleavage+stage+origin+of+Spemann's+Organizer:+Analysis+of+the+movements+of+blastomere+clones+before+and+during+gastrulation+in+Xenopus.">The cleavage stage origin of Spemann's Organizer: Analysis of the movements of blastomere clones before and during gastrulation in Xenopus.</a> Dev. 120 (5), 1179-1189 (1994).</li><li>Karpinka, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenbase,+the+Xenopus+model+organism+database;+new+virtualized+system,+data+types+and+genomes.">Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes.</a> Nucleic Acids Res. 43, 756-763 (2015).</li><li>Davidson, L. A., Marsden, M., Keller, R., Desimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alpha5beta1+and+fibronectin+regulate+polarized+cell+protrusions+required+for+Xenopus+convergence+and+extension.">Integrin alpha5beta1 and fibronectin regulate polarized cell protrusions required for Xenopus convergence and extension.</a> Curr. Biol. 16 (9), 833-844 (2006).</li><li>Wallingford, J. B., Carroll, T. J., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precocious+expression+of+the+Wilms'+tumor+gene+xWT1+inhibits+embryonic+kidney+development+in+Xenopus+laevis.">Precocious expression of the Wilms' tumor gene xWT1 inhibits embryonic kidney development in Xenopus laevis.</a> Dev. Biol. 202, 103-112 (1998).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D., Kloc, M., Kubiak, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+pronephros:+A+kidney+model+making+leaps+toward+understanding+tubule+development.">The Xenopus pronephros: A kidney model making leaps toward understanding tubule development.</a> Xenopus Development. , 215-238 (2014).</li><li>Lienkamp, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+kidney+tubules+elongate+using+a+planar+cell+polarity-dependent+rosette-based+mechanism+of+convergent+extension.">Vertebrate kidney tubules elongate using a planar cell polarity-dependent rosette-based mechanism of convergent extension.</a> Nat. Genet. 44 (12), 1382-1387 (2012).</li><li>Lyons, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+Wnt/&#946;-catenin+signaling+in+pronephric+kidney+development.">Requirement of Wnt/&#946;-catenin signaling in pronephric kidney development.</a> Mech. Dev. 126 (3-4), 142-159 (2009).</li><li>Miller, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pronephric+tubulogenesis+requires+Daam1-mediated+planar+cell+polarity+signaling.">Pronephric tubulogenesis requires Daam1-mediated planar cell polarity signaling.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 22, 1654-1667 (2011).</li><li>Vize, P. D., Jones, E. A., Pfister, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Xenopus+pronephric+system.">Development of the Xenopus pronephric system.</a> Dev. Biol. 171 (2), 531-540 (1995).</li><li>Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D., Kloc, M., Kubiak, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+12:+The+Xenopus+Pronephros:+A+Kidney+Model+Making+Leaps+toward+Understanding+Tubule+Development.">Chapter 12: The Xenopus Pronephros: A Kidney Model Making Leaps toward Understanding Tubule Development.</a> Xenopus Development. , (2014).</li><li>Taira, M., Otani, H., Jamrich, M., Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+LIM+class+homeobox+gene+Xlim-1+in+pronephros+and+CNS+cell+lineages+of+Xenopus+embryos+is+affected+by+retinoic+acid+and+exogastrulation.">Expression of the LIM class homeobox gene Xlim-1 in pronephros and CNS cell lineages of Xenopus embryos is affected by retinoic acid and exogastrulation.</a> Development. 120, 1525-1536 (1994).</li><li>Weber, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+the+tissue-specific+transcription+factor+HNF1+alpha+(LFB1)+during+Xenopus+development.">Regulation and function of the tissue-specific transcription factor HNF1 alpha (LFB1) during Xenopus development.</a> Int. Dev. Biol. 40 (1), 297-304 (1996).</li><li>Carroll, T. J., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergism+between+Pax-8+and+lim-1+in+embryonic+kidney+development.">Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development.</a> Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).</li><li>Etkin, L. D., Pearman, B., Ansah-Yiadom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+injected+DNA+templates+in+Xenopus+embryos.">Replication of injected DNA templates in Xenopus embryos.</a> Exp. Cell Res. 169 (2), 468-477 (1987).</li><li>Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chloride+conductance+channel+ClC-K+is+a+specific+marker+for+the+Xenopus+pronephric+distal+tubule+and+duct.">The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct.</a> Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).</li><li>Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Na+,+K+-ATPase+alpha+subunit+requires+gastrulation+in+the+Xenopus+embryo.">The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo.</a> Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical &amp; chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).</li><li>Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+functional+role+of+the+cytoskeleton+in+determination+of+the+dorsoventral+axis+in+Xenopus+laevis+eggs.">Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).</li><li>Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastomeres+show+differential+fate+changes+in+8-cell+Xenopus+laevis+embryos+that+are+rotated+90+degrees+before+the+first+cleavage.">Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage.</a> Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).</li><li>Colman, A., Drummond, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stability+and+movement+of+mRNA+in+Xenopus+oocytes+and+embryos.">The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

アフリカツメガエル胚の開発の前腎を標的とすることは識別し、正しい割球を注入することに依存しています。 8細胞胚のV2の割球の注入は、左の前腎18を対象としています。これは、内部​​コントロールとして、反対側の右側前腎を残します。モルホリノは、ノックダウンまたはRNAの過剰発現は、腎臓の発達を変更するために使用されている場合、反対側の右側前?...

アフリカツメガエル胚腎臓、前腎は、腎臓の開発と疾患を研究するための優れたモデルです。胚は、外部開発サイズが大きく、大量に製造することができ、かつ容易に微量注入または外科的処置を介して操作されます。また、哺乳類や両生類における腎臓発生を支配する遺伝子が保存されています。胚両生類は前腎を持っており、大人の両生類は後腎を持っていながら、前腎、中腎、および後腎1：哺乳類の腎臓は三つの段階を経て進行します。これらの腎臓形の基本フィルタリング部はネフロンで、両方の哺乳類や両生類は腎形成2、3を受けるために、同じシグナル伝達カスケードおよび誘導のイベントを必要としている。 アフリカツメガエルの前腎は、近位の単ネフロン、中間遠位端との接続細管が含まれ、 （哺乳動物の糸球体に類似）とグロムス1、4-6（ 図1 </strオング&gt;）。 アフリカツメガエルの前腎に存在する単一の大きなネフロンは腎臓の開発と疾患過程に関与する遺伝子の研究のための単純なモデルとして、それが適しています。 細胞運命マップは初期のアフリカツメガエル胚のために設立され、Xenbase 7-11オンラインで自由にご利用いただけますされています。同技術は、心臓や目などの他の組織を標的とするように適合させることができるが、ここでは、発展途上アフリカツメガエル前腎を対象とする系統のトレーサーのマイクロインジェクションのための技術が記載されています。リネージュトレーサーは、開発中にその細胞の子孫の可視化を可能にする、初期の割球に注入することができる（生体染色色素を含む、蛍光標識されたデキストラン、組織化学的に検出可能な酵素、およびmRNAは、蛍光タンパク質をコードする）ラベルです。このプロトコルは、系統のトレーサーとして膜対象と赤色蛍光タンパク質12をコードする、MEM-RFPのmRNAを利用しています。対象となるマイクロインジェクション技術ここで説明した4および8細胞胚における個々の割球のためのniquesは、目的の遺伝子を過剰発現するように遺伝子発現、または外因性RNAとをノックダウンするモルフォリノの注射のために利用することができます。腹側、植物割球に注入することにより、主に胚の前腎が発育コントロールとして、対前腎を残して、標的にされるであろう。トレーサーの同時注射は正しい割球を注入し、胚における組織ショーは前腎のターゲティングを検証し、注入された割球から生じたかどうかを確認します。前腎の免疫染色は、前腎細管が標的にされているどれだけの可視化を可能にします。過剰発現およびノックダウン効果は、その後発達対照として胚の反対側に対してスコア付けすることができ、前腎指標13を計算するために使用することができます。細胞運命マップの利用可能性は、この標的マイクロインジェクション技術はOTH組織を標的化するために使用されることを可能にしますえー前腎、および蛍光トレーサーの同時注射よりも、各組織を標的とするマイクロインジェクション分析する前に確認することができます。 胚のマイクロインジェクションの間に、発達の温度はアフリカツメガエルの開発の速度が14に大きく依存することを考えると、厳密に調節されるべきです。開発時間が遅くなるため、4および8細胞注射のために - （16°C 14）胚は低い温度でインキュベートされるべきです。 16で3ステージする°Cの開発時間は約4時間である22℃で、3（4細胞）ステージの段階1（1セル）から現像時間は、約2時間です。これは、22℃で8細胞（ステージ4）胚に4細胞期胚から行くのに約15分かかりますが、16℃で約30分かかります。同様に、22℃で、それだけで16細胞期胚（ステージ5）に進むに8細胞期胚のために30分かかります。この時間は、16℃で45分間に増加されます。ザrefore、胚、16細胞期に進行する前に8細胞期での注射のために十分な時間を可能にするために胚の発達の速度を遅くするのに有用です。腎臓が完全に発達するまでさらに、成長温度、速度または遅い胚発生を調節することができます。 オタマジャクシ期アフリカツメガエル胚の表皮は、郭清または組織15のクリアせずに開発する前腎の容易なイメージングを可能にする、比較的透明です。 アフリカツメガエル胚の相対的な透明度に、ライブセルイメージングはまた、16,17実現可能です。前腎 ​​を可視化するために免疫染色ホールマウント近位にラベルを確立する抗体、ステージの中間、遠位端と接続する細管38で可能です- アフリカツメガエル胚18-20における遺伝子発現の標的操作の後に前腎開発の評価を可能にする40の胚。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin solution, 50 mg/mL</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E737-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine, 99%+</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>52-90-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP525-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm x 15 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Fridge II</td>
			<td>Boekel</td>
			<td>260009</td>
			<td>Benchtop incubator for embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gap43-RFP plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine dextran, 10,000 M.W.</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1817</td>
			<td>Tracer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade, USP sterile purified water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-000-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7&#34; Drummond replacement tubes</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/XL</td>
			<td>Microinjection needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>For breaking microinjection needle tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td>Microinjector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, heavy</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CAS 8042-47-5</td>
			<td>Oil for needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G monoject hypodermic needle</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881200508</td>
			<td>For loading mineral oil into microinjection needle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Luer-Lok syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td>For loading mineral oil into microinjection needle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>800 micron polyester mesh</td>
			<td>Small Parts</td>
			<td>CMY-0800-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td>For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plate</td>
			<td>Nest Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>67-42-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP531-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mm x 45 mm screw thread vial</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-339-25B</td>
			<td>For fixing, staining, and storing embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate</td>
			<td>Nest Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzocaine</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>BE130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) 1X powder</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP661-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumen</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D mini rocker, model 135</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>57281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum, New Zealand origin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16210064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S227I-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal 3G8 antibody</td>
			<td>European Xenopus Resource Centre</td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody to label proximal tubules.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal 4A6 antibody</td>
			<td>European Xenopus Resource Centre</td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody to label distal tubule and duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit</td>
			<td>MBL</td>
			<td>PM005</td>
			<td>Primary antibody to label Gap43-RFP tracer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11001</td>
			<td>Secondary antibody to label distal tubule and duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21428</td>
			<td>Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 cavity spot plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl benzoate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>105862500</td>
			<td>Optional - for clearing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl alcohol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A396-500</td>
			<td>Optional - for clearing embryos</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

technique to target microinjection to the developing xenopus kidney

アフリカツメガエル （カエル）の胚腎臓は、前腎は、単一ネフロンから構成されており、腎疾患のモデルとして使用することができる。 アフリカツメガエル胚は、外部開発、大型であり、かつ容易に微量注入または外科的処置によって操作することができます。また、運命のマップは初期のアフリカツメガエル胚のために確立されています。最終的に関心のある器官または組織に上昇を与える個々の割球への標的型マイクロインジェクションは、選択的胚の残りの二次的影響を減少させること、この制限領域内の遺伝子発現を過剰発現またはノックダウンするために使用することができます。このプロトコルでは、我々は4と8細胞胚の特定の割球へのマイクロインジェクションを介して、開発アフリカツメガエルの腎臓（前腎）を、標的とするために設立されたアフリカツメガエルの運命マップを利用する方法について説明します。系統トレーサーの注入は、注入の特異的標的の検証を可能にします。胚は38ステージに開発した後 - 40を、ホールマウント免疫染色は前腎の開発を可視化するために使用され、前腎への標的細胞による寄与を評価することができます。同技術は、前腎に加えて他の組織タイプを標的とするように適合させることができます。

MEM-RFP mRNAと4と8細胞アフリカツメガエル胚のマイクロインジェクションは、前腎への標的の異なるレベルを示す。図4に示すステージ正しいMEM-RFPのmRNAの発現パターンを有する40胚を図 。胚は、左の腹側割球（ 図4A）に注入し、MEM-RFPのmRNAの適切な発現パターンのために選別しました。近位にMEM-RFPを発現していることに加え?...

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Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

開発にターゲットマイクロインジェクションのテクニック<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;腎臓

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

technique-to-target-microinjection-to-the-developing-xenopus-kidney

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

11.1K ビュー.  University of Texas McGovern Medical School. Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos. 

ビデオ: Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

操作と<em&gt;インビトロ</emの&gt;成熟<em&gt;アフリカツメガエル</em細胞質内精子注入し&gt;卵母細胞、胚発生を研究するために

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

発生生物学

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

の共焦点分析を用いました<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt; WntおよびShhのモルフォゲン勾配の調節を調査するために、

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression and activation of signal transduction pathways. This technique allows the delivery of signaling molecules at precisely defined developmental stages for specific times. After this embryos can be harvested and gene expression examined, for example by in situ hybridization, or activation of signal transduction pathways observed with immunostaining.
In this video heparin beads soaked in FGF18 or AG 1-X2 beads soaked in U0126, a MEK inhibitor, are grafted into the limb bud in ovo. This shows that FGF18 induces expression of MyoD and ERK phosphorylation and both endogenous and FGF18 induced MyoD expression is inhibited by U0126. Beads soaked in a retinoic acid antagonist can potentiate premature MyoD induction by FGF18.
This approach can be used with a wide range of different growth factors and inhibitors and is easily adapted to other tissues in the developing embryo.

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

遺伝子発現に影響を​​及ぼすシグナル伝達経路を同定するために、ニワトリ胚手足の開発にビーズのグラフト

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

幹細胞様<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚外植片を早期神経発達の特徴を研究するために<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

脊索動物における胚のマイクロインジェクションやエレクトロポレーション<em&gt;カタユウレイボヤ</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global DNA methylation level of chondrocytes is considered to be a suitable biomarker for the loss of the chondrocyte phenotype. However, results based on different experimental methods can be inconsistent. Therefore, it is important to establish a precise, simple, and rapid method to quantify global DNA methylation levels during chondrocyte dedifferentiation.
Current genome-wide methylation analysis techniques largely rely on bisulfite genomic sequencing. Due to DNA degradation during bisulfite conversion, these methods typically require a large sample volume. Other methods used to quantify global DNA methylation levels include high-performance liquid chromatography (HPLC). However, HPLC requires complete digestion of genomic DNA. Additionally, the prohibitively high cost of HPLC instruments limits HPLC&#39;s wider application.
In this study, genomic DNA (gDNA) was extracted from human chondrocytes cultured with varying number of passages. The gDNA methylation level was detected using a methylation-specific dot blot assay. In this dot blot approach, a gDNA mixture containing the methylated DNA to be detected was spotted directly onto an N+ membrane as a dot inside a previously drawn circular template pattern. Compared with other gel electrophoresis-based blotting approaches and other complex blotting procedures, the dot blot method saves significant time. In addition, dot blots can detect overall DNA methylation level using a commercially available 5-mC antibody. We found that the DNA methylation level differed between the monolayer subcultures, and therefore could play a key role in chondrocyte dedifferentiation. The 5-mC dot blot is a reliable, simple, and rapid method to detect the general DNA methylation level to evaluate chondrocyte phenotype.

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

We present a method to quantify DNA methylation based on the 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We determined the 5-mC levels during chondrocyte dedifferentiation. This simple technique could be used to quickly determine the chondrocyte phenotype in ACI treatment.

軟骨細胞分化のDNAメチル化レベルを定量化する5-mCドットブロットアッセイ<em&gt;インビトロ</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

ゼブラフィッシュの発生における急性腎障害のモデル化のための正確な細胞除去法

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

卵母細胞のマイクロインジェクションによる遺伝子改変マウスの作製

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

紫外C(UV-C)損傷に対する主なマウス眼表面細胞/幹細胞における酸化的損傷の評価

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

キセノプス・レービス胚における眼芽へのDNAのマイクロインジェクションとGFPのイメージングは、無傷で光学軸軸樹園を発現し、生きているキセノプス・タマジャクシ

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

開発にターゲットマイクロインジェクションのテクニック

要約

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この動画の章

操作と

の共焦点分析を用いました

遺伝子発現に影響を及ぼすシグナル伝達経路を同定するために、ニワトリ胚手足の開発にビーズのグラフト

幹細胞様

脊索動物における胚のマイクロインジェクションやエレクトロポレーション

軟骨細胞分化のDNAメチル化レベルを定量化する5-mCドットブロットアッセイ

ゼブラフィッシュの発生における急性腎障害のモデル化のための正確な細胞除去法

卵母細胞のマイクロインジェクションによる遺伝子改変マウスの作製

紫外C(UV-C)損傷に対する主なマウス眼表面細胞/幹細胞における酸化的損傷の評価

キセノプス・レービス胚における眼芽へのDNAのマイクロインジェクションとGFPのイメージングは、無傷で光学軸軸樹園を発現し、生きているキセノプス・タマジャクシ

開発にターゲットマイクロインジェクションのテクニック

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の共焦点分析を用いました

遺伝子発現に影響を​​及ぼすシグナル伝達経路を同定するために、ニワトリ胚手足の開発にビーズのグラフト

幹細胞様

脊索動物における胚のマイクロインジェクションやエレクトロポレーション

軟骨細胞分化のDNAメチル化レベルを定量化する5-mCドットブロットアッセイ

ゼブラフィッシュの発生における急性腎障害のモデル化のための正確な細胞除去法

卵母細胞のマイクロインジェクションによる遺伝子改変マウスの作製

紫外C(UV-C)損傷に対する主なマウス眼表面細胞/幹細胞における酸化的損傷の評価

キセノプス・レービス胚における眼芽へのDNAのマイクロインジェクションとGFPのイメージングは、無傷で光学軸軸樹園を発現し、生きているキセノプス・タマジャクシ

遺伝子発現に影響を及ぼすシグナル伝達経路を同定するために、ニワトリ胚手足の開発にビーズのグラフト