This work was funded by the German Ministry of Defense (Grant No. M-SAB1-6-A009).

以下のプロトコルは、初期の内皮細胞の移動の調査のための手法について説明します。血管内皮細胞の適切な培養は、内皮表現型の適切な増殖および維持を確実にするために、ゼラチンを用いた細胞培養フラスコのプレコーティングを必要とします。 細胞培養フラスコの1プリコート<ol><li> 0.1％の最終濃度になるように0.1 M PBS中のゼラチンを溶かします。 </li><li> （詳細は特定のオートクレーブの手順を参照するための）液体オートクレーブ処理のためのパラメータで溶液をオートクレーブ。 </li><li>無菌の細胞培養フラスコ（T25細胞培養フラスコのため、例えば、少なくとも5 ml）でのオートクレーブ処理ゼラチン溶液の十分な量を加えます。 </li><li>少なくとも30分間、インキュベーター（37℃、5％CO 2を必要としないが、干渉せず）内にフラスコを移し。 </li><li>残りのゼラチン溶液を除去します。その後プレコートフラスコを使用します（参照細胞培養）またはs使用するまで無菌条件下で引き裂きました。 </li></ol>初期の内皮細胞の2細胞培養注：以前に10,11説明したように胚性幹細胞由来の早期内皮細胞（EEC）はPECAM-1陽性細胞分画の磁気活性化細胞選別によって区別マウス胚様体から得ました。 <ol><li> DMEM中でゼラチン被覆細胞培養皿に培養EEC、15％FCS、50 U / mlペニシリン、50 U / mlのストレプトマイシン、200μMのL-グルタミン、100μMのβメルカプトエタノールおよび1％非必須アミノ酸を補充しました。無菌条件下で細胞を処理します。 37℃、5％CO 2で細胞を培養し、95％の湿度サブコンフルエンス（最大80％）になるまで。 </li><li> 5比：サブ合流点に、1でセルを分割します。注：内皮細胞の剥離は重要なステップです。 <ol><li> RTのACCUTASEで細胞を収穫。 、メディアを取り出し、PBSでリンスし、25単位cm ACCUTASEの1ミリリットルを追加します<sup&gt; 2。 </li><li>細胞が分離するまで、2〜10分間室温でフラスコをインキュベートします。細胞を分散し、所望のアプリケーションに転送します。注：播種した細胞は、37℃のインキュベーターに格納されている場合、それが起こるようACCUTASEの化学的中和は必要ありません。しかし、ACCUTASE活性もFCSを含むDMEMを添加することによって低下させることができます。 </li></ol></li></ol> 3.ボイデンチャンバー注：ボイデンチャンバーアッセイは8μmの孔径を有する光不透明なポリエチレンテレフタレートインサートシステムを使用して実行されます。 <ol><li>プレコートフィルターインサート（細胞培養ウェルの内部その適合は、このようにBoydenチャンバーを作成する）、少なくとも30分間、0.1 M PBSに溶解した0.1％ゼラチンを500μlを加えることにより。 </li><li>細胞は有毒化学物質にさらされる場合は、細胞収穫前に、特定の実験計画に応じて露光します。注：細胞を12.5μgのクロラムブシル/ mlのDMEMに曝露しました24時間。具体的な実験計画に関しては、命令が異なる場合があります。 </li><li>収穫EEC計数セルチャンバーを用いて細胞数を決定します。注：自動計数装置を使用することができるが、注意して使用する必要があります。マニュアル細胞計数は、より正確であり、強くお勧めします。 </li><li>ボイデンチャンバーの下室区画に500μlの細胞培養培地を追加します。 </li><li>上室区画にフィルタインサートあたり500μlの細胞培養培地中で正確に10 4 EECを追加します。気泡を除去します。 </li><li>正確に8時間、インキュベーターのフィルタインサートをインキュベートします。 </li><li> PBSで一度洗浄し、細胞固定のための25分間両方の区画に0.5ミリリットルの4％パラホルムアルデヒドを含む培地を交換してください。 0.1 M PBSでフィルターが、少なくとも3回洗浄します。 </li><li>メスで膜を切除。 </li><li>核staininのためにDAPIを含む封入剤を有する2つのガラスカバースリップ間の膜をマウントgです。向きに注意してください。膜の下室側に向かって移動した細胞のみがカウントされていることを確認します。 </li><li> 400Xの倍率で蛍光顕微鏡を用いて、膜の下室側に向かって移動した細胞をカウントします。移動した細胞（ 図1A、1B）との膜孔を混同しないでください。生物学的複製（条件当たり少なくとも3生物学的反復）の合理的な数を調査します。 </li></ol> 4.創傷治癒アッセイ<ol><li> DIC顕微鏡を使用する場合、プラスチック表面ベースの培養皿またはウェルプレートを回避するが、代わりにガラスベースのデバイスを使用します。利用可能な機器に依存して、慎重に細胞培養皿またはプレートを選択します。 注：位相差顕微鏡を使用している場合は、プラスチックベースの料理を使用することもできます。 </li><li>適切な細胞培養装置にEECを養う（ライブセルイメージングに適した例えば 4センチガラスボトムシャーレ）80％コンフルエンスになるまで。重要：合流を完了するために、細胞を培養しないでください。 </li><li>滅菌10μlのピペットチップを用いて単層を傷つけ。皿表面上にあまりにも多くの圧力なしそっと先端を押して、分離した細胞を除去するために、0.1 M PBSで二回other.Washに一方の側からスムーズに直線状に移動してください。 </li><li>培養皿に培地の十分な量を追加します。該当する場合は、調査する必要がある化合物を追加します。 注：15 NGを含む1.5 mlの培地/ mlのアルファリノレン酸を添加しました。 </li><li>ライブセルイメージングが可能な顕微鏡下で培養皿をマウントします。 5％CO 2、37℃、加湿雰囲気を確認してください。 注：加湿媒体の蒸発を避けるために特に重要です。 </li><li> 10分間隔で24時間かけてタイムラプス画像を取得します。大きなファイルサイズを計画します。注意：512×512ピクセルの解像度が通常は十分です。しかし、我々は、少なくとも1,024×1,0の画像を使用することをお勧めします24。 </li><li> = 0時間tでのギャップ幅を測定し、tの= 24時間顕微鏡で提供されるソフトウェアの長さツールを使用するか、オープンソースソフトウェア（ 例えば、ImageJの）を使用します。注意：一般に、特定の画像取得及び解析ソフトウェアは、製造業者によって提供されます。そのため、ソフトウェアの使用に関する技術的な詳細については、マニュアルを参照してください。 </li></ol> 5.細胞追跡<ol><li> DIC顕微鏡を使用する場合、プラスチック表面ベースの培養皿またはウェルプレートを回避するが、代わりにガラスベースのデバイスを使用します。利用可能な機器に依存して、慎重に細胞培養皿またはプレートを選択します。 注：位相差顕微鏡を使用している場合は、プラスチックベースの料理を使用することもできます。 </li><li>適切な細胞培養装置で補充したDMEM中に5×10 4 EEC種（ 例えば、24マルチウェルプレート）、37℃で1〜2日間、95％湿度、5％CO 2で細胞を養います。 </li><li>細胞は80にまで成長してきた場合には％コンフルエンス、それぞれの試験物質（例えば、12.5μgのクロラムブシル/ mlのDMEM）の存在下で、メディアと文化の新しいメディアで細胞を除去します。常に（個々のアッセイ系に依存して、24時間）一定時間、37℃での対照細胞（溶媒で処理し、 例えば、エタノール）が挙げられます。 </li><li>生細胞イメージング（37℃、5％CO 2及び95％湿度）が可能な顕微鏡下で培養皿をマウント。事前に定義された間隔で、24時間かけてタイムラプス画像を取得します。 10分間隔で画像を取得します。 </li><li> ImageJのプラグインMTrackJを使用して手動でEECの追跡を行います。視野からランダムに10個のセルを選択し、MTrackJのコマンドを「追加」を使用して時間内にポイント当たりのデータポイントを追加することで、その動きを追跡します。 </li></ol>注：MTrackJは[。Meijering、 Mtrackj「http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/」]で無料で利用可能で、ImageJがご利用できますです。ルで[Rasband、 ImageJの。 &quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/&quot;]。MTrackJプラグインについての詳細なマニュアルは、「http://www.imagescience.org」で入手できます。 ミトコンドリア膜電位の6ライブセルイメージング/評価<ol><li> 80％のコンフルエンスまで適切な細胞培養装置（ライブセルイメージングに適した例えば 4センチガラスボトムシャーレ）にEECの育成。 重要：合流を完了するために、細胞を培養しないでください。 </li><li>該当する場合は、化学物質に細胞を公開します。注：細胞は、24時間12.5 / mlのクロラムブシルに曝露しました。具体的な実験計画に関しては、命令が異なる場合があります。 </li><li>テトラメチルDMSO中（TMRM）の10mMストック溶液を調製します。光から保護します。注：ストック溶液は-20℃で保存することができます。 </li><li> （：1,000希釈1）10μMの濃度での作業溶液に細胞培養培地中の原液を希釈します。光から保護しますできるだけ早く使用しています。注：作業溶液は、いくつかの時間（&gt; 1時間）室温で維持することができる、しかし、新鮮なワーキング溶液の調製を強くお勧めします。 </li><li> 1ミリリットルの作業溶液の新鮮な細胞培養培地（ローディング溶液）の2μlを添加します。 </li><li>ローディング溶液で細胞培養培地を交換し、細胞をロードします。 37℃、5％CO 2加湿雰囲気（インキュベーター）で15分間インキュベートします。注意：ほとんどすべての蛍光指示薬は、時間をかけて生細胞によってエクスポートされます。したがって、長期のロードまたは遅延解析を避けます。 </li><li>洗浄することなく、生細胞イメージングに適した顕微鏡下で皿を置きます。重要：蛍光指示薬は、したがって、不要な光の露出を避けるため、光に非常に敏感です。 </li><li>異なる画像間の比較可能性を確保するために取得パラメータを変更せずに画像を取得します。 </li></ol>

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	<li>Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis,+vasculogenesis,+and+induction+of+healing+in+chronic+wounds.">Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds.</a> Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).</li><li>Reinke, J. M., Sorg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 49, 35-43 (2012).</li><li>Hart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation.+1:+Its+role+in+the+healing+of+acute+wounds.">Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds.</a> Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).</li><li>Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=endothelial+progenitor+cell+mobilization,+and+diabetic+wound+healing.">endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).</li><li>Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperbaric+oxygen+and+bone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cells+in+diabetic+wound+healing.">Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing.</a> Vascular. 14, 328-337 (2006).</li><li>Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+toxicology+of+sulfur+mustard-induced+cutaneous+inflammation+and+blistering.">Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering.</a> Toxicology. 263, 12-19 (2009).</li><li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+mustard+(Chlorambucil)+has+a+negative+influence+on+early+vascular+development.">Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development.</a> Toxicology. 263, 32-40 (2009).</li><li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+N-acetyl+cysteine+and+alpha-linolenic+acid+on+sulfur+mustard+caused+impairment+of+in+vitro+endothelial+tube+formation.">Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation.</a> Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).</li><li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorambucil+(nitrogen+mustard)+induced+impairment+of+early+vascular+endothelial+cell+migration+-+Effects+of+alpha-linolenic+acid+and+N-acetylcysteine.">Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration - Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine.</a> Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).</li><li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+endostatin+on+embryonic+vasculo-+and+angiogenesis.">Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis.</a> Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).</li><li>Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cell+separations.">Methods in cell separations.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 1-18 (2007).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+VEGF-induced+endothelial+cell+migration+by+mitochondrial+reactive+oxygen+species.">Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species.</a> American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+culture+conditions+on+endothelial+cell+growth+and+responsiveness.">Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness.</a> Tissue &amp; Cell. 30, 525-530 (1998).</li><li>Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+substrates+for+human+umbilical+vein+endothelial+cell+culture.">A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).</li><li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+probes+and+the+proton+gradient:+a+practical+usage+guide.">Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide.</a> BioTechniques. 50, 98-115 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

有害化学物質への皮膚暴露は、しばしば深刻な創傷治癒障害をもたらします。根底にあるメカニズムは不明な点が多いです。創傷治癒は、異なる位相（止血、炎症、増殖およびリモデリング）で構成され、複雑なプロセスです。細胞移動は、しかし、それは、肉芽組織の形成のために最も重要であり、すべての段階に関与しています。ここで、新しい血管が脈管の脈管形成またはいずれかに?...

細胞遊走は、皮膚損傷後の開発、様々な疾患、および創傷治癒を含む多くの生理学的および病態生理学的プロセスにおいて重要です。 皮膚損傷に続いて、炎症は、損傷または壊死組織および造粒予備創傷閉鎖を駆動し、脈管（小説形成）または血管新生（既存の小胞の出芽）1-3を介して、新しい毛細血管のネットワークの形成を可能にするが削除されます。 vasculo-と血管新生の両方が内皮細胞の移動を必要とします。血管の成長ネットワークは、最終的には角質化を受けるケラチノサイト増殖に酸素と栄養素を運ぶ新しい上皮を形成し、創傷閉鎖を提供するために不可欠です。 内皮細胞の障害の移行は、障害4,5創傷治癒の根底にある原因です。したがって、初期の内皮細胞の遊走を評価する方法がpathophysiolを探索するために必要とされます細胞遊走障害の術とは、治療的介入のための新規の戦略を特定します。 アルキル化剤（ 例えば、硫黄、窒素マスタード）への皮膚暴露は、障害6創傷治癒を引き起こします。このような化合物が原因政治的に不安定な地域や比較的単純な合成における既存の備蓄に強い懸念の理由を20世紀に、いくつかの紛争で化学兵器として使用され、残ってました。硫黄マスタードは、​​最初1822年に合成されたが、SM暴露の分子および臨床病理学を詳細に理解されておらず、SMの暴露のための解毒剤が同定されていません。 いくつかの研究は、理解し、SM暴露後障害、創傷治癒をモデル化するために、その効果を確保することができる潜在的な候補化合物を試験するために行われています。シュミットら （2009）は、MOUにおけるSMと同様の特性を持つアルキル化化合物をクロラムブシルの効果を試験しましたSE胚様体モデルおよび血管形成7の劇的な、時には99％以上の減少を発見しました。この副作用は、ほとんどの生理的条件下で、血管内皮前駆細胞の増殖および移動によって支配され、開発の段階で顕著でした。したがって、これらの細胞は、アルキル化剤に特に敏感であることが確認されました。 Steinritz ら （2010）に、マウス胚様体モデルにおいて、特にSMの毒性を低減する能力について、特に、N-アセチルシステイン（NAC）およびアルファリノレン酸（ALA）中の反応性酸素種（ROS）の捕捉剤をテスト血管形成8を復元します。一時的な保護効果は、過剰なROS形成は、創傷治癒にSMの副作用に貢献する可能性があったことを示し、観察されました。これらの効果は一時的なものであり、2つの候補化合物は、長期8の血管形成および創傷治癒を回復することが可能ではないかもしれません。 HoweveR、これらの実験は、細胞遊走の研究を可能にしました複雑な3Dモデルで行いました。従って、我々は、その後血管形成9の過程において重要な役割を持っているEECの細胞遊走に有益な効果のためにNACとALAをテストしました。 また、細胞極性、細胞遊走に必要とされるという証拠があります。 ROSの形成をもたらすミトコンドリア機能不全は、細胞極性を損なうことが示されたので、有害な細胞の移動に影響を及ぼし得ます。したがって、ミトコンドリア機能に関して、生細胞イメージングを行い、ROSスカベンジャーの効果を調べました。以下のプロトコルは、EEC、Boydenチャンバーアッセイ、細胞トラッキング解析および詳細におけるミトコンドリア機能の評価のためにTMRMの使用を含む創傷治癒アッセイの栽培のための一般的な要件について説明します。 EEC栽培と移行のための実験プロトコルの重要な側面が強調されています。

<table><tbody><tr><td>Boyden Chamber&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 &amp;micro;m</td><td>Corning Incorporated</td><td>#351151</td><td></td></tr><tr><td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 &amp;micro;m</td><td>Life Sciences</td><td>#351152</td><td></td></tr><tr><td>(for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wound&amp;nbsp; healing assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom dishes</td><td>Word Precision Instruments, Inc.</td><td>#FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Assessment of mitochondrial potential</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester)</td><td>Life Technologies</td><td>#T669</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA, Pasching, Austria</td><td># L11-007</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Linolenic acid</td><td>Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td><td>&amp;nbsp;# L2376</td><td></td></tr><tr><td>Chlorambucil</td><td>Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td><td># 23125</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany</td><td># G2500-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of endothelial cell migration after exposure to toxic chemicals

（硫黄および窒素マスタードのようなアルキル化化学兵器を含む）の化学物質への曝露は、創傷治癒障害を含む臨床症状の過多を引き起こします。創傷治癒の生理学的過程は非常に複雑です。いずれかの脈管を通って（小説の形成）または血管新生（既存の血管の出芽） - 肉芽組織の形成は、予備的な創傷閉鎖をもたらし、新たな毛細血管のネットワークを提供し、このプロセスの重要なステップです。 vasculo-と血管新生の両方は、内皮細胞の遊走を向け機能が必要です。このように、初期の内皮細胞（EEC）移行の調査は治癒障害の化学誘起される傷の病態生理を理解し、潜在的な治療的介入のための新規な戦略を特定することが重要です。 我々は、エージェントの露出をアルキル化した後、創傷治癒の障害を評価し、TRのための潜在的な候補化合物を試験しましたeatment。私たちは、このプロトコルで概説技術のセットを使用していました。定量EECのケモキネシスを調査する改変ボイデンチャンバーを説明します。また、質的移行を評価するための軌道分析と組み合わせた創傷治癒アッセイの使用が示されています。最後に、乱れた細胞遊走の基礎となるメカニズムを識別するために、ミトコンドリア膜電位の調査のための蛍光色素TMRMの使用を示します。以下のプロトコルは、EECの調査のために適応されている基本的な手法について説明します。

アルキル化剤への皮膚暴露は、紅斑、水疱形成および創傷治癒障害に関連する皮膚潰瘍を引き起こします。創傷治癒は、内皮細胞の移動に基づいているリンパ管のおよび脈管が必要です。定量的な移行はボイデンチャンバーアッセイを使用して評価することができます。アルキル化剤クロラムブシルのEECの図1Cの露光に示すように、細胞遊走9の有意な減少をもたらしまし...

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Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

有害化学物質への曝露後の内皮細胞の遊走の評価

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

assessment-endothelial-cell-migration-after-exposure-to-toxic

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.6K ビュー.  Bundeswehr Institute of Pharmacology and Toxicology. Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

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Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

フローの状況下で好中球移住研究におけるヒト臍帯静脈内皮細胞とそれらの使用の分離

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

免疫・感染学

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

生理フローの状況の下で循環細胞のケモカイン指向溢出を研究する新規三次元フローチャンバーデバイス

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

生物工学

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

好中球遊出の下で生理的流れの間に内皮細胞 - 細胞接合のリアルタイムイメージング

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

体外流れ球サブポピュレーションの募集の同時研究

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of activated leukocytes across the vascular endothelium into key organs can lead to organ failure. A physiologically relevant biomimetic microfluidic assay (bMFA) has been developed and validated using several experimental and computational techniques, which can reproduce the entire leukocyte rolling/adhesion/migration cascade to study leukocyte-endothelial cell interactions. Microvascular networks obtained from in vivo images in rodents were digitized using a Geographic Information System (GIS) approach and microfabricated with polydimethylsiloxane (PDMS) on a microscope slide. To study the effect of shear rate and vascular topology on leukocyte-endothelial cell interactions, a Computational Fluid Dynamics (CFD) model was developed to generate a corresponding map of shear rates and velocities throughout the network. The bMFA enables the quantification of leukocyte-endothelial cells interactions, including rolling velocity, number of adhered leukocytes in response to different shear rates, number of migrated leukocytes, endothelial cell permeability, adhesion molecule expression and other important variables. Furthermore, by using human-related samples, such as human endothelial cells and leukocytes, bMFA provides a tool for rapid screening of potential therapeutics to increase their clinical translatability.

In this protocol, a biomimetic microfluid assay, which can reproduce a physiologically relevant microvascular environment and reproduce the entire leukocyte adhesion/migration cascade, is employed to study leukocyte-endothelial cell interactions in inflammatory disease.

炎症時の白血球-内皮細胞相互作用を研究するための微生理学的システム

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...

Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells to Brain Microvascular Endothelial Cell-Like Cells with a Mature Immune Phenotype

Blood-brain barrier (BBB) dysfunction is a pathological hallmark of many neurodegenerative and neuroinflammatory diseases affecting the central nervous system (CNS). Due to the limited access to disease-related BBB samples, it is still not well understood whether BBB malfunction is causative for disease development or rather a consequence of the neuroinflammatory or neurodegenerative process. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) therefore provide a novel opportunity to establish in vitro BBB models from healthy donors and patients, and thus to study disease-specific BBB characteristics from individual patients. Several differentiation protocols have been established for deriving brain microvascular endothelial cell (BMEC)-like cells from hiPSCs. Consideration of the specific research question is mandatory for the correct choice of the respective BMEC-differentiation protocol. Here, we describe the extended endothelial cell culture method (EECM), which is optimized to differentiate hiPSCs into BMEC-like cells with a mature immune phenotype, allowing the study of immune cell-BBB interactions. In this protocol, hiPSCs are first differentiated into endothelial progenitor cells (EPCs) by activating Wnt/&#946;-catenin signaling. The resulting culture, which contains smooth muscle-like cells (SMLCs), is then sequentially passaged to increase the purity of endothelial cells (ECs) and to induce BBB-specific properties. Co-culture of EECM-BMECs with these SMLCs or conditioned medium from SMLCs allows for the reproducible, constitutive, and cytokine-regulated expression of EC adhesion molecules. Importantly, EECM-BMEC-like cells establish barrier properties comparable to primary human BMECs, and due to their expression of all EC adhesion molecules, EECM-BMEC-like cells are different from other hiPSC-derived in vitro BBB models. EECM-BMEC-like cells are thus the model of choice for investigating the potential impact of disease processes at the level of the BBB, with an impact on immune cell interaction in a personalized fashion.

Here, we describe a protocol, the extended endothelial cell culture method (EECM), that allows differentiation of pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell (BMEC)-like cells. These cells show endothelial cell adhesion molecule expression and are thus a human blood-brain barrier model suitable to study immune cell interactions in vitro.

ヒト人工多能性幹細胞の成熟免疫表現型を有する脳微小血管内皮細胞様細胞への分化

Blood-brain barrier (BBB) dysfunction is a pathological hallmark of many neurodegenerative and neuroinflammatory diseases affecting the central nervous ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

ヒト幹細胞由来内皮細胞およびGABAergicニューロンの移動、化学誘引、共培養アッセイ

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

神経科学

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

内皮細胞接着性の定量<em&gt;インビトロ</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

生物学

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and subsequent vision loss. The inner blood-retinal barrier (iBRB) is mainly composed of retinal vascular endothelium with low permeability under physiological conditions. This feature of low permeability is tightly regulated and maintained by low rates of paracellular transport between adjacent retinal microvascular endothelial cells, as well as transcellular transport (transcytosis) through them. The assessment of retinal transcellular barrier permeability may provide fundamental insights into iBRB integrity in health and disease. In this study, we describe an endothelial cell (EC) transcytosis assay, as an in vitro model for evaluating iBRB permeability, using human retinal microvascular endothelial cells (HRMECs). This assay assesses the ability of HRMECs to transport transferrin and horseradish peroxidase (HRP) in receptor- and caveolae-mediated transcellular transport processes, respectively. Fully confluent HRMECs cultured on porous membrane were incubated with fluorescent-tagged transferrin (clathrin-dependent transcytosis) or HRP (caveolae-mediated transcytosis) to measure the levels of transferrin or HRP transferred to the bottom chamber, indicative of transcytosis levels across the EC monolayer. Wnt signaling, a known pathway regulating iBRB, was modulated to demonstrate the caveolae-mediated HRP-based transcytosis assay method. The EC transcytosis assay described here may provide a useful tool for investigating the molecular regulators of EC permeability and iBRB integrity in vascular pathologies and for screening drug delivery systems.

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

This protocol illustrates an in vitro endothelial cell transcytosis assay as a model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability by measuring the ability of human retinal microvascular endothelial cells to transport horseradish peroxidase across cells in caveolae-mediated transcellular transport processes.

内血網膜バリア透過性を評価する ためのin vitro モデルとしての内皮細胞トランスサイトーシスアッセイ

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

医学

Assessing Interneuron Response to Chemoattractive Cues from Periventricular Endothelial Cells

Source: Datta, D., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/60295">Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video shows a method to test interneuron migration in response to chemoattractive cues from periventricular endothelial cells (PVECs). Interneurons are placed in a central compartment, with PVECs and control cells on either side. Increased migration towards PVECs indicates a positive response to their chemoattractive signals.

脳室周囲内皮細胞からの化学療法引力の手がかりに対する介在ニューロン応答の評価

1. Chemo-attraction Assay

	Place a three-well culture insert in the center of a poly-L-ornithine/laminin-coated 35 mm dish using sterile tweezers.
	Turn ...

有害化学物質への曝露後の内皮細胞の遊走の評価

要約

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フローの状況下で好中球移住研究におけるヒト臍帯静脈内皮細胞とそれらの使用の分離

生理フローの状況の下で循環細胞のケモカイン指向溢出を研究する新規三次元フローチャンバーデバイス

好中球遊出の下で生理的流れの間に内皮細胞 - 細胞接合のリアルタイムイメージング

体外流れ球サブポピュレーションの募集の同時研究

炎症時の白血球-内皮細胞相互作用を研究するための微生理学的システム

ヒト人工多能性幹細胞の成熟免疫表現型を有する脳微小血管内皮細胞様細胞への分化

ヒト幹細胞由来内皮細胞およびGABAergicニューロンの移動、化学誘引、共培養アッセイ

内皮細胞接着性の定量

内血網膜バリア透過性を評価するためのin vitro モデルとしての内皮細胞トランスサイトーシスアッセイ

脳室周囲内皮細胞からの化学療法引力の手がかりに対する介在ニューロン応答の評価

有害化学物質への曝露後の内皮細胞の遊走の評価

要約

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フローの状況下で好中球移住研究におけるヒト臍帯静脈内皮細胞とそれらの使用の分離

生理フローの状況の下で循環細胞のケモカイン指向溢出を研究する新規三次元フローチャンバーデバイス

好中球遊出の下で生理的流れの間に内皮細胞 - 細胞接合のリアルタイムイメージング

体外流れ球サブポピュレーションの募集の同時研究

炎症時の白血球-内皮細胞相互作用を研究するための微生理学的システム

ヒト人工多能性幹細胞の成熟免疫表現型を有する脳微小血管内皮細胞様細胞への分化

ヒト幹細胞由来内皮細胞およびGABAergicニューロンの移動、化学誘引、共培養アッセイ

内皮細胞接着性の定量

内血網膜バリア透過性を評価する ためのin vitro モデルとしての内皮細胞トランスサイトーシスアッセイ

脳室周囲内皮細胞からの化学療法引力の手がかりに対する介在ニューロン応答の評価

内血網膜バリア透過性を評価するためのin vitro モデルとしての内皮細胞トランスサイトーシスアッセイ