Work was funded by a Development and Promotion of Science and Technology scholarship from the Thai Ministry for Education to W.W. and grants from Tenovus and the Anonymous Trust to M.P.S.

1.メディアの準備注：プロトコルは、2つの別のメディアのミックスの使用に依存している：変更されたN2サプリメントを補充したDMEM / F12とするNeurobasalは、典型的には1に、B27サプリメントで補充：1の比率。 <ol><li> 15mlチューブに成分を混合することによって修正されたN2サプリメントを準備します。これをボルテックスしたりフィルタリングしません。溶液が透明になるまでチューブを転倒混和。 <ol><li> （0.01 M HClに作られた）25 mg / mlのインスリンの1ミリリットルを加え、チューブを反転させてよく混ぜ、その後、DMEM / F12の7.2ミリリットルをピペットで起動します。溶液が透明になるまでには数分かかります。 </li><li> 100ミリグラムの1ミリリットルを追加/ mlの（水の中に作られた）アポトランスフェリン、0.6ミリグラム/ 33μlのミリリットルprogesternone（エタノール中に作られた）、水に作られた160 mg / mlの（1 M）プトレシン（100μlの）、水の中に作られた3ミリモルの亜セレン酸ナトリウム（）10μlの7.5％ウシ血清アルブミンの666μlを、よくチューブを混ぜます。 -20℃で2.5ミリリットルに小分けとストア最大2ヶ月間C。 </li></ol></li><li>メディアを準備します。 <ol><li> DMEM / F12 250 mlにN2の2.5ミリリットルを追加します。よく混ぜますが振動やフィルタはありません。 </li><li>神経基礎の250ミリリットルにメディアはB27サプリメントの5ミリリットルを追加します。よく混ぜますが振動やフィルタはありません。 </li><li> 1：1の比のステップ1.2.1と1.2.2からメディアをミックス。いくつかのケースでは1：3混合物は、（：ステップ1.2.4で1ミックス1のように補足した）必要な場合があります。 </li><li>ミックスにL-グルタミン（最終濃度0.2 mM）の2-メルカプトエタノール（最終濃度0.1 mM）の3.5μlを0.5 mlのを追加し、振盪せずによく混ぜます。 3週間まで4℃でメディアを格納し、光にさらすことは避けてください。この最終的なミックスはN2B27と呼ばれています。 </li></ol></li><li>ゼラチン溶液を準備します。 <ol><li> 15分間、121℃、15 psiで超純水、オートクレーブ中の1％ゼラチン溶液を準備します。それは、このために使用ボトルは洗浄剤や消毒剤から完全にクリーンであることが重要なので、新しいボトルがあることをお勧めしますこのために使用されるとしか使用の間、超純水でリンスされます。 50ミリリットルのアリコートに1％溶液を分注し、数ヶ月のために4℃で維持。 </li><li>溶解するまで37℃の水浴中で1％ゼラチンのアリコートを温め、温かいリン酸緩衝食塩水（PBS）500ml中に加えます。十分に混合し、各ウェルまたはプレートの底をカバーするのに十分ピペット。少なくとも30分間コートにゼラチンを表面を許可します。 </li></ol></li></ol> 2.細胞をプレーティング注：このプロトコルは、白血病阻害因子（LIF）で10％血清中で増殖させたマウスESC、LIFおよび骨形成タンパク質4（BMP4）またはMEKとGSK3阻害剤（2Iメディア）とLIFまたは無血清培地と血清代替に等しく適用されますでまたはLIFなしで。しかし、分化のタイミングおよび効率は、細胞培地（説明を参照）に依存して変化し得ます。ここに示した実験のために、我々はEGFPレポーターがOにノックした46CマウスESC株を（使用しました10％血清およびLIFとGMEM中で増殖させた内因性SOX1対立遺伝子のNE）。最適な結果のためには、細胞が解離し、N2B27培地中に再プレーティングすることが重要です。単にGMEM /血清/ LIFからN2B27にメディアの変更は、常に細胞を再プレートと比較して減少分化効率をもたらします。 <ol><li> 10％血清、1mMピルビン酸ナトリウム、1×非必須アミノ酸、0.1 M 2-メルカプトエタノール、100ユニット/ mlのLIF 13 GMEM中で細胞を成長させます。 3日- 2かかりますT25培養フラスコにマウスESC、プレート1×10 6細胞のサブコンフルエント培養物を取得します。 </li><li>明視野顕微鏡で細胞を観察します。細胞がサブコンフルエントと通過する準備ができたら、PBS中で2回、それらをすすぎます。細胞解離試薬の1ミリリットルを追加し、2インキュベーターに戻す - 5分。トリプシンおよび他の酵素は、細胞分離のために用いることができるが、めっき密度があることが必要となるので、それらはadju細胞接着に悪影響を与えることができSTED。 </li><li>細胞がプレートから持ち上げるために始めているしたら、単一細胞懸濁液にそれらを取り除くために、容器をタップします。 15mlの遠心チューブに培地と細胞解離試薬およびピペットの10ミリリットルの合計に細胞を回収します。 </li><li> RTで3分間、300×gで細胞をスピン。 </li><li>慎重に上清を吸引し、ピペッティングにより3ダウン予め温めておいたN2B27 10mlにペレットを再懸濁 - 5回。ダウンサスをピペットすると、チューブの側面にピペットは、泡を作成しないように。自動細胞カウンターまたは血球計数器で細胞をカウントし、濃度を記録します。 </li><li>予め温めておいN2B27にウェルあたりするボリュームの単位当たりの細胞の所望の数を含む細胞懸濁液を準備します。 6ウェルディッシュ中で1cm 2当たり10,500細胞の密度（ すなわち、6ウェル皿のウェル当たり1×10 5個の細胞）が最適です。 cm 2であり、PLAあたりの細胞の推奨数については、表1を参照してください。細胞培養容器の様々なティンメディアボリューム。 </li><li>培養容器からゼラチンを吸引し、 表1で推奨密度とボリュームに応じて細胞懸濁液をプレート。これは中央に細胞を集中するようにプレートを旋回しないでください。 37℃、5％CO 2の湿潤インキュベーター内で培養を配置します。 </li><li>新鮮N2B27で全てのメディアを交換することによって、2日 - すべての1のメディアを変更します。ピペットは、細胞を穏やかにフラッシュなどの密度に影響を与え、次の日に分化効率を低下させる可能性があります。めっき後の初期の生存率が悪い場合には、1で細胞をプレート：N2及びB27添加培地の3ミックスと最初の2日後N2B27に変更。細胞が分化するように開始され、4の内部（ここで使用46C細胞株におけるレポーターの緑色蛍光によって可視）SOX1の発現を示すべきである- 6日。 </li></ol> 3.免疫蛍光染色 NOTE：プロトコルは、任意の容器型に適用することができます。各試薬の量は、6ウェルプレートのウェル毎に記載されており、任意の表面領域にスケーリングすることができます。再プレーティングは、その後低い生存能力にはお勧めしません。 <ol><li>分化培地を除去し、4％の500μL（v / v）のパラホルムアルデヒドを添加することにより、細胞を固定、15分間放置します。 </li><li>洗浄し、PBS-T（リン酸緩衝生理食塩水0.5％（v / v）のトゥイーン20）を2 mlの細胞透過性を2回。細胞を4℃で最長2ヶ月間、PBS-T中で維持することができます。 </li><li> 10％（二次抗体と同じ種に由来する）（v / v）の血清をPBS-T 1mlのPBS-Tを交換してください。任意の非特異的結合をブロックするために室温でロッカープレート上で1時間インキュベートします。 </li><li> 1時間後、PBS-Tを2 mlの細胞を2回洗浄し、（1希釈した10％の血清をPBS-Tで1000）、βIIIチューブリンに対する500μlのマウスIgGでインキュベートします。プレートロッカーに入れ、4℃でO / Nのままにしておきます。 </li><li>この段階から、常に血管を保護光から。次に（10％血清をPBS-T中の2μg/ mlに希釈した）蛍光標識抗マウスIgG抗体500μlを添加、PBS-Tで細胞を2回洗浄します。室温で1時間プレートロッカーの上に置きます。 </li><li>その後、DAPIの500μlを添加、PBS-Tで細胞を2回すすぎ（PBS-Tで0.5μg/ mlに希釈し）、5分間のままにします。 </li><li>再び細胞を洗浄し、PBS-Tに保管してください。細胞を撮影する準備ができていると、4℃で2週間まで維持することができます。それは固定され、生細胞の、又は異なる時間に固定された細胞のGFPの強度を比較することは不適切であるので、GFPシグナルが経時フェード注意。 </li></ol>

<ol>
	<li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo-derived+stem+cells:+of+mice+and+men.">Embryo-derived stem cells: of mice and men.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).</li><li>Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+express+neuronal+properties+in+vitro.">Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro.</a> Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).</li><li>Fraichard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro.+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+glial+cells+and+functional+neurons.">In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons.</a> J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).</li><li>Strubing, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+into+the+neuronal+lineage+in+vitro+gives+rise+to+mature+inhibitory+and+excitatory+neurons.">Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons.</a> Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).</li><li>Stavridis, M. P., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Neural differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).</li><li>Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+embryonic+stem+cells+into+neuroectodermal+precursors+in+adherent+monoculture.">Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture.</a> Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).</li><li>Ying, Q. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation.">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li><li>Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+discrete+period+of+FGF-induced+Erk1/2+signalling+is+required+for+vertebrate+neural+specification.">A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification.</a> Development. 134, 2889-2894 (2007).</li><li>Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+orchestrates+fibroblast+growth+factor+signalling+to+drive+embryonic+stem+cell+differentiation.">Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation.</a> Development. 137, 881-890 (2010).</li><li>Speakman, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+O-GlcNAc+Levels+Activate+Epigenetically+Repressed+Genes+and+Delay+Mouse+ESC+Differentiation+Without+Affecting+Naive+to+Primed+Cell+Transition.">Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition.</a> Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).</li><li>Kunath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+stimulation+of+the+Erk1/2+signalling+cascade+triggers+transition+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+from+self-renewal+to+lineage+commitment.">FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment.</a> Development. 134, 2895-2902 (2007).</li><li>Dani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+induction+of+stem+cell+renewal+by+LIF-deficient+cells:+a+new+ES+cell+regulatory+pathway.">Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway.</a> Dev Biol. 203, 149-162 (1998).</li><li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+differentiation+of+embryonic+stem+cells.">Culture and differentiation of embryonic stem cells.</a> Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).</li><li>Aubert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+mammalian+neural+genes+via+fluorescence-activated+cell+sorter+purification+of+neural+precursors+from+Sox1-gfp+knock-in+mice.">Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 11836-11841 (2003).</li><li>Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+is+mediated+via+activation+of+STAT3.">Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3.</a> Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).</li><li>Silva, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+pluripotency.">Capturing pluripotency.</a> Cell. 132, 532-536 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

単層神経分化プロトコルは、十年6オーバーのために使用されてきました。プロトコルが定義された媒体で構成され、前臨床のためのシステムをより適用になり、単層システムで行われ、非常に効率的である（ 例えば、薬物スクリーニング）を使用しています。しかし、分化効率を決定するいくつかの重要な要因があります。この記事では、これらの要因と各障害物のためのソ...

胚性幹細胞（キメラを形成することによって）適切な段階の胚に再導入後のすべての成体細胞型に分化する能力を保持しながら、in vitroで無限に増殖する能力を有する初期胚から誘導された多能性細胞、同系または免疫無防備状態の宿主に注入されています適切な手がかりに（奇形腫を形成することにより）、またはインビトロ 、対象における 1。神経系統へのマウス胚性幹細胞のin vitroでの分化は、1995年に初めて記載され、モルフォゲン、レチノイン酸2-4を補った血清含有培地中の多細胞懸濁凝集体（胚様体に、EB）の形成を関与していました。それ以来、種々のプロトコルは、神経分化5を可能にするために開発されてきました。まだ凝集を利用する多くの、他の細胞型を誘導するとの共培養を、いくつかの無血清培地の使用を含みます。すべてのプロトコルの利点持っていますND欠点及び神経または神経細胞の正確な性質は、また、使用するプロトコルに応じて変化する生じました。 理想的なプロトコルは、堅牢で拡張性の高い、完全に定義された培地と基質を利用する、分化過程の非侵襲的モニタリングに適して、外部の手がかりによってパターニングすることができる神経前駆細胞の純粋な集団の生成をもたらすと区別するためであろう比較的短時間で高効率と収率で、すべてのニューロンとグリアサブタイプに。最後の十年では、低密度、無血清の接着性単層培養6-10にマウスESCから神経前駆細胞と神経細胞を生成するための方法を使用しています。このプロトコルは、上述した多くの基準を満たす：我々の手に分化効率は、長年にわたって非常に一貫しており、種々の細胞株は、スケールアップすることができ、またはダウン（我々が正常に96ウェルプレートから容器を用います直径15cmジシーズ）と使用するメディアは、明確に定義されています。プロセスは、（ドーパミン作動性ニューロン6のために、例えば、ShhのとFGF8）ニューロンのサブタイプの別個の種類の生成を誘導するために添加することができる分化のモニタリングおよびパターニング手がかりの様々なタイムラプス顕微鏡に適しています。 それにもかかわらず、このプロトコルの成功のアプリケーションにはいくつかの課題があります。重要な側面の一つは、メディアの入念な準備です。我々は常に商業選択肢の利用可能性にもかかわらず、社内メディアを準備します。使用サプリメントの一つ（N2; プロトコルを参照）は、標準的な市販のバージョンに比べて変更されています。最後に、この方法の成功した適用のために最も重要なステップの一つは、めっきに最適な細胞密度です。誘導信号（FGF4 11）のいずれかの自己分泌性質が最適viabilを可能にするのに十分な細胞が存在することを必要とするので、これは主に高すぎる密度分化における性と分化は、（おそらくLIF 12の自己分泌産生に起因する部分で）損なわれています。これは、培地調製および細胞のプレーティングの両方が最適な結果を保証するために慎重にかつ一貫して行われることが重要です。

<table><tbody><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement, serum free</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td>Reconstitute with sterile 0.01 M HCl</td></tr><tr><td>Apo-transferrin</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td>Reconstitute with sterile water</td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td>Reconstitute with ethanol</td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td>Reconstitute with sterile water</td></tr><tr><td>Sodium selenite</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td>Reconstitute with sterile water</td></tr><tr><td>Bovine albumin fraction V</td><td>Life Technologies</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented</td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>6-well tissue culture dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>24-well tissue culture dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>96-well tissue culture dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>GMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-essential amino acids solution</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Leukaemia inhibitory factor</td><td>prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>Protect from light</td></tr><tr><td>Mouse anti &amp;beta;III tubulin IgG antibody</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence-labelled anti-mouse IgG antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A31571</td><td>Protect from light</td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; tissue culture flask</td><td>Thermo Scientific</td><td>156367</td><td></td></tr></tbody></table>

neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture

神経前駆細胞にマウス胚性幹細胞（ESC）の分化する能力は、神経の仕様を制御する機構の研究だけでなく、さらなる研究のために成熟した神経細胞型の生成を可能にします。このプロトコルでは、無血清、単層培養を用いて、神経前駆細胞へのESCの分化のための方法を説明します。この方法は効率的で、拡張可能であり、4内の70％の神経前駆細胞〜の産生をもたらす - 6日。これは、様々な条件下で成長させた様々な株からESCに適用することができます。神経前駆細胞は、機能性ニューロンおよびグリアへとさらに分化させ、または顕微鏡検査によって分析し、フローサイトメトリーまたは分子技術を流すことができます。分化過程をタイムラプス顕微鏡検査に適していると神経仕様プロセスを監視するためのレポーター系の使用と組み合わせることができます。私たちはBに処理を可能にするために、メディアの準備と細胞密度の最適化に関する詳細な指示を与えますEは最もESC株および細胞培養容器の様々な適用しました。

この実験では、神経分化を追跡するために、内因性SOX1-GFPレポーターと46C細胞ライン14、マウス胚性幹細胞を使用します。この細胞株、SOX1の発現は、神経前駆細胞のマーカーを使用することにより、緑色蛍光により検出することができます。密度をメッキすることは、神経分化を達成するための重要な要因です。マウス胚性幹細胞は、10,500 88500個の細胞/ cm 2で変化する異なる?...

Watch this Scientific Journal Video about Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture at JoVE.com

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

無血清単層培養中のマウス胚性幹細胞の神経分化

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

neural-differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-serum-free

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.0K ビュー.  University of Dundee. This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

ビデオ: Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

2および3次元の胚様体中のマウス胚性幹細胞のレチノイン酸誘発神経分化の分析

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

発生生物学

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

マウス胚性幹細胞からの神経前駆細胞とニューロンの分化と特徴付け

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

運動ニューロンにマウス胚性幹細胞の効率的な分化

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

生物学

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

マウス萌芽期の神経幹細胞の分離と培養

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

神経科学

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

無血清全胚培養系で、マウス胚発生

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

インビトロにおけるマウス胚性幹細胞からの神経細胞分化

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Generating Neural Progenitors from Embryonic Stem Cells in Serum-Free Monolayer Cultures

Source: Wongpaiboonwattana, W., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/52823">Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture.</a> J. Vis. Exp.(2015)
The video demonstrates a protocol that uses serum-free media to generate neural progenitors from mouse embryonic stem cells. The desired concentration of embryonic stem cells, suspended in serum-free media, is plated on gelatin-coated coverslips. At an optimal cell density, cells produce autocrine signaling factors, which, along with the neural differentiation-inducing factors in the serum-free media, trigger the differentiation of embryonic stem cells into neural progenitors.

無血清単層培養における胚性幹細胞からの神経前駆細胞の生成

1. Media Preparation
NOTE: The protocol relies on using a mix of two separate media: DMEM/F12 supplemented with modified N2 supplement and Neurobasal ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

神経細胞培養技術

高度な神経細胞モデル

Generating Cortical Interneuron Precursors From Mouse Embryonic Stem Cells

Source: Tischfield, D. J., et al <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/56358">Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video presents a method for generating cortical interneuron precursors from mouse embryonic stem cells. The protocol entails culturing the stem cells in media containing specific small molecule inhibitors, which facilitate stem cell proliferation and aggregation into embryoid bodies (EBs). Subsequently, the EBs are dissociated with enzymes and plated on culture plate wells coated with adhesion proteins to promote their differentiation into cortical interneuron precursors.

マウス胚性幹細胞からの皮質介在ニューロン前駆体の生成

1. Media Preparation
NOTE: Warm all media to 37 &#38;#176;C before use in cell culture.

	Mouse Embryonic Fibroblast (MEF) media (for preparing 500 mL)
	
	...

Differentiating Mouse Embryonic Stem Cells into a Networked Neuron Population

Source: Hubbard, K. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/52361">Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates a technique for embryonic stem cell differentiation into a networked population of neurons with functioning synapses. It outlines the steps involved in embryonic stem cell differentiation into neurons, induction of neuronal network formation, and enrichment of the culture with networked neurons.

マウス胚性幹細胞のネットワーク化ニューロン集団への分化

1. Neuronal Differentiation
NOTE: Conduct steps 1.1 - 1.5 before noon and step 1.7 after noon. An overview of the differentiation procedures is presented ...