Work was funded by a Development and Promotion of Science and Technology scholarship from the Thai Ministry for Education to W.W. and grants from Tenovus and the Anonymous Trust to M.P.S.

1. Carta Preparazione NOTA: Il protocollo si basa sull&#39;utilizzo di una miscela di due distinti mezzi: DMEM / F12 addizionato con modificato supplemento N2 e Neurobasal supplementato con supplemento B27, tipicamente in un rapporto 1: 1. <ol><li> Preparare il supplemento N2 modificato mescolando i componenti in una provetta da 15 ml. Non vortice o filtrare questo; mescolare capovolgendo la provetta fino a quando la soluzione è limpida. <ol><li> Inizia pipettando 7,2 ml di DMEM / F12, quindi aggiungere 1 ml di 25 mg / ml di insulina (composta in 0,01 M HCl) e mescolare bene invertendo il tubo. Ci vogliono un paio di minuti fino a quando la soluzione è limpida. </li><li> Aggiungere 1 ml di 100 mg / ml apo-transferrina (preparati in acqua), 33 ml di 0,6 mg / ml progesternone (costituiti in etanolo), 100 ml di 160 mg / ml (1 M) putrescina (preparati in acqua ), 10 ml di 3 mM selenito di sodio (preparati in acqua) e 666 ml di 7,5% di siero albumina bovina e mescolare bene il tubo. Aliquota in 2,5 ml e conservare a -20 °C per un massimo di 2 mesi. </li></ol></li><li> Preparare il supporto. <ol><li> Per 250 ml di DMEM / F12 aggiungere 2,5 ml di N2. Mescolare bene ma non scuotere o filtro. </li><li> Per 250 ml di Neurobasal media aggiungi 5 ml di supplemento B27. Mescolare bene ma non scuotere o filtro. </li><li> Mescolare il supporto da operazioni 1.2.1 e 1.2.2 in un rapporto 1: 1. In alcuni casi un 1: 3 mix può essere richiesto (integrato come il 1: 1 mix al punto 1.2.4). </li><li> Per il mix di aggiungere 0,5 ml di L-glutammina (concentrazione finale 0,2 mm) e 3,5 ml di 2-mercaptoetanolo (concentrazione finale 0,1 mm) e mescolare bene senza agitare. Conservare il supporto a 4 ° C per un massimo di 3 settimane e non esporre alla luce. Questo mix finale si chiama N2B27. </li></ol></li><li> Preparare la soluzione di gelatina. <ol><li> Preparare una soluzione di gelatina 1% in acqua ultrapura e autoclave a 121 ° C, 15 psi, per 15 min. È importante che la bottiglia utilizzata per questo è completamente pulito da detergenti o disinfettanti, quindi si raccomanda una nuova bottiglia èutilizzato per questo ed è sempre risciacquato solo in acqua ultrapura tra usi. Aliquota della soluzione all&#39;1% in 50 ml aliquote e conservare a 4 ° C per mesi. </li><li> Scaldare un&#39;aliquota di 1% di gelatina in un bagno d&#39;acqua a 37 ° fino a scioglimento e aggiungere 500 ml di soluzione salina tamponata con fosfato calda (PBS). Mescolare bene e pipettare sufficiente a coprire il fondo di ogni bene o un piatto. Lasciare la gelatina per rivestire la superficie per almeno 30 min. </li></ol></li></ol> 2. placcatura celle NOTA: Questo protocollo vale anche per il mouse ESC coltivato in 10% di siero di leucemia fattore inibitorio (LIF), la sostituzione di siero con LIF o supporti privi di siero con LIF e proteina morfogenetica dell&#39;osso 4 (BMP4) o MEK e GSK3 inibitori (supporti 2i) con o senza LIF. Tuttavia, i tempi e l&#39;efficienza della differenziazione possono variare a seconda del supporto e le cellule (vedi la discussione). Per gli esperimenti riportati qui abbiamo usato la linea 46C del mouse ESC (che ha un reporter EGFP buttato in one degli alleli Sox1 endogeni), coltivati ​​in GMEM con 10% siero e LIF. Per ottenere risultati ottimali, è importante che le cellule sono dissociate e ripiastrate nei media N2B27; semplicemente cambiando di supporti da GMEM / siero / LIF a N2B27 si traduce sempre in efficienza differenziazione ridotto rispetto replating cellule. <ol><li> Far crescere le cellule in GMEM con 10% di siero, 1 mM piruvato di sodio, aminoacidi non essenziali 1x, 0,1 M 2-mercaptoetanolo, e LIF 13 100 unità / ml. Per avere una cultura subconfluenti di topo ESC, piatto 1 x 10 6 cellule in un pallone di coltura T25 che avrà 2-3 giorni. </li><li> Osservare le cellule al microscopio in campo chiaro. Quando le cellule sono subconfluenti e pronti per il passaggio, sciacquare due volte in PBS. Aggiungere 1 ml di cellule dissociazione reagenti e ritorno per l&#39;incubatore per 2 - 5 min. Sebbene tripsina e di altri enzimi possono essere utilizzati anche per la dissociazione cellulare, possono avere un impatto negativo sulla adesione cellulare così le densità di placcatura dovranno essere regosted. </li><li> Una volta che le cellule iniziano a sollevare dalla piastra, toccare il vaso loro rimuovere in una sospensione di cellule singole. Raccogliere le cellule in un totale di 10 ml di mezzi di comunicazione e di dissociazione delle cellule del reagente e pipetta in una provetta da centrifuga da 15 ml. </li><li> Spin le cellule a 300 xg per 3 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Con attenzione aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di N2B27 preriscaldata pipettando su e giù 3 - 5 volte. Quando pipettando sospensione giù, pipetta contro il lato del tubo per evitare la creazione di bolle. Contare le cellule con un contatore di cellule automatico o un emocitometro e registrare la concentrazione. </li><li> Preparare una sospensione cellulare contenente il numero desiderato di cellule per unità di volume da placcare per pozzetto in N2B27 pre-riscaldato. Una densità di 10.500 cellule per cm 2 in un piatto da 6 pozzetti (cioè, 1 x 10 5 cellule per pozzetto di un piatto 6 pozzetti) è ottimale. Vedi Tabella 1 per il numero consigliato di cellule per cm 2 e plating volumi di media per una serie di recipienti di coltura cellulare. </li><li> Aspirare la gelatina dal recipiente di coltura e la piastra della sospensione cellulare in funzione della densità suggerito e volume in Tabella 1. Non agitare le piastre in quanto ciò concentrare le cellule al centro. Collocare le culture in un incubatore umido a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Modificare i media ogni 1 - 2 giorni, sostituendo tutti i media con N2B27 fresca. Pipetta delicatamente come vampate di calore le cellule potrebbero incidere densità e diminuire l&#39;efficienza differenziazione nei giorni successivi. Dove vitalità iniziale dopo la placcatura è povero, piastra le cellule in un 1: 3 mix dei media N2 e B27-integrati e cambiare questo N2B27 dopo i primi due giorni. Le cellule cominceranno a differenziare e dovrebbero mostrare espressione Sox1 (visibile fluorescenza verde del reporter nella linea cellulare 46C usato qui) entro 4 - 6 giorni. </li></ol> 3. immunofluorescenza NOTE: Il protocollo può essere applicato a qualsiasi tipo di imbarcazione. Il volume di ogni reagente è descritta per pozzetto di 6 pozzetti e può essere installato su qualsiasi superficie. Replating è sconsigliato a causa della bassa redditività in seguito. <ol><li> Rimuovere terreno di differenziamento e fissare le cellule aggiungendo 500 ml di 4% (v / v) paraformaldeide, lasciare per 15 min. </li><li> Lavare e permeabilize le cellule con 2 ml di PBS-T (tampone fosfato salino con 0,5% (v / v) di Tween-20) due volte. Le cellule possono essere mantenute in PBS-T fino a 2 mesi a 4 ° C. </li><li> Sostituire PBS-T con 1 ml di PBS-T con 10% (v / v) di siero (dalla stessa specie come anticorpo secondario). Incubare 1 ora sulla sedia a dondolo piatto a temperatura ambiente per bloccare qualsiasi legame non specifico. </li><li> Dopo 1 ora, lavare le cellule due volte con 2 ml di PBS-T, e incubare in 500 microlitri IgG topo contro βIII-tubulina (diluito 1: 1000 in PBS-T con siero 10%). Mettere sul rocker piatto, e lasciare O / N a 4 ° C. </li><li> Da questo punto, proteggere sempre il recipientedalla luce. Lavare le cellule due volte con PBS-T, quindi aggiungere 500 ml di fluorescenza marcato anti-topo IgG (diluito a 2 mg / ml in PBS-T con siero 10%). Mettilo sul bilanciere piatto per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule due volte con PBS-T, quindi aggiungere 500 ml di DAPI (diluito a 0,5 mg / ml in PBS-T) e lasciar riposare per 5 minuti. </li><li> Lavare nuovamente le cellule e tenerli in PBS-T. Le cellule sono pronte per essere fotografata e possono essere conservati per un massimo di 2 settimane a 4 ° C. Si noti che il segnale GFP svanisce nel tempo in modo non è opportuno confrontare l&#39;intensità GFP delle cellule fisse e in diretta o di cellule fissate in tempi diversi. </li></ol>

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	<li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo-derived+stem+cells:+of+mice+and+men.">Embryo-derived stem cells: of mice and men.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).</li><li>Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+express+neuronal+properties+in+vitro.">Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro.</a> Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).</li><li>Fraichard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro.+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+glial+cells+and+functional+neurons.">In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons.</a> J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).</li><li>Strubing, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+into+the+neuronal+lineage+in+vitro+gives+rise+to+mature+inhibitory+and+excitatory+neurons.">Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons.</a> Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).</li><li>Stavridis, M. P., Smith, A. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+O-GlcNAc+Levels+Activate+Epigenetically+Repressed+Genes+and+Delay+Mouse+ESC+Differentiation+Without+Affecting+Naive+to+Primed+Cell+Transition.">Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition.</a> Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).</li><li>Kunath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+stimulation+of+the+Erk1/2+signalling+cascade+triggers+transition+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+from+self-renewal+to+lineage+commitment.">FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment.</a> Development. 134, 2895-2902 (2007).</li><li>Dani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+induction+of+stem+cell+renewal+by+LIF-deficient+cells:+a+new+ES+cell+regulatory+pathway.">Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway.</a> Dev Biol. 203, 149-162 (1998).</li><li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+differentiation+of+embryonic+stem+cells.">Culture and differentiation of embryonic stem cells.</a> Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).</li><li>Aubert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+mammalian+neural+genes+via+fluorescence-activated+cell+sorter+purification+of+neural+precursors+from+Sox1-gfp+knock-in+mice.">Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 11836-11841 (2003).</li><li>Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+is+mediated+via+activation+of+STAT3.">Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3.</a> Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).</li><li>Silva, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+pluripotency.">Capturing pluripotency.</a> Cell. 132, 532-536 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Il protocollo di differenziamento neurale monostrato è stato in uso per oltre un decennio 6. Il protocollo è altamente efficiente, composto terreno specifico, e fatto in un sistema monostrato che rende il sistema più applicabile per preclinica (ad esempio, la selezione della droga) utilizza. Tuttavia, vi sono alcuni fattori critici che determinano l&#39;efficienza differenziazione. Questo articolo sottolinea questi fattori e la soluzione per ogni ostacolo. Densità del...

Le cellule staminali embrionali sono cellule pluripotenti derivate da embrione precoce con la capacità di proliferare indefinitamente in vitro, pur mantenendo la capacità di differenziarsi in tutti i tipi cellulari adulti seguenti reintroduzione in un apposito embrione stadio (formando una chimera), iniezione in singenici o immunocompromessi host (formando un teratoma) o in vitro soggetto a segnali appropriati 1. La differenziazione in vitro di cellule staminali embrionali di topo in lignaggi neuronali è stato descritto nel 1995 e prevedeva la formazione di aggregati multicellulari di sospensione (corpi embrionali, EBS) in mezzi di siero contenenti integrati con l&#39;acido retinoico morfogeno 2-4. Da allora una serie di protocolli sono stati sviluppati per permettere la differenziazione neuronale 5. Molti ancora utilizzare l&#39;aggregazione, gli altri co-coltura con induzione tipi di cellule e molti prevedono l&#39;utilizzo di mezzi privi di siero. Tutti i protocolli hanno vantaggi and svantaggi e la natura precisa neurali o cellule neuronali prodotte anche varia secondo il protocollo usato. Il protocollo ideale sarebbe robusto, scalabile e fare uso di mezzi di comunicazione e substrati completamente definiti, essere suscettibili di monitoraggio non invasivo del processo di differenziazione e causare la generazione delle popolazioni pure di cellule progenitrici neurali in grado di essere modellato da stimoli esterni e per differenziare in tutti i sottotipi neuronali e gliali con elevata efficienza e la resa in un tempo relativamente breve. Negli ultimi dodici anni abbiamo utilizzato un metodo per la generazione di progenitori neurali e neuroni di topo CES in una bassa densità, privo di siero cultura monostrato aderente 6-10. Questo protocollo soddisfa molti dei criteri di cui sopra: nelle nostre mani l&#39;efficienza della differenziazione è stato abbastanza costante nel corso di molti anni, e una varietà di linee cellulari, si può essere scalato verso l&#39;alto o verso il basso (usiamo con successo navi di piastre da 96 pozzetti per 15 centimetri di diametro dishes) ei supporti utilizzati sono ben definiti. Il processo è suscettibile di microscopia timelapse per il monitoraggio della differenziazione e una varietà di segnali patterning può essere aggiunto per indurre la generazione di tipi distinti di sottotipi neuronali (es Shh e Fgf8 per i neuroni dopaminergici 6). Tuttavia, ci sono alcune sfide per l&#39;efficace applicazione di questo protocollo. Uno degli aspetti chiave è un&#39;attenta preparazione dei media. Abbiamo sempre prepariamo il supporto in-house nonostante la disponibilità di alternative commerciali. Uno degli integratori utilizzati (N2; vedi Protocol) ha modifiche nel corso dello standard versioni disponibili in commercio. Infine, una delle fasi più importanti per il successo di questo metodo è la densità cellulare ottimale placcatura. Questo è principalmente perché mentre la natura autocrina di uno dei segnali che inducono (Fgf4 11) richiede che le cellule sono presenti sufficienti per consentire viabil ottimalelità e la differenziazione, a troppo elevate densità di differenziazione è compromessa (forse in parte a causa della produzione autocrina di LIF 12). È quindi importante che la preparazione sia supporti e placcatura cellule vengono eseguite accuratamente e costantemente per garantire risultati ottimali.

<table><tbody><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement, serum free</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td>Reconstitute with sterile 0.01 M HCl</td></tr><tr><td>Apo-transferrin</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td>Reconstitute with sterile water</td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td>Reconstitute with ethanol</td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td>Reconstitute with sterile water</td></tr><tr><td>Sodium selenite</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td>Reconstitute with sterile water</td></tr><tr><td>Bovine albumin fraction V</td><td>Life Technologies</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented</td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>6-well tissue culture dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>24-well tissue culture dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>96-well tissue culture dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>GMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-essential amino acids solution</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Leukaemia inhibitory factor</td><td>prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>Protect from light</td></tr><tr><td>Mouse anti &amp;beta;III tubulin IgG antibody</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence-labelled anti-mouse IgG antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A31571</td><td>Protect from light</td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; tissue culture flask</td><td>Thermo Scientific</td><td>156367</td><td></td></tr></tbody></table>

neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture

La capacità di differenziare le cellule staminali embrionali di topo (ESC) per progenitori neurali consente lo studio dei meccanismi di controllo specifica neurali nonché la generazione di tipi di cellule neuronali mature per ulteriori studi. In questo protocollo si descrive un metodo per la differenziazione di ESC per progenitori neurali usano senza siero, cultura monostrato. Il metodo è scalabile, efficiente e si traduce in produzione di circa il 70% di cellule progenitrici neurali entro 4-6 giorni. Esso può essere applicato a ESC da vari ceppi coltivate sotto una varietà di condizioni. Progenitori neurali possono essere autorizzati a differenziare ulteriormente in neuroni funzionali e glia o analizzati al microscopio, il flusso delle tecniche di citometria o molecolari. Il processo di differenziazione è suscettibile di microscopia time-lapse e può essere combinato con l&#39;uso di linee giornalista per monitorare il processo di specifica neurale. Noi forniamo istruzioni dettagliate sulla preparazione dei media e l&#39;ottimizzazione della densità cellulare per consentire il processo di Be applicato alla maggior parte delle linee ESC e una varietà di recipienti di coltura cellulare.

In questo esperimento, abbiamo utilizzato la linea cellulare 46C 14, le cellule staminali embrionali di topo con un endogena Sox1-reporter GFP, per monitorare la differenziazione neuronale. Utilizzando questa linea cellulare, espressione di Sox1, un marker per progenitore neuronale, può essere rilevata da fluorescenza verde. Placcatura densità è un fattore critico per raggiungere la differenziazione neuronale. Cellule staminali embrionali di topo sono stati placcati in 6 pozzetti a diverse densità che var...

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Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Differenziamento neurale delle cellule staminali embrionali di topo in siero privo monostrato Cultura

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

neural-differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-serum-free

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.0K Views.  University of Dundee. This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Video: Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

Analisi di acido retinoico-indotta neurale differenziazione di cellule staminali embrionali di topo a organi embrionali due e tridimensionali

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

Differenziazione neurale efficiente utilizzando la coltura a cella singola di cellule staminali embrionali umane

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

Differenziazione e caratterizzazione di progenitori neurali e neuroni da cellule staminali embrionali di topo

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

Differenziazione efficiente di cellule staminali embrionali di topo in neuroni motori

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Biologia

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Isolamento e coltura di cellule staminali neurali embrionali del Mouse

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Neuroscienze

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Embrionali di topo di sviluppo in un embrione di tutta la cultura di sistema privo di siero

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

Differenziazione neuronale dalle cellule staminali embrionali del topo in vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Generating Neural Progenitors from Embryonic Stem Cells in Serum-Free Monolayer Cultures

Source: Wongpaiboonwattana, W., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/52823">Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture.</a> J. Vis. Exp.(2015)
The video demonstrates a protocol that uses serum-free media to generate neural progenitors from mouse embryonic stem cells. The desired concentration of embryonic stem cells, suspended in serum-free media, is plated on gelatin-coated coverslips. At an optimal cell density, cells produce autocrine signaling factors, which, along with the neural differentiation-inducing factors in the serum-free media, trigger the differentiation of embryonic stem cells into neural progenitors.

Generazione di progenitori neurali da cellule staminali embrionali in colture monostrato prive di siero

1. Media Preparation
NOTE: The protocol relies on using a mix of two separate media: DMEM/F12 supplemented with modified N2 supplement and Neurobasal ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

Neuronal Culture Techniques

Advanced Neuronal Models

Generating Cortical Interneuron Precursors From Mouse Embryonic Stem Cells

Source: Tischfield, D. J., et al <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/56358">Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video presents a method for generating cortical interneuron precursors from mouse embryonic stem cells. The protocol entails culturing the stem cells in media containing specific small molecule inhibitors, which facilitate stem cell proliferation and aggregation into embryoid bodies (EBs). Subsequently, the EBs are dissociated with enzymes and plated on culture plate wells coated with adhesion proteins to promote their differentiation into cortical interneuron precursors.

Generazione di precursori corticali di interneuroni da cellule staminali embrionali di topo

1. Media Preparation
NOTE: Warm all media to 37 &#38;#176;C before use in cell culture.

	Mouse Embryonic Fibroblast (MEF) media (for preparing 500 mL)
	
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Differentiating Mouse Embryonic Stem Cells into a Networked Neuron Population

Source: Hubbard, K. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/52361">Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates a technique for embryonic stem cell differentiation into a networked population of neurons with functioning synapses. It outlines the steps involved in embryonic stem cell differentiation into neurons, induction of neuronal network formation, and enrichment of the culture with networked neurons.

Differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in una popolazione di neuroni in rete

1. Neuronal Differentiation
NOTE: Conduct steps 1.1 - 1.5 before noon and step 1.7 after noon. An overview of the differentiation procedures is presented ...