We thank members of the UNC Zebrafish Aquaculture facility for maintenance of the zebrafish. We would also like to thank Diagnosys, LLC for assistance with the setup of the ERG apparatus. Additional thanks go to Dr. Portia McCoy and the laboratory of Dr. Ben Philpot for assistance with electrophysiological methods. We also wish to thank Lizzy Griffiths for her illustration of a larval zebrafish. This work was supported by National Institutes of Health awards F32 EY022279 (to J.D.C) and R21 EY019758 (to E.R.W).

動物の維持費と実験的なプロトコルは、ノースカロライナ大学チャペルヒル校の制度動物管理使用委員会によって承認され、実験動物福祉のNIH事務所との評価と実験動物管理国際認定協会のすべての要件を満たしていた。 注：標準のゼブラフィッシュの飼育および維持のためのERG分析用の幼虫を入手するには、公開されたプロトコルが18を採用した。幼虫は、自然繁殖を介して取得し、14時間の明/ 10時間暗サイクルの下に収納されている。このプロトコルは、5-7日後に受精（DPF）で幼虫のために最適化されているが、理想的に手続きに小さな変更を加えて、古い魚を行うことができた。ここでは、5 DPFで、野生型ゼブラフィッシュ幼生のTL株を使用しています。 1.マイクロピペットプロダクション<ol><li> 1.5×0.86ミリメートル（内径によって外径）と火災研磨ホウケイ酸ガラスキャピラリーを使用して複数のマイクロピペットを引き出しますフィラメント（温度、821°Cの融点）及びP-97フレーミング/ブラウンマイクロピペットプラーボックス熱フィラメントを装備。 表1に記載のマイクロピペットを形作るためのプログラムを使用してください。 </li><li>先端の直径が10〜15ミクロンであり、円滑な先端開口（ すなわち、ギザギザのエッジ）を持っていることを確認するために、適切な目盛の定規で顕微鏡下で各マイクロピペットを確認してください。 </li><li>先端の損傷や埃への暴露を防止するために、マイクロピペットを慎重に格納します。ストレージオプションは、ラボテープ、フォーム内張りの箱、または市販のマイクロピペット貯蔵容器とのペトリ皿が含まれています。 注：他のマイクロピペットプラーとガラスキャピラリーは、正しいマイクロピペットの直径と高品質の先端が達成される限り長く使用することができる。 </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 圧力 </td><td> ヒート </td><td> 引く </td><td> 速度 </tD&gt; <td> 時間 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 560 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 450 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 410 </td><td> 55 </td><td> 40 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> 表1：ボックスの熱フィラメントを装備P-97フレーミング/ブラウンマイクロピペットプラーを使用して、マイクロピペットを製造するためのプログラムのマイクロピペットは、フィラメントを有する熱加工ホウケイ酸ガラスキャピラリーを1.5×1.0ミリメートル2（内径によって外径）を使用して行われる。 （融解温度は、821°C）。 2.バッファの準備<ol><li>微小電極のキャピラリーでろ過し、酸素金魚リンゲルバッファ19を使用して、幼虫が実験のために置かれ、その上にポリビニルアルコール（PVA）スポンジを飽和させる。また、E3を使用<html>胚メディアまたはハンクス液。 </li><li>表2に記載したようにpHを7.8に調整し、0.22μmのフィルターを用いて滅菌し、4℃で10倍株式を保管10倍金魚リンゲル液を準備します。 </li><li>脱イオン、蒸留水で1倍する10倍のリンゲル液を希釈することによって、実験の日に作業溶液を作成します。 0.22μmのフィルターシステムを使用してフィルタリングします。 10分間、95％O 2/5％CO 2ガスでバブリングすることによって酸素化物。キャップはしっかりとその後ソリューションが含酸素のままであることを確認します。 </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> NaClを</td><td> 1.25 M </td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> 26 mMの</td></tr><tr><td>のCaCl 2 </td><td> 25 mMの</td></tr><tr><td>のMgCl 2 </td><td> 10 mMの</td></tr><tr><td>グルコース</td><td> 100 mMの</td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 100 mMの</td></tr></tbody></table>jove_content &quot;&gt; 表2：10倍金魚のリンゲル液の調製。 3.電図プラットフォーム<ol><li>信号対雑音比を改善するためにファラデーケージ内部の除振台上のERG実験を行う。六角ナットを使用して、防振テーブルにカスタムスチールプラットフォームを取り付けます。光源下でテーブルの上に粘弾性ウレタンポリマーの衝撃吸収底の可動プラスチックプラットフォームを置きます。 </li><li>可動プラスチックプラットフォームでダウンを目的とした、磁化スタンド付きカメラを、配置します。可動プラスチックプラットフォームの右側にある2番目の磁化されたスタンド付（記録微小電極を保持する）マイク​​ロマニピュレーターを配置します。カメラとマイクロマニピュレーターが他の機器の動きによって妨害されないことを、彼らは、光源からの照明をブロックしないことを確認してください。 </li><li>ビデオモニターにカメラを接続し、の目を見ることそれを配置適切な位置に電極を配置するための幼虫。 </li><li>セットアップが正常に銅線で接地されていることを確認してください。ノイズを確認するには、リンゲル液で満たされた35ミリメートルペトリ皿に記録微小電極の参照電極チップを配置します。オシロスコープまたはERG装置の内蔵の機能でセットアップの電気的なノイズレベルを確認してください。ノイズレベルは、ベースラインからせいぜい±10μVでなければなりません。 </li></ol> 4.スポンジ準備<ol><li> 35ミリメートルペトリ皿にぴったりとフィットしますドライPVAスポンジの小さな長方形をカット。スポンジの厚さは、皿の深さよりも大きくするべきではありません。切断のためのきれいなカミソリの刃でカッターナイフを使用してください。 </li><li>参照電極（スポンジの底部または小さい方の端部の一方を垂直にカット蝶上の長さ方向の浅いカットのいずれか）に対応するためにスポンジに追加のカットを行います。 </li><li>化学的に耐性マーカーを使用してくださいカメラを位置決めするために使用することができるスポンジ（幼虫が配置される場所）に小さなドットをマークする。 </li><li>飽和するまでリンゲル液中のPVAスポンジを浸す。 2-3回を削除し、ペーパータオル上ですぐにブロット。きれいな35ミリメートルペトリ皿にスポンジを置きます。 </li><li>マークがカメラによって視覚化することができるようにプラスチック製のプラットフォーム上にスポンジを含むペトリ皿を置きます。 </li></ol> 5.電極の準備 NOTE：ゼブラフィッシュセットアップはリンガー溶液、飽和PVAスポンジと角膜と接触して記録電極と接触する基準電極から成る。参照電極は銀/塩化銀ペレットで構成されている。記録電極は、プルガラスマイクロピペットリンゲル液を充填し、Ag線を含む微小電極ホルダに保持されている。 <ol><li> 5分（記録MICR 6-9％の次亜塩素酸ナトリウム（漂白剤）でそれらを浸漬することによって電極を塩化物oelectrode線）または15分（参照電極）。 5分間キムワイプ上の空気乾燥。 <ol><li>ステップ4.2で行われたカットのスタイルに応じて、スポンジ（底部の長さ方向の浅いカット用）（垂直蝶カットの場合）または下に参照電極の銀/塩化銀ペレットを配置。記録システムに基準電極リードを取り付けます。 </li><li> ERGセットアップはスペースの制約があり、またはAg / AgCl電極から特に強い太陽光発電アーティファクトが存在する場合に代替的に、光路の外に電極を移動させるために、寒天、塩橋を介してスポンジを参照電極に接続する。 </li></ol></li><li> 5ミリリットル非ルアーロックシリンジに適切なサイズのチューブの約40センチ取り付けます。リンゲル液で注射器を埋める。圧力ポートを有する微小電極ホルダーは、通常、「3/32」を1/16の内径とチューブを収容するためのアダプターで1/8 &quot;または5/32」を出荷する。 </li><li>で1ml非ルアーロックシリンジに充填リンゲル液および、マイクロフィルを用いて、慎重に微小電極ホルダーを埋める。気泡の形成を防ぐ。 </li><li>チューブを微小電極ホルダーの圧力ポートに5ミリリットルの注射器を取り付け、微小電極ホルダーはリンゲル液の完全であることを確実にするためにそれを使用。マイクロFILとリンゲル液で満たされた1-mlの注射器を使用して、先端からマイクロピペットガラスを記入し、気泡が存在しないことを確認してください。 </li><li>電極線をまっすぐに保つように注意して、微小電極ホルダーにガラスマイクロピペットを取り付けます。いったん確保し、ソリューションの小さな量は先端に表示されるまで慎重に微小電極を通じてリンゲル液を強制的に5ミリリットル注射器を使用しています。マイクロピペットチップで、塵や塩類集積による気泡、ならびに閉塞の形成を防止する（角膜に適用されていない）注射器に圧力を時折アプリケーション。 <ol><li>ソリューションはストリームとして出てくる場合は、Gを交換小娘マイクロピペット、先端開口が大きすぎる、または破損しているよう。 </li></ol></li><li>慎重にマイクロマニピュレータにおける記録微小電極を配置し、記録システムのリードを取り付ける。 </li></ol> 6.電図解析注：記録の準備が間接白色光の低レベルの下で実行されるときにより幼虫の網膜の錐優勢に、高品質のERG結果を得ることができる（&lt;1ルクス）または短い周期を有する（&lt;1分）より高い強度の（ ≤250ルクス）作業灯。暗順応の短い期間がまだ記録の前に必要とされる（ステップ6.7参照）。しかし、実験は、赤外線感応カメラを使用して暗赤色または赤外光で行うことができる。全ての実験は、UNCゼブラ水産養殖施設から濾過滅菌（0.22μmの）システム水中で実施したが、代替胚培地を使用することができる。 <ol><li>約1を測定するカット紙タオルの正方形cm 2である 。 </li><li>単離された円錐質量受容器電位を測定する場合は、5分間500μM（±）-2-アミノ-4-ホスホノ酢酸（APB）を使用してシステムの水に3-5幼虫をインキュベートする。 NOTE：APBがアクティブ（L）のラセミ混合物とAP4の不活性な（R）形態であるが、L-AP4と同様に有効であり、安価である。 </li><li>応答しない、約1〜2分まで、0.02％とトリカイン（w / v）のシステム水に3-5の幼虫を麻酔。 </li><li>慎重に最小限の照明（&lt;1分間≤250ルクス）を使用して、解剖ステレオスコープの下にペーパータオルの正方形の上に個々の幼虫を転送するためにパスツールピペットとピペットポンプを使用してください。各幼虫の位置を確認し、遮蔽されていない目で、背側を上にある候補者を選択します。 <ol><li>拡張された録音（&gt; 30分）、に身体を窓ガラスが、細かいラクダ毛のブラシを使用して、3％メチルセルロースで頭を含めないことによって湿った幼虫を保つ。 </li></ol></li><li>鉗子を使用して、ペーパータオルsquarを転送する湿ったPVAスポンジに幼虫とE。 <ol><li>長時間録画（&gt; 30分）、蒸留水を含有するサイドアームフラスコ中AIRSTONEを通してガスをバブリングすることにより幼虫にわたって水飽和、100％O 2ガスの連続流を適用する。幼虫の頭の近くに加湿酸素を運ぶフラスコサイドアームを出て、チューブを置きます。 注：ステップ6.4.1とステップ6.5.1は、魚16の寿命を延ばすます。 </li></ol></li><li>最小限の照明の下で、鼻および眼の尾側端部の間の中間点での微小電極の先端を位置決めするためにマイクロマニピュレータとカメラを使用して、角膜の背側限界に押し穏やか。 注：角膜の遠い遠位領域への電極先端の誤配置が逆極性のERG波形になることができます。 </li><li> 5〜10分間暗適応させるために幼虫を許可する。 </li><li>のAvaIを用いたLED光源や光学刺激装置から提供される光にレコードのテストフラッシュ応答可能な標識刺激と記録装置。実験に合わせて、フラッシュの強度、フラッシュの長さ、フラッシュカラー、背景輝度や色などのプロトコルパラメータ及びフィルタ設定を調整する。 </li><li>実験が終了したら、AVMA / IACUCガイドラインに従って幼虫を安楽死させる。 </li></ol>

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利害の衝突が宣言されていない。

このプロトコルでは、幼虫のゼブラフィッシュのERG記録のための簡単​​な手順が詳しく説明されている。この手順は、心に留めておくべきである手順を通じて、いくつかの重要なステップである視覚的function.Thereを迅速かつ総合的な分析を可能にします。ゼブラフィッシュの幼虫は、潜在的な薬物治療の間、死を防止し、ERG記録中に長期の生活を確保するために、実験の前に健康でなけれ?...

電図（ERG）は、ヒトにおける網膜の機能を決定するための臨床で広く用いられている非侵襲的電気生理学的方法である。光刺激に応答した電気的活動は、角膜の外面に記録電極を配置することによって測定される。刺激パラダイムと応答波形の特性が応答に貢献する網膜神経細胞を定義する。この方法は、マウスおよびゼブラフィッシュを含む多くの動物モデルの使用に適合されている。典型的な脊椎動物ERG応答は、4つの主要コンポーネントがあります。光受容体細胞の活性に由来し、角膜陰性電位であるA波を、。 b波、ON双極細胞由来の角膜陽性の可能性。 d波、OFF双極細胞の活性と解釈角膜陽性の可能性。とb波の後に数秒を発生し、C波は、ミュラーグリアとRETの活動を反映しているノミナル色素上皮1-4。ヒトとモデル動物で歴史とERG分析の原理を理解するための追加の参照は、ユタ大学とそのようなビジョン4、5の臨床電気生理学の原則と実践などのテキストから、オンライン教科書、Webvisionです。 ゼブラのフィッシュ（ゼブラフィッシュ）は、長いによる臓器系の非侵襲的な形態学的分析を可能にし、その急速な成熟と透明性、に、脊椎動物の発生のモデルとして好まれた行動アッセイおよび順方向および遺伝子スクリーニングを逆転されている（レビューのために、Fadoolを参照してくださいダウリング6）。ゼブラフィッシュの幼虫は、その高い繁殖力と組み合わせると、それらのハイスループット生物学的分析のための優れた動物モデルにする遺伝的および薬理学的操作、に非常に適している。幼虫のゼブラフィッシュでロッドに錐体の比率が高い - およそ1：マウスと比較して1（〜3％のコーンS） -コーン機能7-9の研究のために特に有用なものにする。 脊椎動物の網膜では、コーンは、ロッド10の前に開発する。興味深いことに、ゼブラフィッシュコーンは、そのステージ6、11、12でコーンの選択的な電気生理学的解析を可能にし、早ければ4 DPFとして動作可能である。対照的に、ロッドにおけるERG応答は、11と13のdpf 21との間に現れる。したがって、4-7でのゼブラフィッシュの幼虫は、DPFすべてのコーン網膜として機能を発揮する。しかし、4-7 DPFの幼虫のネイティブ明所視ERG応答は、b波によって支配されている。 （+） - - などLなどの薬理学的薬剤の適用2-アミノ-4-ホスホノ酪酸（L-AP4）、ON双極細胞によって発現される代謝調節型グルタミン酸（mGluR6）受容体アゴニスト、効果的にブロック生成b波および孤立コーン質量受容器電位（「波」）14-17を明らかにする。 ここでは、シンプルでreliablを記述するゼブラフィッシュの幼生との使用に適合されたマウスを使用するために設計された市販のERG装置を用いてERG分析のための電子方法。このシステムは、視覚感度及び明順応16に寄与するシグナル伝達経路の同定を研究者を助けるために、遺伝的背景を変化させること、ならびに薬理学的薬剤で処理されたものなどのゼブラフィッシュの幼生に利用することができる。このプロトコルで概説実験手順はビジョンに係る生体さまざまな質問に答えるためのERG分析の使用に研究者を導く、そして柔軟なERGセットアップの建設のデモンストレーションを行います。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2170">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"><a name="RANGE!A1:D30">Name of the Material/Equipment</a></td>
			<td style="width:168px;">Company</td>
			<td style="width:165px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:1504px;">Comments/ Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Faraday cage</td>
			<td>80/20 Inc</td>
			<td>custom</td>
			<td>Custom designed aluminum &#34;Industrial Erector Set&#34; for Cage framework</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PVA sponge</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B000ZOWG1C</td>
			<td>Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">150 ml Sterile Filter systems</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431154</td>
			<td>Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Espion E2</td>
			<td>Diagnosys, LLC</td>
			<td>contact</td>
			<td>Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Colordome</td>
			<td>Diagnosys, LLC</td>
			<td>contact</td>
			<td>Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micromanipulator</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-024-R</td>
			<td>Holding and positioning the recording microelectrode</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic ring stand</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-025-MB</td>
			<td>Holding and positioning of the camera and refrence electrode</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lead extensions</td>
			<td>Grass Technologies</td>
			<td>F-LX</td>
			<td>Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:333px;">Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor</td>
			<td>Grass Technologies</td>
			<td>DF-215/10</td>
			<td>Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Window screen frame (metal) and spline</td>
			<td>Lowes or Home Depot</td>
			<td>various</td>
			<td>For attaching copper mesh to Faraday cage framework</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Steriflip 50 ml filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td>Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BNC adaptor</td>
			<td>Monoprice</td>
			<td>4127</td>
			<td>Connecting camera to BNC cable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BNC cable</td>
			<td>Monoprice</td>
			<td>626</td>
			<td>Connecting camera to video adaptor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Camera lens</td>
			<td>Navitar</td>
			<td>1582232</td>
			<td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Camera coupler</td>
			<td>Navitar</td>
			<td>1501149</td>
			<td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luna BNC to VGA + HDMI Converter</td>
			<td>Sewell</td>
			<td>SW-29297-PRO</td>
			<td>BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">APB</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1910</td>
			<td>mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Borosilicate glass</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF-150-86-10</td>
			<td>Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821&#176;C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">P97 Flaming/Brown puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P97</td>
			<td>For pulling glass micropipettes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sorbothane sheet</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SB12A</td>
			<td>Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>B2436F</td>
			<td>Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Passive Isolation Mounts</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PWA074</td>
			<td>Provides vibration isolation to breadboard</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Copper mesh</td>
			<td>TWP</td>
			<td>022X022C0150W36T</td>
			<td>To line Faraday Cage</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53502-233</td>
			<td>Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-608</td>
			<td>Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Camera</td>
			<td>Watec</td>
			<td>WAT-902B</td>
			<td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tricaine (MS-222)</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>Tricaine-S</td>
			<td>Pharmaceutical-grade anesthetic,</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro-fil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF28G-5</td>
			<td>Filling microelectrode holder and microelectrode glass</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microelectrode holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MEH2SW15</td>
			<td>Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reference Electrode</td>
			<td>WPI</td>
			<td>DRIREF-5SH</td>
			<td>Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reference Electrode (alternative)</td>
			<td>WPI</td>
			<td>EP1</td>
			<td>Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Low-noise cable for Microelectrode holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>13620</td>
			<td>Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroretinogram analysis of the visual response in zebrafish larvae

電図（ERG）は、網膜機能を決定するための非侵襲的な電気生理学的手法である。角膜の表面上の電極の配置を介して、光に応答して生成された電気的活動を測定し、 インビボでの網膜細胞の活性を評価するために使用することができる。この原稿は、ゼブラフィッシュで視覚機能を測定するためのERGの使用が記載されている。ゼブラフィッシュは、長いによるモルホリノオリゴヌクレオチド、および薬理学的操作による遺伝子抑制を容易に脊椎動物の開発のためのモデルとして利用されてきた。 5-10 DPFでは、唯一のコーンは、幼虫の網膜で機能的である。したがって、ゼブラフィッシュは、他の動物とは異なり、 インビボでの錐視覚機能の研究に有用なモデル系である。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの研究を行う研究室で一般的な標準麻酔、マイクロマニピュレーションと実体顕微鏡のプロトコルを使用しています。概説された方法は、標準的な電気生理学EQを利用する幼虫の角膜に記録微小電極の配置をガイドするuipmentと低光カメラ。最後に、本来のマウス用に設計市販のERG刺激/記録を容易にゼブラフィッシュでの使用に適合させることができる方法を示す。幼生ゼブラフィッシュのERGは、モルホリノオリゴヌクレオチドの注入により修飾された動物において、円錐視覚機能をアッセイするのに優れた方法ならびにそのようなジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNが）などの新しいゲノム工学技術を提供し、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（TALENs）、及びInterspacedショート回文反復（CRISPR）/ Cas9、大幅にゼブラフィッシュで遺伝子ターゲッティングの効率性と有効性を増加しているそのすべてが定期的にクラスタ化された。さらに、我々は光応答に寄与する分子成分を評価するためにゼブラフィッシュの幼虫を貫通する薬理学的薬剤の能力を利用する。このプロトコルは、研究者によって変更して使用することができるセットアップを概説様々な実験目標に。

多くの研究がこのステージ9、16,20でERG記録を掲載しておりますので、一般的に、ERGをは、5 DPFでゼブラフィッシュ幼生から記録されている。幼虫の応答は、白色LEDの光の20ミリ秒の刺激を使用しない背景照明と暗順応条件下で測定した。私たちは、全体野の光刺激とコンピュータ·コントローラ/レコーダーからなる市販のERGシステムを利用した。刺激装置は、背景とフラッシュ刺激の?...

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Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

ゼブラフィッシュ幼虫における視覚反応の電位図解析

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

electroretinogram-analysis-of-the-visual-response-in-zebrafish-larvae

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.5K ビュー.  University of North Carolina at Chapel Hill. We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

ビデオ: Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

でProprioceptorsの可視化<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫および蛹

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

神経科学

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

半無傷でレーザー照射による神経活動のOptogeneticの摂動<em&gt;ショウジョウバエ</emイン·モーション&gt;幼虫

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

ゼブラフィッシュ幼生における自動化ハイスループット行動分析

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

The Optokinetic Response as a Quantitative Measure of Visual Acuity in Zebrafish

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple response. More recently adult visual behavior in zebrafish has become of interest, but methods to measure specific responses are new coming. To address this gap, we set out to develop a methodology to repeatedly and accurately utilize the optokinetic response (OKR) to measure visual acuity in adult zebrafish. Here we show that the adult zebrafish's visual acuity can be measured, including both binocular and monocular acuities. Because the fish is not harmed during the procedure, the visual acuity can be measured and compared over short or long periods of time. The visual acuity measurements described here can also be done quickly allowing for high throughput and for additional visual procedures if desired. This type of analysis is conducive to drug intervention studies or investigations of disease progression.

Zebrafish have been a valuable tool for many research areas. Here we demonstrate a method to elicit a visual response and calculate a functional visual acuity in the adult zebrafish.

ゼブラフィッシュにおける視力の定量的尺度としての視運動性応答

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the  earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple  ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

同時<em&gt; ex vivoで</emによる二つの網膜の&gt;機能テスト<em&gt; in vivoで</em&gt;電図システム

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

二光子励起レーザーとゼブラフィッシュ幼虫におけるカルシウム イメージング法と行動記録を用いた評価を用いたニューロン集団のアブレーション

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Stimulus-specific Cortical Visual Evoked Potential Morphological Patterns

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using 128-channel high-density electroencephalography (EEG). The specific aim of the described stimuli and analyses is to examine whether it is feasible to replicate previously reported CVEP morphological patterns elicited by an apparent motion stimulus, designed to simultaneously stimulate both ventral and dorsal central visual networks, using object and motion stimuli designed to separately stimulate ventral and dorsal visual cortical networks.&#160; Four visual paradigms are presented: 1. Randomized visual objects with consistent temporal presentation. 2. Randomized visual objects with inconsistent temporal presentation (or jitter).&#160; 3. Visual motion via a radial field of coherent central dot motion without jitter.&#160; 4. Visual motion via a radial field of coherent central dot motion with jitter.&#160; These four paradigms are presented in a pseudo-randomized order for each participant.&#160; Jitter is introduced in order to view how possible anticipatory-related effects may affect the morphology of the object-onset and motion-onset CVEP response.&#160; EEG data analyses are described in detail, including steps of data exportation from and importation to signal processing platforms, bad channel identification&#160;and removal, artifact rejection, averaging, and categorization of average CVEP morphological pattern type based upon latency ranges of component peaks. Representative data show that the methodological approach is indeed sensitive in eliciting differential object-onset and motion-onset CVEP morphological patterns and may, therefore, be useful in addressing the larger research aim. Given the high temporal resolution of EEG and the possible application of high-density EEG in source localization analyses, this protocol is ideal for the investigation of distinct CVEP morphological patterns and the underlying neural mechanisms which generate these differential responses.&#160; &#160; &#160;&#160;

In this paper, we present a protocol to investigate differential cortical visual evoked potential morphological patterns through stimulation of ventral and dorsal networks using high-density EEG. Visual object and motion stimulus paradigms, with and without temporal jitter, are described. Visual evoked potential morphological analyses are also outlined.&#160;&#160;

刺激特異的皮質視覚誘発潜在的形態パターン

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using ...

Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage (ICH). Modelling ICH pre-clinically has proven difficult, and current rodent models poorly recapitulate the spontaneous nature of human ICH. Therefore, there is an urgent requirement for alternative pre-clinical methodologies for study of disease mechanisms in ICH and for potential drug discovery.
The use of zebrafish represents an increasingly popular approach for translational research, primarily due to a number of advantages they possess over mammalian models of disease, including prolific reproduction rates and larval transparency allowing for live imaging. Other groups have established that zebrafish larvae can exhibit spontaneous ICH following genetic or chemical disruption of cerebrovascular development. The aim of this methodology is to utilize such models to study the pathological consequences of brain hemorrhage, in the context of pre-clinical ICH research. By using live imaging and motility assays, brain damage, neuroinflammation and locomotor function following ICH can be assessed and quantified.
This study shows that key pathological consequences of brain hemorrhage in humans are conserved in zebrafish larvae highlighting the model organism as a valuable in vivo&#160;system for pre-clinical investigation of ICH. The aim of this methodology is to enable the pre-clinical stroke community to employ the zebrafish larval model as an alternative complementary model system to rodents.

Here we present a protocol to quantify brain injury, locomotor deficits and neuroinflammation following bleeding in the brain in zebrafish larvae, in the context of human intracerebral hemorrhage (ICH).

ゼブラフィッシュの幼虫を用いて出血性脳卒中の病理学的結果を研究する

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage ...

Systems Analysis of the Neuroinflammatory and Hemodynamic Response to Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a significant public health problem. Repeated exposure to mTBI can lead to cumulative, long-lasting functional deficits. Numerous studies by our group and others have shown that mTBI stimulates cytokine expression and activates microglia, decreases cerebral blood flow and metabolism, and impairs cerebrovascular reactivity. Moreover, several works have reported an association between derangements in these neuroinflammatory and hemodynamic markers and cognitive impairments. Herein we detail methods to characterize the neuroinflammatory and hemodynamic tissue response to mTBI in mice. Specifically, we describe how to perform a weight-drop model of mTBI, how to longitudinally measure cerebral blood flow using a non-invasive optical technique called diffuse correlation spectroscopy, and how to perform a Luminex multiplexed immunoassay on brain tissue samples to quantify cytokines and immunomodulatory phospho-proteins (e.g., within the MAPK and NF&#954;B pathways) that respond to and regulate activity of microglia and other neural immune cells. Finally, we detail how to integrate these data using a multivariate systems analysis approach to understand the relationships between all of these variables. Understanding the relationships between these physiologic and molecular variables will ultimately enable us to identify mechanisms responsible for mTBI.

This protocol presents methods to characterize the neuroinflammatory and hemodynamic response to mild traumatic brain injury and to integrate these data as part of a multivariate systems analysis using partial least squares regression.

外傷性脳損傷に対する神経炎症および血行動態応答のシステム解析

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a significant public health problem. Repeated exposure to mTBI can lead to cumulative, long-lasting functional ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

経瞳孔二光子マウス網膜のin vivoイメージング

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

ゼブラフィッシュ幼虫における視覚反応の電位図解析

要約

さらに動画を探す

この動画の章

でProprioceptorsの可視化

半無傷でレーザー照射による神経活動のOptogeneticの摂動

ゼブラフィッシュ幼生における自動化ハイスループット行動分析

ゼブラフィッシュにおける視力の定量的尺度としての視運動性応答

同時

二光子励起レーザーとゼブラフィッシュ幼虫におけるカルシウムイメージング法と行動記録を用いた評価を用いたニューロン集団のアブレーション

刺激特異的皮質視覚誘発潜在的形態パターン

ゼブラフィッシュの幼虫を用いて出血性脳卒中の病理学的結果を研究する

外傷性脳損傷に対する神経炎症および血行動態応答のシステム解析

経瞳孔二光子マウス網膜のin vivoイメージング

ゼブラフィッシュ幼虫における視覚反応の電位図解析

要約

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でProprioceptorsの可視化

半無傷でレーザー照射による神経活動のOptogeneticの摂動

ゼブラフィッシュ幼生における自動化ハイスループット行動分析

ゼブラフィッシュにおける視力の定量的尺度としての視運動性応答

同時

二光子励起レーザーとゼブラフィッシュ幼虫におけるカルシウム イメージング法と行動記録を用いた評価を用いたニューロン集団のアブレーション

刺激特異的皮質視覚誘発潜在的形態パターン

ゼブラフィッシュの幼虫を用いて出血性脳卒中の病理学的結果を研究する

外傷性脳損傷に対する神経炎症および血行動態応答のシステム解析

経瞳孔二光子マウス網膜のin vivoイメージング

二光子励起レーザーとゼブラフィッシュ幼虫におけるカルシウムイメージング法と行動記録を用いた評価を用いたニューロン集団のアブレーション