Gli autori desiderano ringraziare Javier E. Garcia e Lene Grønkjær per l&#39;assistenza tecnica e Merete K. Raarup per le discussioni fruttuose. Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione Aarhus University Research e Simon Spies Fondazione.

Il protocollo sperimentale è stato esaminato e approvato dal Comitato Etico di Aarhus County (M-20.100.032). 1. confocale microscopica calibrazione del Raziometrico Dye <ol><li> Per l&#39;acquisizione delle immagini, utilizzare un microscopio invertito confocale equipaggiato con un incubatore, un obiettivo ad immersione dell&#39;acqua apertura 63X / 1.2-numerica, una linea laser 543 nm e un rivelatore META. </li><li> Preparare tampone HEPES soluzioni madre (50 mm, portata a pH 4.5-8.5 in passi di unità 0,1 pH). Dispensare 100 ml di ogni soluzione nei pozzetti di una chiara-bottom piastra a 96 pozzetti per la microscopia a fluorescenza. </li><li> Indossare guanti di nitrile quando si maneggia il colorante raziometrica C-SNARF-4. Preparare una 1 mM soluzione madre del colorante in dimetilsolfossido. Aggiungere 5 ml di soluzione madre di ogni pozzetto con tampone HEPES. Posizionare la piastra a 96 pozzetti sul microscopio. </li><li> Accendere il microscopio. Aprire il software microscopio. Clicca i seguenti pannelli: Acquisire → Laser; Acquisire → MICRO; Acquisire → Config; Acquisire → Scan; Acquisire → Stage. Riscaldare l&#39;incubatore a 37 ° C. </li><li> Accendere la linea laser 543 nm cliccando sul laser a 543 nm e il tasto &quot;On&quot; nella finestra &quot;Controllo Laser&quot;. Scegliere l&#39;obiettivo di immersione in acqua apertura 63X / 1.2-numerico nella finestra &quot;Microscope Control&quot;. </li><li> Impostare il rilevatore META di monitorare simultaneamente la fluorescenza all&#39;interno 576- a 608 nm (verde) e 629- a 661 nm intervalli di (RED) ( &quot;Controllo Configurazione&quot; → &quot;ChS&quot;). Regolare la potenza del laser ( &quot;Controllo Configurazione&quot; → &quot;eccitazione&quot;). Impostare il foro stenopeico per produrre uno spessore fetta ottica di 1,6 micron ( &quot;Scan Control&quot; → &quot;Pinhole&quot;). </li><li> Acquisire un&#39;immagine di ogni soluzione tampone HEPES, 5 micron sopra il fondo di vetro della piastra a 96 pozzetti. Nota: Appena il piano focale è situato sotto il fondo di vetro, nessuna luce fluorescente può essere vistosullo schermo. Dopo ogni terza immagine, impostare la potenza del laser a zero e prendere una immagine di sfondo sottrazione. </li><li> Eseguire l&#39;esperimento di calibrazione in triplice copia (1,2-1,7). </li><li> Determinare l&#39;intensità della fluorescenza media e deviazione standard in tutte le immagini rosse e verdi. <ol><li> Calcolare il rapporto R ed errore standard della media, S R, per ogni immagine in base alle equazioni (1) e (2) (1) <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/53622/53622equation1.jpg" /> (2) <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/53622/53622equation2.jpg" /> g, r, s g e s r sono le medie e le deviazioni standard nei rispettivi immagini verde e rosso. b g, b R, S bg e s br sono i valori corrispondenti per le immagini di sfondo. n <em&gt; 2 è il numero di pixel imaged. </li><li> Tracciare i rapporti calcolati per ciascun valore di pH dei tre esperimenti di calibrazione replica in un diagramma e costruire una curva montato da questa serie di punti dati (vale a dire utilizzando il software SigmaPlot 13). Fare una funzione matematica dalla curva montato in grado di convertire i rapporti in valori di pH 10. </li></ol></li></ol> 2. Raccolta di In Situ Grown dentale biofilm Campioni <ol><li> Selezionare volontari che soddisfano i criteri di inclusione ed esclusione rilevanti per lo studio. Fare impressioni alginato di loro arcata dentaria superiore e inferiore. Fare modelli del cast da queste impressioni e produzione di una stecca acrilico nella mandibola. Progettare la stecca con flange acrilici buccali collegati da un filo ortodontico linguale che permette al volontario di mordere normale occlusione 12. </li><li> Recessioni Drill nelle flange buccali della stecca acrilico (Figura 1 </strong&gt;) Con l&#39;aiuto di frese acriliche dentali per consentire l&#39;inserimento di lastre di vetro per la raccolta biofilm. La profondità delle recessioni deve essere di almeno 1,5 mm, mentre la larghezza e la lunghezza delle recessioni possono variare a seconda del numero di lastre di vetro da inserire. </li><li> Per la raccolta biofilm, lastre su misura non fluorescenti di vetro (4 x 4 x 1 mm 3) con una rugosità superficiale di graniglia 1200 al fine di imitare il modello di colonizzazione su smalto naturale 11. </li><li> Sterilizzare le lastre di vetro in autoclave prima del montaggio. Montare le lastre di vetro con cera collante nelle depressioni nelle flange buccali di ciascun lato leggermente incassati alla superficie della superficie acrilica per proteggere il biofilm da forze di taglio esercitate dal movimento delle guance 11. Nota: Il numero di lastre di vetro disposte in recessione può variare tra 3 e 14, a seconda dello scopo dello studio. </li><li> Inserire l&#39;apparecchio in bocca del volontario. Istruire il VolunTeer di mantenere l&#39;apparecchio intra-orale per tutto il periodo sperimentale. Istruire il volontario per immagazzinare l&#39;apparecchio in un contenitore fermo ortodontico con un pezzo di tessuto carta bagnata (per mantenerlo umido) a temperatura ambiente durante lo spazzolamento dei denti e l&#39;assunzione di cibo e bevande diverse dall&#39;acqua. Istruire il volontario a non toccare le flange acrilici buccali con le lastre di vetro durante l&#39;inserimento e la rimozione dell&#39;apparecchio. Nota: Il periodo sperimentale può variare a seconda dello scopo dello studio (un giorno a diverse settimane). </li><li> Rimuovere accuratamente le lastre di vetro dalla macchina al termine del periodo sperimentale. Rimuovere la cera adesiva intorno le lastre con un coltello e trasferirli con un paio di pinzette per un contenitore chiuso, il biofilm rivolta verso l&#39;alto, fino all&#39;analisi microscopica. Tenere il contenitore umido con fazzoletto di carta bagnata. Eseguire l&#39;imaging pH entro poche ore dalla raccolta biofilm. </li></ol> 3. biofilm pH Imaging <ol><li> Prepararesoluzione salivare aggiungendo ditiotreitolo alla saliva raccolta secondo il metodo di de Jong et al. 13. Titolare la soluzione salivare a pH 7.0 e aggiungere il glucosio ad una concentrazione di 0,4% (peso / volume). Dispensare 100 microlitri per biofilm da analizzare in un 96-pozzetti con fondo di vetro per la microscopia. Aggiungere 5 ml di tintura raziometrico per pozzetto. </li><li> Posizionare la piastra a 96 pozzetti sul palco microscopio. Accendere il microscopio e la linea laser 543 nm. Riscaldare l&#39;incubatore a 37 ° C. Utilizzare le stesse impostazioni microscopio come per la calibrazione del colorante (vedere i passaggi 1,5-1,6). Attendere per 30 minuti, fino a quando la piastra a 96 pozzetti ha raggiunto la temperatura di lavoro. </li><li> Pick up una o più lastre di vetro con un insieme sottile di pinzette e metterli nei pozzetti saliva pieno, una lastra per pozzetto, con i biofilm rivolti verso il basso. </li><li> Acquisire le immagini singole ( &quot;Scan Control&quot; → &quot;single&quot;) o Z-stack ( &quot;Scan Control&quot; → &quot;Start&quot;) spanning la profondità dei biofilm in diversi settori. Per acquisire z-stacks scegliere il numero di fette di essere ripreso ( &quot;Scan Control&quot; → &quot;Impostazioni Z&quot; → &quot;Num fette&quot;) e segnare la posizione z per la prima e l&#39;ultima fetta nel software del microscopio ( &quot;Scan Control &quot;→&quot; Impostazioni Z &quot;→&quot; Mark First &quot;,&quot; Mark last &quot;). Nota: Z-stack con una profondità massima di 75 micron possono essere acquisite con un buon contrasto tra le aree extracellulari e intracellulari. </li><li> Per seguire variazioni di pH in un campo di vista microscopico nel corso del tempo, marcare la xy posizione nel software del microscopio ( &quot;stage e di controllo messa a fuoco&quot; → &quot;Mark Pos&quot;) e prendere immagini ripetute in momenti successivi ( &quot;Scan Control&quot; → &quot; Singolo&quot;). Regolarmente prendere le immagini con la potenza del laser impostato a zero per sottrazione del fondo. </li></ol> 4. Analisi Digital Image <ol><li> per export le immagini microscopiche come file TIF, usano l&#39;esportazione di file batch del software microscopio ( &quot;Macro&quot; → &quot;Batch File Export&quot;). Selezionare i file da esportare e salvare le immagini del canale rosso e verde in cartelle separate come TIF-files ( &quot;Start Batch Export&quot;). Rinominare i file in entrambe le cartelle dando loro numeri sequenziali. </li><li> Importare la serie di immagini rosso e verde in software come Daime (analisi di immagine digitale in ecologia microbica) 14. Segmento le immagini del canale verde con soglie scelti individualmente luminosità (segmento → → segmentazione automatica di soglia personalizzate). Scegliere le soglie di luminosità con cura (tipicamente tra 20 e 80), in modo che tutti i batteri (più luminosa della matrice extracellulare), ma non la matrice saranno riconosciuti come oggetti durante la segmentazione. Verificare visivamente che le aree riconosciute come oggetti corrispondono bene alla biomassa batterica. </li><li> Trasferire il livello di oggetto del g segmentatoimmagini reen canale alle immagini dei canali rosso corrispondenti (segmento → Trasferimento strato oggetto). Utilizzare la funzione Editor oggetti di rifiutare e cancellare tutti gli oggetti nelle immagini del canale rosso e verde. Ora solo la matrice extracellulare è lasciato nelle immagini biofilm. Esportare la serie immagine elaborata sotto forma di file TIF. </li><li> Importare la serie di immagini in ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij; v.1.47). Determinare l&#39;intensità media di fluorescenza nelle immagini di sfondo scattate con il laser spento (Analisi → Istogramma). Sottrarre il fondo adeguato dalle immagini rosso e verde (processo → Math → Sottrai). </li><li> Ancora in ImageJ, dividere la serie di immagini verde (G1) da solo (processo → Immagine calcolatrice). Quindi moltiplicare la serie immagine risultante (G2) con la serie di immagini verde (G1). Questo produrrà una serie di immagini (G3), dove NaN viene assegnato a tutti i pixel che appartengono a zone che sono state riconosciute come oggetti in Daime. Procedere in tlui stesso modo con la serie rosso immagine (R1 / R1 = R2; R2 x R1 = R3). Nota: Poiché la biomassa batterica è stato rimosso dalle immagini nel passaggio 4.3, l&#39;intensità fluorescente è 0 in queste aree. Fase 4.5 è necessario convertire il valore 0 per NaN, che permette di calcolo del rapporto nel passo 4.6. </li><li> Applicare il filtro &#39;Mean&#39; (processo → → Filtri Media; raggio: 1 pixel) per compensare il rumore del rivelatore. Dividere la serie immagine verde dalla serie di immagini rosso (processo → Immagine calcolatrice). Ciò si traduce in un rapporto verde / rosso per ogni pixel rimanente nello spazio extracellulare delle immagini. Utilizzare falsa colorazione per la rappresentazione grafica dei rapporti nelle immagini (Tabelle Immagine → Lookup). Calcolare il rapporto medio per ogni immagine (Analisi → Istogramma). </li><li> Convertire i rapporti di verde / rosso a valori di pH in base alla funzione montato sotto 1.9.2). Nota: Un esempio per dati di calibrazione e la curva a muro può essere visto in Schlafer etal 2015 11. </li></ol>

<ol><li>Hunter, R. C., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+pH-sensitive+fluoroprobe+%28C-SNARF-4%29+for+pH+microenvironment+analysis+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).</li>
<li>Takahashi, N., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caries+ecology+revisited%3A+microbial+dynamics+and+the+caries+process%5BTitle%5D)+AND+%22Caries+Res%22%5BJournal%5D)">Caries ecology revisited: microbial dynamics and the caries process.</a> Caries Res. 42 (6), 409-418 (2008).</li>
<li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+landscapes+in+a+novel+five-species+model+of+early+dental+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm.</a> PLoS. One. 6 (9), e25299(2011).</li>
<li>von Ohle, O. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+microsensor+measurement+of+local+metabolic+activities+in+ex+vivo+dental+biofilms+exposed+to+sucrose+and+treated+with+chlorhexidine%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (7), 2326-2334 (2010).</li>
<li>Revsbech, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+microbial+communities+with+electrochemical+microsensors+and+microscale+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of microbial communities with electrochemical microsensors and microscale biosensors.</a> Methods Enzymol. 397, 147-166 (2005).</li>
<li>Vanhoudt, P., Lewandowski, Z., Little, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iridium+oxide+pH+microelectrode%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Iridium oxide pH microelectrode.</a> Biotechnol. Bioeng. 40 (5), 601-608 (1992).</li>
<li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+strategy+for+three-dimensional+real-time+imaging+of+microbial+fuel+cell+communities%3A+monitoring+the+inhibitory+effects+of+proton+accumulation+within+the+anode+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Energy+%26+Environmental+Science%22%5BJournal%5D)">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy & Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).</li>
<li>Hidalgo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+tomographic+fluorescence+imaging+of+pH+microenvironments+in+microbial+biofilms+by+use+of+silica+nanoparticle+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (23), 7426-7435 (2009).</li>
<li>Vroom, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depth+penetration+and+detection+of+pH+gradients+in+biofilms+by+two-photon+excitation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Depth penetration and detection of pH gradients in biofilms by two-photon excitation microscopy.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65 (8), 3502-3511 (1999).</li>
<li>Bender, G. R., Sutton, S. V., Marquis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid+tolerance%2C+proton+permeabilities%2C+and+membrane+ATPases+of+oral+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Acid tolerance, proton permeabilities, and membrane ATPases of oral streptococci.</a> Infect. Immun. 53 (2), 331-338 (1986).</li>
<li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+imaging+of+extracellular+pH+in+bacterial+biofilms+using+C-SNARF-4%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms using C-SNARF-4.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).</li>
<li>Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+identification+of+streptococci+and+other+bacteria+in+initial+dental+biofilm+by+confocal+laser+scanning+microscopy+and+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J+Oral+Sci%22%5BJournal%5D)">In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization.</a> Eur. J Oral Sci. 115 (6), 459-467 (2007).</li>
<li>de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+oral+Streptococcus+species+and+Actinomyces+viscosus+in+human+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva.</a> Appl. Environ. Microbiol. 47 (5), 901-904 (1984).</li>
<li>Daims, H., Lucker, S., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((daime%2C+a+novel+image+analysis+program+for+microbial+ecology+and+biofilm+research%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research.</a> Environ. Microbiol. 8 (2), 200-213 (2006).</li>
<li>Liu, Y. L., Nascimento, M., Burne, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+toward+understanding+the+contribution+of+alkali+generation+in+dental+biofilms+to+inhibition+of+dental+caries%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J+Oral+Sci%22%5BJournal%5D)">Progress toward understanding the contribution of alkali generation in dental biofilms to inhibition of dental caries.</a> Int. J Oral Sci. 4 (3), 135-140 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Monitoraggio microscopico di pH biofilm fornisce diversi vantaggi, rispetto ad elettrodo o microelettrodi misurazioni 4-6. tecniche microscopiche permettono di determinare il pH con una risoluzione spaziale elevata e consentire catturare gradienti di pH orizzontali e verticali in biofilm senza disturbare il biofilm meccanicamente. I precedenti tentativi di monitoraggio del pH microscopico, tuttavia, non sono riusciti a distinguere tra il pH extracellulare e intracellulare nei biofilm 1,7,9. A causa...

Il metodo qui descritto permette di monitorare pH extracellulare in biofilm dentali nell&#39;intervallo tra 4,5 e 7, utilizzando il colorante raziometrica seminaphthorhodafluor-4F 5- (e-6) di acido carbossilico (C-SNARF-4) in combinazione con microscopio confocale a scansione laser e analisi di immagine digitale. Il colorante fluorescente impiegata è sensibile al pH e visualizza un cambiamento nella sua emissione fluorescente a seconda dello stato di protonazione. L&#39;emissione fluorescente dei picchi molecola protonata a 580 nm, e l&#39;emissione della molecola deprotonata a 640 nm 1. Il rapporto tra le intensità di emissione fluorescente in due finestre di rilevazione comprendente i due picchi di emissione (576 - 608 nm ei 629 - 661 nm) riflette quindi pH nella fase liquida, indipendentemente dalla concentrazione di colorante. Con un pK a di ~ 6,4 colorante è adatto per visualizzare pH in ambienti moderatamente acide. PH in biofilm batterici è di fondamentale importanza per tutti i processi metabolici.Nel caso di biofilm dentali, pH nella matrice extracellulare è il fattore di virulenza chiave per lo sviluppo della carie dentaria. Lunghi periodi con un basso pH al comando di interfaccia biofilm-dente per rallentare la demineralizzazione dello smalto di fondo 2. A causa della complessa architettura tridimensionale di biofilm, metaboliti, tra cui gli acidi organici, non sono distribuiti uniformemente in tutto il biofilm. Altamente e meno microambienti acidogeni possono essere trovati in prossimità spaziale 3. Per decenni, i gradienti di pH verticali in biofilm sono stati registrati con l&#39;aiuto di microelettrodi 4-6. Mentre offrono una buona risoluzione spaziale a causa della loro dimensione piccola punta, non sono particolarmente adatti per monitorare i gradienti orizzontali. Inoltre, l&#39;inserimento dell&#39;elettrodo disturba il biofilm meccanicamente. tecniche microscopiche a fluorescenza quantitative offrono il vantaggio di visualizzare variazioni di pH nei diversi settori di un biofilm, senza interferire meccanicance. Diversi campi microscopici di vista possono essere scelti liberamente e ripreso più volte per periodi prolungati 1,7-9. Tuttavia, quando si interpretano immagini microscopiche biofilm, è importante distinguere tra la fluorescenza derivante dalla biomassa microbica e fluorescenza derivante dallo spazio extracellulare. In condizioni acide, pH all&#39;interno delle cellule batteriche è diverso da pH nella matrice extracellulare, come i batteri trasportano attivamente protoni attraverso la membrana cellulare a scapito di adenosina trifosfato 10. Nel contesto della carie dentale, pH batterica intracellulare non ha un impatto diretto sullo smalto sottostanti, mentre bassi valori di pH extracellulare porta alla demineralizzazione. Una media di pH nelle immagini microscopiche che contengono entrambe le aree prive di batteri e batteri porta a risultati errati. L&#39;uso di altre macchie insieme con il colorante sensibile al pH per visualizzare la biomassa batterica e differenziare tra le aree extra ed intracellulari porta abil rischio di contaminazione fluorescente dello spazio extracellulare e false misurazioni 11. La presente manoscritto descrive pertanto l&#39;uso del colorante raziometrica in una duplice funzione; sia come marcatore pH e come una macchia batterica universale. Poiché il colorante è up-concentrato in cellule batteriche, la combinazione di confocale immagini microscopiche e un&#39;accurata procedura di analisi di immagine digitale consente la determinazione del pH extracellulare nel campo tra 4,5 e 7,0 in biofilm dentali sottili.

<table><tbody><tr><td>Zeiss LSM 510 META</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>C-Apochromat 63X water immersion objective</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>XL Incubator</td><td>PeCON</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid</td><td>Life Technologies</td><td>S23920</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Life Technologies</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11344-041</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96-well black clear-bottom plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-567</td><td></td></tr><tr><td>Custom-made glass slabs (4 x 4 x 1 mm&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;; 1,200 grit)</td><td>Menzel</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Alginate impression material</td><td>GC Corporation</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs</td><td>Axis Dental</td><td>LS-906</td><td></td></tr><tr><td>Orthodontic retainer containers</td><td>Spark Medical Equipment Co., Ltd</td><td>SK-WDTC01</td><td></td></tr><tr><td>Sticky wax</td><td>Dentsply</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Chewing paraffin wax&amp;nbsp;</td><td>Ivoclar Vivadent AG</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632</td><td>Used during preparation of salivary solution</td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m and 0.2 &amp;micro;m syringe filters</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS431220; CLS431219&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>daime</td><td>University of Vienna, Austria</td><td>http://dome.csb.univie.ac.at/daime</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH, Bethesda, Maryland, USA</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr></tbody></table>

ratiometric imaging of extracellular ph in dental biofilms

Il pH di biofilm batterici sui denti è di importanza centrale per la carie dentale, una malattia con un&#39;alta prevalenza in tutto il mondo. Nutrienti e metaboliti non sono distribuite in modo uniforme in biofilm dentali. Un complesso gioco di assorbimento da e per la reazione con la materia organica nel biofilm riduce i percorsi di diffusione di soluti e crea pendenze di molecole reattive, tra cui gli acidi organici, in tutto il biofilm. Metodi microscopici fluorescenti quantitativi, come l&#39;imaging tempo di vita di fluorescenza o pH ratiometry, possono essere impiegati per visualizzare pH in diversi microambienti di biofilm dentali. pH ratiometry sfrutta una variazione del pH-dipendente nella emissione fluorescente di coloranti sensibili al pH. Calcolo del rapporto emissione a due diverse lunghezze d&#39;onda permette di determinare pH locale in immagini microscopiche, indipendentemente dalla concentrazione del colorante. Contrariamente a microelettrodi tecnica permette il monitoraggio entrambi gradienti di pH verticali ed orizzontali in tempo reale condisturbare meccanicamente il biofilm. Tuttavia, la cura deve essere presa per distinguere con precisione tra i compartimenti extra-intracellulari e del biofilm. Qui, il colorante raziometrica, seminaphthorhodafluor-4F 5- (e-6) di acido carbossilico (C-SNARF-4) è impiegato per monitorare pH extracellulare in in vivo biofilm dentali coltivate di composizione delle specie sconosciuta. Al momento l&#39;esposizione al glucosio il colorante è up-concentrato all&#39;interno di tutte le cellule batteriche nei biofilm; è quindi usato sia come una macchia batterica universale e come indicatore di pH extracellulare. Dopo l&#39;acquisizione di immagini al microscopio confocale, la biomassa batterica viene rimosso da tutte le immagini utilizzando il software di analisi di immagine digitale, che permette di calcolare esclusivamente pH extracellulare. pH ratiometry con il colorante raziometrico è particolarmente adatto per studiare pH extracellulare in biofilm sottili fino a 75 micron di spessore, ma è limitato al campo di pH tra 4,5 e 7,0.

Il metodo presentato consente pH extracellulare monitoraggio scende in differenti microambienti di biofilm dentali nel range di pH da 4,5 a 7 in tempo reale. Se le condizioni sperimentali sono scelti come descritto sopra, pH inizia a cadere in tutte le aree del biofilm poco dopo l&#39;esposizione al glucosio. Quando il pH in un biofilm gocce, cellule batteriche diventano visibili entro breve tempo (&lt;1 min), come il colorant...

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Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Imaging Raziometrico del pH extracellulare nel dentale biofilm

Un colorante raziometrico pH-sensibile è utilizzato in combinazione con microscopio confocale a scansione laser e analisi di immagine digitale per monitorare pH extracellulare in biofilm dentali in tempo reale.

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

ratiometric-imaging-of-extracellular-ph-in-dental-biofilms

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.3K Views.  Aarhus University.  Un colorante raziometrico pH-sensibile è utilizzato in combinazione con microscopio confocale a scansione laser e analisi di immagine digitale per monitorare pH extracellulare in biofilm dentali in tempo reale. 

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Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

The development of fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically encoded and synthetic fluorophores with sensing abilities allowed the visualization of biologically relevant species with high spatial and temporal resolution. Synthetic dyes are of particular interest thanks to their high tunability and the wide range of measureable analytes. However, these molecules suffer several limitations related to small molecule behavior (poor solubility, difficulties in targeting, often no ratiometric imaging allowed). In this work we introduce the development of dendrimer-based sensors and present a procedure for pH measurement in vitro, in living cells and in vivo. We choose dendrimers as ideal platform for our sensors for their many desirable properties (monodispersity, tunable properties, multivalency) that made them a widely used scaffold for several biomedical devices. The conjugation of fluorescent pH indicators to the dendrimer scaffold led to an enhancement of their sensing performances. In particular dendrimers exhibit reduced cell leakage, improved intracellular targeting and allow ratiometric measurements. These novel sensors were successfully employed to measure pH in living HeLa cells and in vivo in mouse brain.

Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

Fluorescence sensors are powerful tools in life science. Here we describe a methodology to synthesize and use dendrimer-based fluorescent sensors to measure pH in living cells and in vivo. The dendritic scaffold enhances the properties of conjugated fluorescent dyes leading to improved sensing properties.

Sintesi, Consegna Cellulare e<em&gt; In vivo</em&gt; Applicazione di sensori di pH basati Dendrimero

The development of  fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically  encoded and synthetic fluorophores with sensing ...

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Chimica

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and composition 1, 2. In general, biofilms develop from initial microbial attachment on a surface followed by formation of cell clusters (or microcolonies) and further development and stabilization of the microcolonies, which occur in a complex extracellular matrix. The majority of biofilm matrices harbor exopolysaccharides (EPS), and dental biofilms are no exception; especially those associated with caries disease, which are mostly mediated by mutans streptococci 3. The EPS are synthesized by microorganisms (S. mutans, a key contributor) by means of extracellular enzymes, such as glucosyltransferases using sucrose primarily as substrate 3.
Studies of biofilms formed on tooth surfaces are particularly challenging owing to their constant exposure to environmental challenges associated with complex diet-host-microbial interactions occurring in the oral cavity. Better understanding of the dynamic changes of the structural organization and composition of the matrix, physiology and transcriptome/proteome profile of biofilm-cells in response to these complex interactions would further advance the current knowledge of how oral biofilms modulate pathogenicity. Therefore, we have developed an analytical tool-box to facilitate biofilm analysis at structural, biochemical and molecular levels by combining commonly available and novel techniques with custom-made software for data analysis. Standard analytical (colorimetric assays, RT-qPCR and microarrays) and novel fluorescence techniques (for simultaneous labeling of bacteria and EPS) were integrated with specific software for data analysis to address the complex nature of oral biofilm research.
The tool-box is comprised of 4 distinct but interconnected steps (Figure 1): 1) Bioassays, 2) Raw Data Input, 3) Data Processing, and 4) Data Analysis. We used our in vitro biofilm model and specific experimental conditions to demonstrate the usefulness and flexibility of the tool-box. The biofilm model is simple, reproducible and multiple replicates of a single experiment can be done simultaneously 4, 5. Moreover, it allows temporal evaluation, inclusion of various microbial species 5 and assessment of the effects of distinct experimental conditions (e.g. treatments 6; comparison of knockout mutants vs. parental strain 5; carbohydrates availability 7). Here, we describe two specific components of the tool-box, including (i) new software for microarray data mining/organization (MDV) and fluorescence imaging analysis (DUOSTAT), and (ii) in situ EPS-labeling. We also provide an experimental case showing how the tool-box can assist with biofilms analysis, data organization, integration and interpretation.

Biofilms formed on tooth surfaces are highly complex and exposed to constant innate and exogenous environmental challenges, which modulate their architecture, physiology and transcriptome. We developed a toolbox to examine the composition, structural organization and gene expression of oral biofilms, which can be adapted to other areas of biofilm research.

Una analitica Tool-box per la valutazione completa biochimici, strutturali e trascrittoma di biofilm orale mediata da Mutans Streptococchi

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

Immunologia e infezioni

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Quantificazione concomitante di cellulare e extracellulare componenti del biofilm

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

In vitro Monitoring of Extracellular pH in Real-Time

Early accumulation of neutrophils (PMN) is a hallmark of acute intestinal inflammation. This acute inflammation is either resolved or progresses to chronic inflammation. Without efficient PMN clearance at sites of infiltration, PMN can accumulate and contribute to chronic inflammatory conditions, including the intestinal diseases ulcerative colitis (UC) and Crohn's Disease (CD). The pH in the distal colon in individuals with active UC can range between a pH of 5 and 6, whereas healthy individuals maintain colonic pH in the range of 6.8-7.4. Extracellular pH has been shown to influence both intestinal epithelial cells and the infiltrating immune cells. More specifically, extracellular acidosis significantly impacts PMN. At pH below 6.5, there are increases in the production of H2O2, inhibition of apoptosis, and increases in the functional lifespan of PMN. Given the significant presence of PMN and extracellular acidification at sites of inflammation, we developed a novel model that allows for the monitoring of extracellular pH during PMN transepithelial migration in real time. Here, we describe this model and how it can be utilized to measure both the apical and basal pH during PMN trafficking. This model can be utilized to monitor extracellular pH under a wide range of conditions; including, hypoxia, PMN transepithelial migration, and for extended periods of time.

<meta charset="utf8"></head><body>Monitoraggio in vitro del pH extracellulare in tempo reale

This article represents a useful in vitro assay to measure changes in extracellular pH during neutrophil (PMN) transepithelial migration (TEM)

In vitro Monitoraggio del pH extracellulare in tempo reale

Early accumulation of neutrophils (PMN) is a hallmark of acute intestinal inflammation. This acute inflammation is either resolved or progresses to ...

Biochimica

High Spatial Resolution Chemical Imaging of Implant-Associated Infections with X-ray Excited Luminescence Chemical Imaging Through Tissue

Microbial infections associated with implantable medical devices are a major concern in fracture fixation failure. Early diagnosis of such infection will allow successful eradication with antibiotics without an extra cost for a second surgery. Herein, we describe XELCI as a technique with high X-ray resolution, implant specificity, and chemical sensitivity to noninvasively image chemical concentrations near the surface of implanted medical devices. The devices are coated with chemically reporting surfaces. This chemically responsive surface consists of two layers coated on an implantable medical device; a pH-sensitive layer (bromothymol blue or bromocresol green incorporated hydrogel) which is coated over a red-light emitting scintillator (Gd2O2S: Eu) layer for monitoring. A focused X-ray beam irradiates a spot on the implant, and the red light generated by the scintillator (with 620 nm and 700 nm peaks) is transmitted through the sensing layer which alters the spectral ratio depending on the pH. An image is generated by scanning the X-ray beam across the implant and measuring the spectral ratio of light passing through the tissue point-by-point. We used this imaging technique for monitoring implant-associated infections previously on the bone surface of the femur with a modified implantable plate sensor. Now we are studying pH changes that occur from tibial intramedullary rod infections. Two different types of intramedullary rod designs are used in pre-pilot rabbit studies, and we learned that the XELCI technique could be used to monitor any chemical changes that occur not only on the bone surface but also inside the bone. Thus, this enables noninvasive, high spatial resolution, low background local pH imaging to study implant-associated infection biochemistry.

Here, we present a protocol for high-resolution optical detection of chemical information around implanted medical devices with X-ray excited luminescence chemical imaging (XELCI). This novel imaging technique is developed in our lab which enables studying implant-associated infection biochemistry.

Imaging chimico ad alta risoluzione spaziale delle infezioni associate all'impianto con luminescenza eccitata a raggi X Imaging chimico attraverso il tessuto

Microbial infections associated with implantable medical devices are a major concern in fracture fixation failure. Early diagnosis of such infection will ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Un nuovo metodo per l&#39;analisi qualitativa multi-scala batterica biofilm su filamentose Fungal Colonies Utilizzando confocale e microscopia elettronica

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular compartment where the killing and digestion of engulfed particles take place, is the main arena for neutrophil pathogen killing that requires tight regulation. Phagosomal pH is one aspect that is carefully controlled, in turn regulating antimicrobial protease activity. Many fluorescent pH-sensitive dyes have been used to visualize the phagosomal environment. S-1 has several advantages over other pH-sensitive dyes, including its dual emission spectra, its resistance to photo-bleaching, and its high pKa. Using this method, we have demonstrated that the neutrophil phagosome is unusually alkaline in comparison to other phagocytes. By using different biochemical conjugations of the dye, the phagosome can be delineated from the cytoplasm so that changes in the size and shape of the phagosome can be assessed. This allows for further monitoring of ionic movement.

This manuscript describes a simple method to measure the phagosomal pH and area as well as the cytoplasmic pH of human and mouse neutrophils using the ratiometric indicator seminaphthorhodafluor (SNARF)-1, or S-1. This is achieved using live-cell confocal fluorescence microscopy and image analysis.

Imaging dei neutrofili phagosome e nel citoplasma utilizzo di un indicatore di pH Raziometrico

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, periodontitis, mucosal infections and, most notably, early childhood caries. In all of these conditions, the pH in the biofilm matrix impacts microbe-host interactions and thus the disease progression. The present protocol describes a confocal microscopy-based method to monitor pH dynamics inside cross-kingdom biofilms comprising Candida albicans and Streptococcus mutans. The pH-dependent dual-emission spectrum and the staining properties of the ratiometric probe C-SNARF-4 are exploited to determine drops in pH in extracellular areas of the biofilms. Use of pH ratiometry with the probe requires a meticulous choice of imaging parameters, a thorough calibration of the dye, and careful, threshold-based post-processing of the image data. When used correctly, the technique allows for the rapid assessment of extracellular pH in different areas of a biofilm and thus the monitoring of both horizontal and vertical pH gradients over time. While the use of confocal microscopy limits Z-profiling to thin biofilms of 75 &#181;m or less, the use of pH ratiometry is ideally suited for the noninvasive study of an important virulence factor in cross-kingdom biofilms.

The protocol describes the cultivation of cross-kingdom biofilms consisting of Candida albicans and Streptococcus mutans and presents a confocal microscopy-based method for the monitoring of extracellular pH inside these biofilms.

Monitoraggio del pH extracellulare nei biofilm tra regni incrociati utilizzando la microscopia Confocal

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH (pHi) is influenced by many ion transporters and thus monitoring pHi is a useful tool for assessing transporter activity. Modern Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs) provide optical quantification of pHi in intact cells on a cellular and subcellular scale. This protocol describes real-time quantification of cellular pHi regulation in Malpighian Tubules (MTs) of Drosophila melanogaster through ex vivo live-imaging of pHerry, a pseudo-ratiometric GEpHI with a pKa well-suited to track pH changes in the cytosol. Extracted adult fly MTs are composed of morphologically and functionally distinct sections of single-cell layer epithelia, and can serve as an accessible and genetically tractable model for investigation of epithelial transport. GEpHIs offer several advantages over conventional pH-sensitive fluorescent dyes and ion-selective electrodes. GEpHIs can label distinct cell populations provided appropriate promoter elements are available. This labeling is particularly useful in ex vivo, in vivo, and in situ preparations, which are inherently heterogeneous. GEpHIs also permit quantification of pHi in intact tissues over time without need for repeated dye treatment or tissue externalization. The primary drawback of current GEpHIs is the tendency to aggregate in cytosolic inclusions in response to tissue damage and construct over-expression. These shortcomings, their solutions, and the inherent advantages of GEpHIs are demonstrated in this protocol through assessment of basolateral proton (H+) transport in functionally distinct principal and stellate cells of extracted fly MTs. The techniques and analysis described are readily adaptable to a wide variety of vertebrate and invertebrate preparations, and the sophistication of the assay can be scaled from teaching labs to intricate determination of ion flux via specific transporters.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Cellular ion transport can often be assessed by monitoring intracellular pH (pHi). Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs)&#160;provide optical quantification of intracellular pH in intact cells. This protocol details the quantification of intracellular pH through cellular ex vivo live-imaging of Malpighian tubules of Drosophila melanogaster with pHerry, a pseudo-ratiometric genetically encoded pH-indicator.

Ottica pH quantificazione di intracellulare in Drosophila melanogaster anatomista Epithelia con pH indicatore fluorescente geneticamente codificato

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Imaging Raziometrico del pH extracellulare nel dentale biofilm

Riepilogo

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Sintesi, Consegna Cellulare e

Una analitica Tool-box per la valutazione completa biochimici, strutturali e trascrittoma di biofilm orale mediata da Mutans Streptococchi

Quantificazione concomitante di cellulare e extracellulare componenti del biofilm

In vitro Monitoraggio del pH extracellulare in tempo reale

In vitro Monitoraggio del pH extracellulare in tempo reale

Imaging chimico ad alta risoluzione spaziale delle infezioni associate all'impianto con luminescenza eccitata a raggi X Imaging chimico attraverso il tessuto

Un nuovo metodo per l'analisi qualitativa multi-scala batterica biofilm su filamentose Fungal Colonies Utilizzando confocale e microscopia elettronica

Imaging dei neutrofili phagosome e nel citoplasma utilizzo di un indicatore di pH Raziometrico

Monitoraggio del pH extracellulare nei biofilm tra regni incrociati utilizzando la microscopia Confocal

Ottica pH quantificazione di intracellulare in Drosophila melanogaster anatomista Epithelia con pH indicatore fluorescente geneticamente codificato