著者は、実りある議論のための技術支援とMerete K. Raarupためのハビエル・E.ガルシアとレネGrønkjærに感謝したいと思います。この作品は、オーフス大学研究財団によって資金を供給されたとサイモンは、財団をスパイ。

実験プロトコルを見直し、オーフス県（M-20100032）の倫理委員会によって承認されました。 レシオメトリック色素の1共焦点顕微鏡の校正<ol><li>画像取得のために、インキュベーター、63X / 1.2-開口数水浸対物レンズ、543 nmのレーザーラインとMETA検出器を備えた倒立型共焦点顕微鏡を使用しています。 </li><li>準備HEPES緩衝原液（0.1 pH単位のステップでpHを4.5から8.5に調整した50mMの、）。蛍光顕微鏡用の透明底96ウェルプレートのウェルに各溶液100μlをピペット。 </li><li>レシオメトリック色素C-SNARF-4を取り扱う際ニトリル手袋を着用してください。ジメチルスルホキシド中の染料の1 mMストック溶液を調製します。 HEPES緩衝液で各ウェルにストック溶液5μlを加えます。顕微鏡上で96ウェルプレートを置きます。 </li><li>顕微鏡の電源をオンにします。顕微鏡ソフトウェアを開きます。次のパネルをクリックします。→レーザーを取得。 →Mを買収icro; →Config]を取得します。 →スキャンを買収。 →ステージを取得します。 37°Cまでインキュベーターをウォームアップ。 </li><li> 543 nmレーザーと「レーザー制御」画面でボタンを「オン」をクリックすることで、543 nmのレーザーラインをオンにします。 「顕微鏡制御」画面で63X / 1.2-開口数水浸対物レンズを選択してください。 </li><li> 661 nmの（赤）の間隔（「構成管理」→「CHS」）へのMETA同時に608-nmの576-内の蛍光を監視するための検出器（緑）、629-を設定します。レーザパワー（「構成管理」→「励起」）を調整します。 1.6ミクロン（「スキャン制御」→「ピンホール」）の光学的スライス厚を得るためのピンホールを設定します。 </li><li> 5μmの96ウェルプレートのガラス底の上に、それぞれのHEPES緩衝液の画像を取得します。注：焦点面がガラス底の下に位置されるとすぐに、何の蛍光が見られません画面上に。すべての第三の画像の後、ゼロにレーザパワーを設定し、背景差分画像を取​​ります。 </li><li>三重での校正実験（1.2から1.7）を実行します。 </li><li>すべての赤と緑の画像の平均蛍光強度と標準偏差を決定します。 <ol><li>式に従って各画像について、比率Rおよび平均値の標準誤差、S Rを計算する （1）及び（2） （1） <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/53622/53622equation1.jpg" /> （2） <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/53622/53622equation2.jpg" /> G、R、S GおよびS rは 、それぞれ緑色および赤色の画像における平均値と標準偏差。Bの G、B rは 、BGとの BRは、背景画像の対応する値は、N。れている。■あります<eM&gt; 2は、撮像されたピクセルの数です。 </li><li>図中の3つの複製の校正実験から各pH値の計算された比率をプロットし、データポイント（ すなわちソフトウェアSigmaPlotの13を使用して）この一連の近似曲線を構築します。 pH値10に比率を変換することができ近似曲線から数学関数を作成します。 </li></ol></li></ol> でその場グロウン歯科バイオフィルムサンプルの2コレクション<ol><li>研究に関連する基準及び除外基準を満たすボランティアを選択します。その上下の歯列弓のアルギン酸塩印象を作ります。これらの感想からキャストモデルを作成し、下顎にアクリルスプリントを製造しています。ボランティアは正常咬合12に食い込むことができます舌側歯科矯正ワイヤーで接続された頬アクリルフランジとスプリントを設計します。 </li><li>アクリルスプリントの頬フランジにおけるドリル景気後退（ 図1 </strong&gt;）、歯科用アクリルバリの助けを借りて、バイオフィルムコレクション用ガラススラブの挿入を​​可能にします。凹部の幅と長さが挿入されるガラススラブの数に応じて変化し得るが凹部の深さは、1.5mm以上であるべきです。 </li><li>バイオフィルムの収集のために、自然のエナメル質11上のコロニー形成パターンを模倣するためにグリット1200の表面粗さを持つカスタムメイドの非蛍光ガラススラブ（4×4×1ミリメートル3）を使用します。 </li><li>取り付けの前にオートクレーブ処理によりガラススラブを滅菌します。少し頬11の移動によって及ぼされる剪断力からバイオフィルムを保護するためにアクリル面の表面に凹状各側の頬フランジにおける窪みに粘着性ワックスでガラススラブをマウントします。 注：不況に配置されたガラススラブの数は、研究の目的に応じて、3と14の間で変化してもよいです。 </li><li>ボランティアの口の中に器具を挿入します。 volunに指示TEERは、実験期間を通して口腔内のアプライアンスを保持します。湿った紙組織片と歯列矯正リテーナー容器内のアプライアンスを格納するためのボランティアを指示歯磨きや食料や水以外の飲料の摂取時に室温で（多湿それを維持するため）。アプライアンスを配置し、除去しながらガラススラブと頬アクリルフランジに触れないようにボランティアを指示します。 注意：実験期間は、研究（数週間に1日）の目的に応じて変えることができます。 </li><li>慎重に実験期間の終了時にアプライアンスからガラススラブを削除します。ナイフでスラブの周囲に粘着性のワックスを削除し、顕微鏡分析まで、密閉容器、上向きにバイオフィルムをピンセットでそれらを転送します。湿った紙組織と湿度の高い容器を保管してください。バイオフィルムの収集後数時間内のpHの撮影を行います。 </li></ol> 3.バイオフィルムのpHイメージング<ol><li>準備しますデ・ヨングらの方法に従って収集唾液にジチオスレイトールを添加することにより唾液ソリューション。13。 pHを7.0に唾液液を滴定し、0.4％（重量/容量）の濃度にグルコースを追加します。バイオフィルムあたりピペットで100μlを顕微鏡用ガラス底96ウェルプレートに分析されます。ウェルあたりレシオメトリック色素の5μlを添加します。 </li><li>顕微鏡ステージ上の96ウェルプレートを置きます。顕微鏡および543 nmレーザーラインをオンにします。 37°Cまでインキュベーターをウォームアップ。染料のキャリブレーションと同じ顕微鏡の設定を使用します（手順1.5から1.6を参照）。 96ウェルプレートが作動温度に達するまで、30分間待ちます。 </li><li>ピンセットのスリムなセットで一つ以上のガラススラブをピックアップし、唾液で満たされたウェルに配置し、ウェルあたり1スラブ、下向きにバイオフィルム付き。 </li><li>単一の画像を取得する（「スキャン制御」→「シングル」）またはz-スタック（「スキャン制御」→「スタート」）spanniさまざまな分野でのバイオフィルムの深さをngの。 zスタックを取得するには（「スキャン制御」→「Z設定」→「民スライス」）スライス数が撮像されることを選択し、顕微鏡ソフトウェア（「スキャンコントロール内の最初と最後のスライスのz位置をマーク&quot;→&quot; Z設定」→「マーク・ファースト &quot;;&quot;マークラスト」）。 注：最高75ミクロンの深さZ-スタックは、細胞外および細胞内領域との間の良好なコントラストで取得することができます。 </li><li> （「スキャン制御」→ &quot;を顕微鏡ソフトウェア（「ステージとフォーカス制御」→「マーク順位」）でのxy位置をマークし、時間をかけて見るの顕微鏡視野内のpHの変化に追従し、連続した時点で繰り返し画像を撮影するために、シングル&quot;）。定期的にバックグラウンド減算のためにゼロに設定レーザパワーで画像を撮影します。 </li></ol> 4.デジタル画像解析<ol><li>万博へRT TIFファイルとして顕微鏡画像は、顕微鏡ソフトウェア（「マクロ」→「ファイルの一括エクスポート」）のファイルの一括エクスポートを使用します。マーク・エクスポートおよびTIF-ファイルなどの別のフォルダにある赤と緑のチャンネル画像を保存するファイルが（「バッチエクスポートを開始します」）。彼らに連続番号を与える両方のフォルダ内のファイルの名前を変更します。 </li><li>このようなdaime（微生物生態学におけるデジタル画像解析）14などのソフトウェアに赤と緑の画像シリーズをインポートします。セグメント個別に選択した明るさの閾値と緑のチャネル画像（自動セグメンテーション→カスタムしきい値→セグメント）。すべての細菌が（細胞外マトリックスよりも明るい）ではなく、マトリックスは、セグメンテーション中のオブジェクトとして認識されるように、ケア（一般的に20と80の間）で明るさのしきい値を選択します。オブジェクトとして認識された領域は、細菌バイオマスによく対応していることを視覚的に確認してください。 </li><li>セグメント化されたグラムのオブジェクト層を移し対応する赤チャンネルの画像にREENチャネル画像（セグメント→転送オブジェクト層）。赤と緑のチャネル画像内のすべてのオブジェクトを拒否し、削除するには、オブジェクトエディタ機能を使用してください。今だけ、細胞外マトリックスは、バイオフィルムの画像に残されています。 TIFファイルとして処理された画像シリーズをエクスポートします。 </li><li> （; v.1.47 http://rsb.info.nih.gov/ij）のImageJに画像シリーズをインポートします。レーザーで撮影した背景画像の平均蛍光強度を決定する（→ヒストグラムを分析）オフ。赤と緑の画像（数学→減算→プロセス）から適切なバックグラウンドを減算します。 </li><li>それでもImageJの中で、それ自体で緑の画像シリーズ（G1）（プロセス→イメージ計算）を分割します。そして、緑の画像シリーズ（G1）で得られた画像シリーズ（G2）を掛けます。これはNaNにはdaimeにオブジェクトとして認識された領域に属する全ての画素に割り当てられている画像シリーズ（G3）を、得られます。トンに進んでください彼赤の画像シリーズと同じように（R1 / R1 = R2、R2、X、R1 = R3）。 注：細菌バイオマスは、ステップ4.3の画像から削除されたように、蛍光強度は、これらの領域で0です。ステップ4.5は、ステップ4.6で比率計算を可能にするのNaNに値0を変換する必要があります。 </li><li>検出器ノイズを補償するために、：; &#39;平均&#39;フィルタ（1ピクセル半径の平均→プロセス→フィルター）を適用します。赤の画像シリーズ（プロセス→画像計算）によって緑色映像シリーズを分割します。これは画像の外空間内のすべての残りのピクセルの緑/赤比になります。画像（イメージ→ルックアップテーブル）における比率のグラフ表示のための偽のカラーリングを使用してください。各画像の平均比率を計算する（ヒストグラム→分析）。 </li><li>緑/赤比）は1.9.2の下に取り付けられた機能に応じてpH値に変換します。注：キャリブレーションデータと近似曲線の例はSchlafer らに見ることができますら、2015年11。 </li></ol>

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	<li>Hunter, R. C., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+pH-sensitive+fluoroprobe+(C-SNARF-4)+for+pH+microenvironment+analysis+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).</li><li>Takahashi, N., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caries+ecology+revisited:+microbial+dynamics+and+the+caries+process.">Caries ecology revisited: microbial dynamics and the caries process.</a> Caries Res. 42 (6), 409-418 (2008).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+landscapes+in+a+novel+five-species+model+of+early+dental+biofilm.">pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm.</a> PLoS. One. 6 (9), e25299 (2011).</li><li>von Ohle, O. 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H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+oral+Streptococcus+species+and+Actinomyces+viscosus+in+human+saliva.">Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva.</a> Appl. Environ. Microbiol. 47 (5), 901-904 (1984).</li><li>Daims, H., Lucker, S., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daime,+a+novel+image+analysis+program+for+microbial+ecology+and+biofilm+research.">daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research.</a> Environ. Microbiol. 8 (2), 200-213 (2006).</li><li>Liu, Y. L., Nascimento, M., Burne, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+toward+understanding+the+contribution+of+alkali+generation+in+dental+biofilms+to+inhibition+of+dental+caries.">Progress toward understanding the contribution of alkali generation in dental biofilms to inhibition of dental caries.</a> Int. J Oral Sci. 4 (3), 135-140 (2012).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

バイオフィルムのpHの微小モニタリング電極又は微小電極の測定4-6と比較して、いくつかの利点を提供します。顕微鏡技術は、高い空間分解能でpHを決定し、機械的にバイオフィルムを乱すことなく、バイオフィルムの両方の水平および垂直のpH勾配を捕捉できるように許可します。微視的なpHモニタリングのこれまでの試みは、しかし、バイオフィルム1,7,9に外および細胞内pH...

ここに記載された方法は、共焦点レーザー走査顕微鏡と組み合わせて、レシオメトリック色素seminaphthorhodafluor-4F 5-（および6）を使用して、4.5と7の間の範囲内の歯科バイオフィルム中のカルボン酸（C-SNARF-4）の細胞外のpHをモニターし、できデジタル画像解析。採用蛍光色素はpH感受性であり、プロトン化の状態に応じて、その蛍光発光の変化を表示します。 580 nmでのプロトン化分子のピークの蛍光発光、及び640nmの1での脱プロトン化分子の発光。 2つの発光ピークを含む二つの検出窓における蛍光発光強度の比は、（576 - 608 nmで629 - 661 nm）はこのようにかかわらず、染料濃度の、液相のpHを反映します。 〜6.4 のpKaを有する色素が適度に酸性の環境のpHを視覚化するのに適しています。 細菌バイオフィルム中のPHは、すべての代謝プロセスのための中心的な重要性です。歯のバイオフィルムの場合には、細胞外マトリックス中のpHは、虫歯の開発のための重要な病原性因子です。バイオフィルム歯インタフェースリードでの低pHの拡張期間が根底にあるエナメル質2の脱灰を遅らせることを意味します。有機酸を含むバイオフィルム、代謝産物の複雑な3次元構造に、均一にバイオフィルム全体に分散されていません。非常に少ない酸産生微小環境は、空間的に近接3に見出すことができます。 何十年もの間、バイオフィルムの縦pH勾配は、微小電極4-6の助けを借りて記録しました。彼らは、小さなチップサイズのための良好な空間分解能を提供していますが、彼らは水平勾配を監視する非常に適していません。また、電極の挿入は、機械的に、バイオフィルムを乱します。定量的蛍光顕微鏡技術は、機械的な干渉なしに、バイオフィルムの異なる領域におけるpH変化を可視化するという利点を提供しますNCE。ビューの異なる顕微鏡視野を自由に選択し、長期間1,7-9にわたって繰り返し撮像することができます。顕微鏡バイオフィルムの画像を解釈するときしかし、細胞外空間から派生微生物バイオマス及び蛍光に由来する蛍光を区別することが重要です。細菌が活発にアデノシン三リン酸10を犠牲にし、それらの細胞膜を横切ってプロトンを輸送するように酸性条件下では、細菌細胞内部のpHは、細胞外マトリックス中のpHと異なっています。低細胞外pHは脱灰につながる一方、虫歯の文脈において、細胞内細菌のpHが根底にあるエナメル質に直接影響を持っていません。細菌フリーエリアと細菌の両方を含む顕微鏡画像で平均化pHは、誤った結果につながります。細菌バイオマスを視覚化し、細胞外および細胞内領域を区別するために、pH感受性色素と一緒に他の汚れの使用は、ABをもたらします11外空間と偽の測定値の蛍光汚染のリスクアウト。 本原稿は、したがって、二重の機能でレシオメトリック色素の使用を記載します。 pHをマーカーとしておよびユニバーサル細菌染色の両方。染料は、細菌細胞中に濃縮ように、共焦点顕微鏡画像で正確なデジタル画像分析手順の組み合わせは4.5と細い歯科用バイオフィルムにおける7.0の範囲の外のpHを測定することができます。

<table><tbody><tr><td>Zeiss LSM 510 META</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>C-Apochromat 63X water immersion objective</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>XL Incubator</td><td>PeCON</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid</td><td>Life Technologies</td><td>S23920</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Life Technologies</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11344-041</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96-well black clear-bottom plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-567</td><td></td></tr><tr><td>Custom-made glass slabs (4 x 4 x 1 mm&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;; 1,200 grit)</td><td>Menzel</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Alginate impression material</td><td>GC Corporation</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs</td><td>Axis Dental</td><td>LS-906</td><td></td></tr><tr><td>Orthodontic retainer containers</td><td>Spark Medical Equipment Co., Ltd</td><td>SK-WDTC01</td><td></td></tr><tr><td>Sticky wax</td><td>Dentsply</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Chewing paraffin wax&amp;nbsp;</td><td>Ivoclar Vivadent AG</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632</td><td>Used during preparation of salivary solution</td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m and 0.2 &amp;micro;m syringe filters</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS431220; CLS431219&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>daime</td><td>University of Vienna, Austria</td><td>http://dome.csb.univie.ac.at/daime</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH, Bethesda, Maryland, USA</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr></tbody></table>

ratiometric imaging of extracellular ph in dental biofilms

歯に細菌のバイオフィルム中のpHは、虫歯のための中心的な重要性の高い世界的な罹患率と疾患です。栄養素および代謝物は、歯科用バイオフィルム中に均一に分散されていません。バイオフィルム中の有機物との吸着、反応の複雑な相互作用は、溶質の拡散経路が減少し、バイオフィルムを横切って、有機酸を含む反応性分子の急な勾配を、作成します。このような蛍光寿命イメージングまたはpH ratiometryとして定量的な蛍光顕微鏡法は、歯のバイオフィルムの異なる微小環境のpHを可視化するために使用することができます。 pH ratiometryは、pH感受性色素の蛍光発光におけるpH依存性のシフトを利用します。二つの異なる波長での発光比率の計算は関係なく、染料の濃度の、顕微鏡像で局所的なpHを決定することができます。技術の微小電極に反して、リアルタイムに垂直と水平の両方のpH勾配を監視することができうち機械的にバイオフィルムを乱します。しかし、ケアは、バイオフィルムの細胞外および細胞内区画の間を正確に区別するために注意しなければなりません。ここでは、レシオメトリック色素、seminaphthorhodafluor-4F 5-（および-6）カルボン酸（C-SNARF-4）は、未知の種組成の歯のバイオフィルム成長のin vivoでの細胞外のpHを監視するために使用されます。染料をグルコースに暴露されるまで濃縮したバイオフィルム内のすべての細菌細胞の内部にあります。したがって、ユニバーサル細菌染色ように外pHのマーカーとしても使用されます。共焦点顕微鏡画像を取得した後、細菌バイオマスは専ら外pHを計算することを可能にするデジタル画像解析ソフトウェアを使用して、すべての画像から除去されます。レシオメトリック色素とのpH ratiometryは、最大75ミクロンの厚さの薄いバイオフィルムで外pHを研究するためによく適しているが、4.5と7.0の間のpH範囲に限定されています。

提示された方法は、細胞外pHがリアルタイムで4.5〜7のpH範囲で歯科バイオフィルムの異なる微小環境に低下監視できます。上記のように実験条件が選択されている場合は、pHがまもなくグルコースに暴露した後のバイオフィルムのすべての分野で低下し始めます。 バイオフィルム内のpHが低下するとレシオメトリック色素?...

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Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

歯科バイオフィルムにおける細胞外のpHのレシオメトリックイメージング

pH感受性レシオメトリック色素は、リアルタイムでの歯科バイオフィルム中の細胞外のpHを監視するために、共焦点レーザー走査顕微鏡とデジタル画像解析と組み合わせて使用​​されます。

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

ratiometric-imaging-of-extracellular-ph-in-dental-biofilms

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K ビュー.  Aarhus University.  pH感受性レシオメトリック色素は、リアルタイムでの歯科バイオフィルム中の細胞外のpHを監視するために、共焦点レーザー走査顕微鏡とデジタル画像解析と組み合わせて使用​​されます。 

ビデオ: Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

The development of fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically encoded and synthetic fluorophores with sensing abilities allowed the visualization of biologically relevant species with high spatial and temporal resolution. Synthetic dyes are of particular interest thanks to their high tunability and the wide range of measureable analytes. However, these molecules suffer several limitations related to small molecule behavior (poor solubility, difficulties in targeting, often no ratiometric imaging allowed). In this work we introduce the development of dendrimer-based sensors and present a procedure for pH measurement in vitro, in living cells and in vivo. We choose dendrimers as ideal platform for our sensors for their many desirable properties (monodispersity, tunable properties, multivalency) that made them a widely used scaffold for several biomedical devices. The conjugation of fluorescent pH indicators to the dendrimer scaffold led to an enhancement of their sensing performances. In particular dendrimers exhibit reduced cell leakage, improved intracellular targeting and allow ratiometric measurements. These novel sensors were successfully employed to measure pH in living HeLa cells and in vivo in mouse brain.

Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

Fluorescence sensors are powerful tools in life science. Here we describe a methodology to synthesize and use dendrimer-based fluorescent sensors to measure pH in living cells and in vivo. The dendritic scaffold enhances the properties of conjugated fluorescent dyes leading to improved sensing properties.

合成、細胞の配送および<em&gt;インビボ</em&gt;デンドリマーベースのpHセンサの応用

The development of  fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically  encoded and synthetic fluorophores with sensing ...

化学

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and composition 1, 2. In general, biofilms develop from initial microbial attachment on a surface followed by formation of cell clusters (or microcolonies) and further development and stabilization of the microcolonies, which occur in a complex extracellular matrix. The majority of biofilm matrices harbor exopolysaccharides (EPS), and dental biofilms are no exception; especially those associated with caries disease, which are mostly mediated by mutans streptococci 3. The EPS are synthesized by microorganisms (S. mutans, a key contributor) by means of extracellular enzymes, such as glucosyltransferases using sucrose primarily as substrate 3.
Studies of biofilms formed on tooth surfaces are particularly challenging owing to their constant exposure to environmental challenges associated with complex diet-host-microbial interactions occurring in the oral cavity. Better understanding of the dynamic changes of the structural organization and composition of the matrix, physiology and transcriptome/proteome profile of biofilm-cells in response to these complex interactions would further advance the current knowledge of how oral biofilms modulate pathogenicity. Therefore, we have developed an analytical tool-box to facilitate biofilm analysis at structural, biochemical and molecular levels by combining commonly available and novel techniques with custom-made software for data analysis. Standard analytical (colorimetric assays, RT-qPCR and microarrays) and novel fluorescence techniques (for simultaneous labeling of bacteria and EPS) were integrated with specific software for data analysis to address the complex nature of oral biofilm research.
The tool-box is comprised of 4 distinct but interconnected steps (Figure 1): 1) Bioassays, 2) Raw Data Input, 3) Data Processing, and 4) Data Analysis. We used our in vitro biofilm model and specific experimental conditions to demonstrate the usefulness and flexibility of the tool-box. The biofilm model is simple, reproducible and multiple replicates of a single experiment can be done simultaneously 4, 5. Moreover, it allows temporal evaluation, inclusion of various microbial species 5 and assessment of the effects of distinct experimental conditions (e.g. treatments 6; comparison of knockout mutants vs. parental strain 5; carbohydrates availability 7). Here, we describe two specific components of the tool-box, including (i) new software for microarray data mining/organization (MDV) and fluorescence imaging analysis (DUOSTAT), and (ii) in situ EPS-labeling. We also provide an experimental case showing how the tool-box can assist with biofilms analysis, data organization, integration and interpretation.

Biofilms formed on tooth surfaces are highly complex and exposed to constant innate and exogenous environmental challenges, which modulate their architecture, physiology and transcriptome. We developed a toolbox to examine the composition, structural organization and gene expression of oral biofilms, which can be adapted to other areas of biofilm research.

オーラルバイオフィルムの包括的、生化学的構造とトランスクリプトーム評価のための分析ツールボックスは、ミュータンス連鎖球菌によって仲介

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

免疫・感染学

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

In vitro Monitoring of Extracellular pH in Real-Time

Early accumulation of neutrophils (PMN) is a hallmark of acute intestinal inflammation. This acute inflammation is either resolved or progresses to chronic inflammation. Without efficient PMN clearance at sites of infiltration, PMN can accumulate and contribute to chronic inflammatory conditions, including the intestinal diseases ulcerative colitis (UC) and Crohn's Disease (CD). The pH in the distal colon in individuals with active UC can range between a pH of 5 and 6, whereas healthy individuals maintain colonic pH in the range of 6.8-7.4. Extracellular pH has been shown to influence both intestinal epithelial cells and the infiltrating immune cells. More specifically, extracellular acidosis significantly impacts PMN. At pH below 6.5, there are increases in the production of H2O2, inhibition of apoptosis, and increases in the functional lifespan of PMN. Given the significant presence of PMN and extracellular acidification at sites of inflammation, we developed a novel model that allows for the monitoring of extracellular pH during PMN transepithelial migration in real time. Here, we describe this model and how it can be utilized to measure both the apical and basal pH during PMN trafficking. This model can be utilized to monitor extracellular pH under a wide range of conditions; including, hypoxia, PMN transepithelial migration, and for extended periods of time.

<meta charset="utf8"></head><body>細胞外pHのリアルタイムモニタリング

This article represents a useful in vitro assay to measure changes in extracellular pH during neutrophil (PMN) transepithelial migration (TEM)

インビトロ 細胞外pHのリアルタイムモニタリング

Early accumulation of neutrophils (PMN) is a hallmark of acute intestinal inflammation. This acute inflammation is either resolved or progresses to ...

生化学

High Spatial Resolution Chemical Imaging of Implant-Associated Infections with X-ray Excited Luminescence Chemical Imaging Through Tissue

Microbial infections associated with implantable medical devices are a major concern in fracture fixation failure. Early diagnosis of such infection will allow successful eradication with antibiotics without an extra cost for a second surgery. Herein, we describe XELCI as a technique with high X-ray resolution, implant specificity, and chemical sensitivity to noninvasively image chemical concentrations near the surface of implanted medical devices. The devices are coated with chemically reporting surfaces. This chemically responsive surface consists of two layers coated on an implantable medical device; a pH-sensitive layer (bromothymol blue or bromocresol green incorporated hydrogel) which is coated over a red-light emitting scintillator (Gd2O2S: Eu) layer for monitoring. A focused X-ray beam irradiates a spot on the implant, and the red light generated by the scintillator (with 620 nm and 700 nm peaks) is transmitted through the sensing layer which alters the spectral ratio depending on the pH. An image is generated by scanning the X-ray beam across the implant and measuring the spectral ratio of light passing through the tissue point-by-point. We used this imaging technique for monitoring implant-associated infections previously on the bone surface of the femur with a modified implantable plate sensor. Now we are studying pH changes that occur from tibial intramedullary rod infections. Two different types of intramedullary rod designs are used in pre-pilot rabbit studies, and we learned that the XELCI technique could be used to monitor any chemical changes that occur not only on the bone surface but also inside the bone. Thus, this enables noninvasive, high spatial resolution, low background local pH imaging to study implant-associated infection biochemistry.

Here, we present a protocol for high-resolution optical detection of chemical information around implanted medical devices with X-ray excited luminescence chemical imaging (XELCI). This novel imaging technique is developed in our lab which enables studying implant-associated infection biochemistry.

X線励起発光によるインプラント関連感染症の高空間分解能化学イメージング 組織イメージング

Microbial infections associated with implantable medical devices are a major concern in fracture fixation failure. Early diagnosis of such infection will ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いて糸状菌コロニー上の細菌のバイオフィルムの定性的マルチスケール解析のための新しい方法

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular compartment where the killing and digestion of engulfed particles take place, is the main arena for neutrophil pathogen killing that requires tight regulation. Phagosomal pH is one aspect that is carefully controlled, in turn regulating antimicrobial protease activity. Many fluorescent pH-sensitive dyes have been used to visualize the phagosomal environment. S-1 has several advantages over other pH-sensitive dyes, including its dual emission spectra, its resistance to photo-bleaching, and its high pKa. Using this method, we have demonstrated that the neutrophil phagosome is unusually alkaline in comparison to other phagocytes. By using different biochemical conjugations of the dye, the phagosome can be delineated from the cytoplasm so that changes in the size and shape of the phagosome can be assessed. This allows for further monitoring of ionic movement.

This manuscript describes a simple method to measure the phagosomal pH and area as well as the cytoplasmic pH of human and mouse neutrophils using the ratiometric indicator seminaphthorhodafluor (SNARF)-1, or S-1. This is achieved using live-cell confocal fluorescence microscopy and image analysis.

レシオメトリックpH指示薬を使用して好中球ファゴソームと細胞質のイメージング

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, periodontitis, mucosal infections and, most notably, early childhood caries. In all of these conditions, the pH in the biofilm matrix impacts microbe-host interactions and thus the disease progression. The present protocol describes a confocal microscopy-based method to monitor pH dynamics inside cross-kingdom biofilms comprising Candida albicans and Streptococcus mutans. The pH-dependent dual-emission spectrum and the staining properties of the ratiometric probe C-SNARF-4 are exploited to determine drops in pH in extracellular areas of the biofilms. Use of pH ratiometry with the probe requires a meticulous choice of imaging parameters, a thorough calibration of the dye, and careful, threshold-based post-processing of the image data. When used correctly, the technique allows for the rapid assessment of extracellular pH in different areas of a biofilm and thus the monitoring of both horizontal and vertical pH gradients over time. While the use of confocal microscopy limits Z-profiling to thin biofilms of 75 &#181;m or less, the use of pH ratiometry is ideally suited for the noninvasive study of an important virulence factor in cross-kingdom biofilms.

The protocol describes the cultivation of cross-kingdom biofilms consisting of Candida albicans and Streptococcus mutans and presents a confocal microscopy-based method for the monitoring of extracellular pH inside these biofilms.

共焦点顕微鏡を用いたクロスキングダムバイオフィルムの細胞外pHのモニタリング

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH (pHi) is influenced by many ion transporters and thus monitoring pHi is a useful tool for assessing transporter activity. Modern Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs) provide optical quantification of pHi in intact cells on a cellular and subcellular scale. This protocol describes real-time quantification of cellular pHi regulation in Malpighian Tubules (MTs) of Drosophila melanogaster through ex vivo live-imaging of pHerry, a pseudo-ratiometric GEpHI with a pKa well-suited to track pH changes in the cytosol. Extracted adult fly MTs are composed of morphologically and functionally distinct sections of single-cell layer epithelia, and can serve as an accessible and genetically tractable model for investigation of epithelial transport. GEpHIs offer several advantages over conventional pH-sensitive fluorescent dyes and ion-selective electrodes. GEpHIs can label distinct cell populations provided appropriate promoter elements are available. This labeling is particularly useful in ex vivo, in vivo, and in situ preparations, which are inherently heterogeneous. GEpHIs also permit quantification of pHi in intact tissues over time without need for repeated dye treatment or tissue externalization. The primary drawback of current GEpHIs is the tendency to aggregate in cytosolic inclusions in response to tissue damage and construct over-expression. These shortcomings, their solutions, and the inherent advantages of GEpHIs are demonstrated in this protocol through assessment of basolateral proton (H+) transport in functionally distinct principal and stellate cells of extracted fly MTs. The techniques and analysis described are readily adaptable to a wide variety of vertebrate and invertebrate preparations, and the sophistication of the assay can be scaled from teaching labs to intricate determination of ion flux via specific transporters.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Cellular ion transport can often be assessed by monitoring intracellular pH (pHi). Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs)&#160;provide optical quantification of intracellular pH in intact cells. This protocol details the quantification of intracellular pH through cellular ex vivo live-imaging of Malpighian tubules of Drosophila melanogaster with pHerry, a pseudo-ratiometric genetically encoded pH-indicator.

蛍光遺伝子にコードされた pH インジケーターとキイロショウジョウバエのマルピギー氏管の上皮細胞で光の定量化の細胞内 pH

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

歯科バイオフィルムにおける細胞外のpHのレシオメトリックイメージング

要約

さらに動画を探す

合成、細胞の配送および

オーラルバイオフィルムの包括的、生化学的構造とトランスクリプトーム評価のための分析ツールボックスは、ミュータンス連鎖球菌によって仲介

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

インビトロ細胞外pHのリアルタイムモニタリング

インビトロ細胞外pHのリアルタイムモニタリング

X線励起発光によるインプラント関連感染症の高空間分解能化学イメージング組織イメージング

共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いて糸状菌コロニー上の細菌のバイオフィルムの定性的マルチスケール解析のための新しい方法

レシオメトリックpH指示薬を使用して好中球ファゴソームと細胞質のイメージング

共焦点顕微鏡を用いたクロスキングダムバイオフィルムの細胞外pHのモニタリング

蛍光遺伝子にコードされた pH インジケーターとキイロショウジョウバエのマルピギー氏管の上皮細胞で光の定量化の細胞内 pH

歯科バイオフィルムにおける細胞外のpHのレシオメトリックイメージング

要約

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合成、細胞の配送および

オーラルバイオフィルムの包括的、生化学的構造とトランスクリプトーム評価のための分析ツールボックスは、ミュータンス連鎖球菌によって仲介

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

インビトロ 細胞外pHのリアルタイムモニタリング

インビトロ 細胞外pHのリアルタイムモニタリング

X線励起発光によるインプラント関連感染症の高空間分解能化学イメージング 組織イメージング

共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いて糸状菌コロニー上の細菌のバイオフィルムの定性的マルチスケール解析のための新しい方法

レシオメトリックpH指示薬を使用して好中球ファゴソームと細胞質のイメージング

共焦点顕微鏡を用いたクロスキングダムバイオフィルムの細胞外pHのモニタリング

蛍光遺伝子にコードされた pH インジケーターとキイロショウジョウバエのマルピギー氏管の上皮細胞で光の定量化の細胞内 pH

インビトロ細胞外pHのリアルタイムモニタリング

インビトロ細胞外pHのリアルタイムモニタリング

X線励起発光によるインプラント関連感染症の高空間分解能化学イメージング組織イメージング