Name: experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres
Uploaded: 2015-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
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We wish to thank Peter Munro PhD for his assistance with optic nerve sectioning. This study was supported by the Medical Research Council (G0901303), and in part by the Dorothy Hodgkin Postgraduate Award/Medical Research Council, the Helen Hamlyn Trust, Fight for Sight, and Moorfields special trustess,.

倫理声明 ：すべての動物実験は、施設内動物管理使用委員会（IACUC）に従って行われており、英国内務省のガイドラインと一致して承認された（ <a href="http://goo.gl/FLkirW" target="_blank">http://goo.gl/FLkirW</a> 、最後の6月番目の 10にアクセス、2014）と、眼科及び視覚研究（中動物の使用に関するARVO声明<a href="http://goo.gl/4LFOjD" target="_blank">http://goo.gl/4LFOjDは</a> 、最後の10 番目の 6月、2014年）をアクセスした。 1.高眼圧症の誘導<ol><li> Samsel らの方法に基づいて、ブラウンノルウェーラットの前房内に常磁性ミクロスフェアの一側性注射を介して眼内圧（IOP）を上昇させることにより実験的緑内障を誘発する。これらは、検証される必要があるが、3他の着色されたラットは、適切であり得るユーザーによる最初。 </li><li>ハウス250〜300 gの女性食料と水を自由に摂取して、IOP 7日内変動を最小限に抑えるために一定の低照度環境でのEX-ブリーダーブラウンノルウェーラット（40〜60ルクス）。 </li><li>ラットの眼9で使用するために較正されたリバウンド眼圧計を使用して、前麻酔ビード注射覚醒動物8ベースラインIOP測定を行う。 IOPは、5つの測定値の平均値とする。 </li><li>腹腔内に納入37.5 mg / kgをケタミン、および0.25 mg / kgをメデトミジン塩酸塩としたラットを麻酔し。動物の後足反射神経をテストすることによって麻酔の深さを確認し、ヨウ素アプリケーション（ステップ1.5を参照）、およびビーズ注入をポビドン前に（ステップ1.8を参照）。鎮痛のために0.5％のプロパラカイン塩酸塩を管理します。 注：いずれかの段階で瞳孔を拡張しないでください。これは、ビーズが隅角に優れ落ち着く、とレンズへの結合を防ぐのに役立ちます。非手術反対側の眼に角膜の乾燥を防ぐために、眼軟膏を適用します。 </li><li> W注射前に水10 5分で5％ポビドンヨードと作動目を灰。 </li><li> 5分後、滅菌ガーゼを使用してオフにポビドンヨードを吸い上げ、0.9％滅菌生理食塩水で目を洗う。滅菌生理食塩水の定期的なアプリケーションとの麻酔中湿った目を離さない。 </li><li>目の周りのトロイダル磁石を配置します。 </li><li> 33 Gベベル針を使用して、前房内にハンクス平衡塩溶液（HBSS）で8μmの磁気マイクロスフェアを滅菌ガンマ線照射の30 mg / mlのを含む溶液25μlを注入。 <ol><li>ビーズを調製するために、最終の30 mg / mlの溶液を作成する前に、1mlのHBSSで5分間、10,000×gで3回遠心分離し、再懸濁することにより洗浄する。全体の無菌状態を維持してください。 </li><li>注射のために、アイリス外傷のリスクを最小限に抑えるために、アイリスに針を挿入しないように注意してください。これはに平行として、角膜表面に対して接線針を配向することによって防止することができますできるだけアイリス。これはまた、注射部位からのビーズの損失を最小限に抑えるのに役立つ。 注：IOPを上げるために重要である隅角、周りにも分布を確実にするために急速にビーズを注入。また、ストアビーズ、針と磁性環別々ビーズは、それらが困難シリンジにロードし、注入すること、クラスターを形成せず、針が磁化されないように。 </li></ol></li><li>ビーズは小柱網から水の排水を妨げるために隅角に落ち着くことを保証するために1分後に注射のために所定の位置に針を残します。わずかに角度がビーズ後の針は、最初はIOPの一過性の増加を最小限に抑えるために、水の一部漏出を可能にするために定住している。手術の最後に最初のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で針を介してフラッシュし、その後、蒸留水、続いて70％エタノールは、別個の手順において、ニードルの継続的な使用を確保する。あるいは、使用することができます使い捨ての針正しいゲージと注射器の組み合わせが利用可能な場合。オプション：針はそれらの使用を延長するbevellerを使用して先鋭化することができる。 </li><li>必要であれば、この段階では、マグネットを削除し、不完全な被覆の領域にビーズを描画するためにそれを使用。 </li><li>ビーズが隅角にうまく解決することを確認するために、さらに10分後に、注射のために目の周りの所定の位置に磁石のままにしておきます。 </li><li> 0.25 mg / kgをatipemezole塩酸塩を用いて逆麻酔。 </li><li>感染を予防するために局所的に、例えばゲンタマイシン又はテラマイシンために、クロラムフェニコール、または他の抗生物質軟膏を管理、および鎮痛のための0.5％塩酸プロパラカイン。回復が完了するまで、そのような栄養補助食品または湿らせた通常の食事として、追加の栄養と暖かいボックスと電源に転送し、その後、彼らは動きを取り戻すまで、ヒートマットの上に回復する動物のままにしておきます。全身または局所鎮痛は、手術後の痛みの24時間の兆候を示す動物に与えられるべきである。 THESの場合Eの症状は治療にもかかわらず持続する、動物が人道的に殺処分されるべきである。 </li><li>無操作コントロールとして反対側の目を使用してください。 </li><li>ビーズ投与後2〜3日ごとに、その後、ラットの目9で使用するために校正さリバウンド眼圧計を使用して2〜3日ごとにIOP測定を行う。 </li><li> 1）IOPが5 mmHgのことで反対側の制御圧力以上に上昇した場合、および2）60 mmHgのを超えていない：研究で目を含むための基準とすることができる。 </li><li> （通常は1週間後に注射による）ベースラインに圧力戻り、研究に含めるべきではない目は、しかし、それは、必要に応じて、高IOPを開発するために失敗するの目に再注入するビーズが可能である。 </li><li>実験の終了時にCO 2窒息により動物を安楽死させる。 </li><li>眼および視神経を分析し、さらなる組織学的分析のために一晩、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定する。 </li></ol> 2. TUNEL Sを使用して、網膜神経細胞のダメージを評価するtaining <ol><li>製造業者の説明書に従って、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介dUTPニック標識（TUNEL）アッセイretinasuseホールマウント内のアポトーシス細胞を定量化する。 </li><li>リン酸緩衝生理食塩水（T-PBS）中の0.3％トリトンX-100で3×5分間洗浄し、アイカップから網膜を解剖。 </li><li> 2時間、3％のT-PBSで組織を透過性。 </li><li> 37℃で1時間TUNEL反応液中でのインキュベーションの前に、10分間の平衡化バッファーで網膜を予め平衡化。 </li><li> 5μMDAPIを含む0.3％T-PBSですすぎ、0.3％T-PBSで3×5分間組織を洗浄し、実装メディアにフラットマウント。 </li><li> TUNEL陽性の核が20倍の倍率で神経節細胞層を通して10ミクロンのzスタックを取る共焦点顕微鏡を使用して定量化する。全体mounあたり12画像の合計を与え、網膜の遠い周辺部に半ば周囲には、視神経に近い所で、4花びらのそれぞれに3画像を撮影し、tは、約7000の細胞をサンプリングする。形態学的基準は、神経細胞からの非ニューロン（内皮細胞およびグリア）細胞を区別し。 </li><li>唯一のDAPIチャネルを使用して画像化する領域を選択して、処置群に捜査をマスクする。 </li></ol> 3.トルイジンブルー染色を用いて視神経損傷の評価<ol><li>一晩4℃でカルノフスキーの溶液中で視神経を修正。 </li><li> 1％（w / v）の四酸化オスミウムで2時間の試料を処理し、その後、100％エタノールで脱水する。 </li><li> 30分間のプロピレンオキシドで視神経をインキュベートし、プロピレンオキシドの50:50混合物中に置く：アラルダイト一夜。 </li><li> 60℃で一晩インキュベートし、100％アラルダイトこの溶液を、変更する。 </li><li>カット半薄切片（0.75ミリメートルの厚さ）し、光学顕微鏡による検査の前に50％エタノール中の1％トルイジンブルー/ホウ砂（TB）で染色する。 </li></ol> 4.統計分析<ol><li>統計的ANAを実施適切な統計ソフトウェアパッケージを使用して溶解する。ニューマン-Keulのポストホック検定を二元配置ANOVAは、IOPが経時的に変化するための統計的有意性を計算するために使用され得る。 </li><li> 0.05未満のp値を有意とみなしてもよい。 </li></ol>

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	<li>Quigley, H. A., Broman, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+number+of+people+with+glaucoma+worldwide+in+2010+and+2020.">The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020.</a> Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).</li><li>Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology+and+treatment+of+glaucoma:+a+review.">The pathophysiology and treatment of glaucoma: a review.</a> JAMA. 311 (18), 1901-1911 (2014).</li><li>Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+induction+of+experimental+glaucoma+using+magnetic+microspheres.">A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (3), 1671-1675 (2011).</li><li>Libby, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherited+glaucoma+in+DBA/2J+mice:+pertinent+disease+features+for+studying+the+neurodegeneration.">Inherited glaucoma in DBA/2J mice: pertinent disease features for studying the neurodegeneration.</a> Vis Neurosci. 22 (5), 637-648 (1017).</li><li>Morrison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+intraocular+pressure+and+optic+nerve+injury+models+in+the+rat.">Elevated intraocular pressure and optic nerve injury models in the rat.</a> J Glaucoma. 14 (4), 315-317 (2005).</li><li>Levkovitch-Verbin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translimbal+laser+photocoagulation+to+the+trabecular+meshwork+as+a+model+of+glaucoma+in+rats.">Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (2), 402-410 (2002).</li><li>Moore, C. G., Johnson, E. C., Morrison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythm+of+intraocular+pressure+in+the+rat.">Circadian rhythm of intraocular pressure in the rat.</a> Curr Eye Res. 15 (2), 185-191 (1996).</li><li>Morrison, J. C., Jia, L., Cepurna, W., Guo, Y., Johnson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+and+sensitivity+of+the+TonoLab+rebound+tonometer+in+awake+Brown+Norway+rats.">Reliability and sensitivity of the TonoLab rebound tonometer in awake Brown Norway rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (6), 2802-2808 (2009).</li><li>Wang, W. H., Millar, J. C., Pang, I. H., Wax, M. B., Clark, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+measurement+of+rodent+intraocular+pressure+with+a+rebound+tonometer.">Noninvasive measurement of rodent intraocular pressure with a rebound tonometer.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4617-4621 (2005).</li><li>Isenberg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ocular+application+of+povidone-iodine.">The ocular application of povidone-iodine.</a> Community Eye Health. 16 (46), 30-31 (2003).</li><li>Morrison, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rat+model+of+chronic+pressure-induced+optic+nerve+damage.">A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage.</a> Exp Eye Res. 64 (1), 85-96 (1997).</li><li>Foxton, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-A+is+necessary+and+sufficient+for+retinal+neuroprotection+in+models+of+experimental+glaucoma.">VEGF-A is necessary and sufficient for retinal neuroprotection in models of experimental glaucoma.</a> Am J Pathol. 182 (4), 1379-1390 (2013).</li></ol>

David T. Shima is an employee of Hofmann-La Roche, Switzerland. The remaining authors declare they have no competing financial interests.

ここでは、眼の前房内に磁気ミクロスフェアを注入することによって、ラットにおいて上昇したIOPを誘導するための方法を実証する。この方法は、実施が簡単で、少し外科専門知識、または練習と洗練の時間を要する。さらに、この手順は有効である。稀圧力に強いロバスト上昇（約10％の再注入率）を誘導するために、ビーズの単回注射よりも多くを必要としない。これは、技術的に困難episceral静脈硬化症11モデル、点字IOPを維持するために、複数の手順を必要とすることができ、レーザー光凝固プロトコル6、などの既存の誘導可能な方法、オーバー利点を提供することができる。 しかし成功する方法ためには、注意する必要があるいくつかの小さな重要なステップがあります。第一に、それは、虹彩角膜角にビーズを描くように円環状の磁石を使用することが有用である。このステップはwher、オリジナルのプロトコルの変形である電子ビーズを前房内に注入し、その後、目3の周囲にフリーハンドを移動させた。トロイダル磁石を使用したマイクロスフェアは、最小限の手動の再分配を必要とする、角度の周りに均等に落ち着くべきであることを意味します。遅すぎるビーズは主に不完全な被覆、および潜在的に無圧力上昇につながる、角度の一方の側に蓄積される - 第二に、注射の速度が高速である必要があります。一般的に言えばしかし、この方法は、ユーザが容易におそらくIOP上昇の度合いを変更しようとする、そのような微小球粒子のサイズまたは体積を変化させるように、プロトコルに変更を加えることができることを十分に簡単である。 しかし、この方法の一つの潜在的な欠点は1つが、症例の約5~10％で、我々は60 mmHgの上に上昇した観察高血圧の程度をほとんど制御を有することである。 IOPの過度の上昇は、網膜組織にとって非常に破壊的であることができ、メカニズムやバイオを研究すること挑戦的な細胞死のLOGY。しかし、この方法は、薬理学的に12に操作することができる網膜および視神経、の両方において、一貫性のある神経病理を生じる。これは、緑内障を治療するための新規治療薬を開発するためのモデルは魅力できる。ビーズが隅角に導かれているのでさらに、これは、網膜や視神経乳頭のライブイメージングのための無料の視線を残します。我々は、このモデルが適合され、マウスを含む他の種における将来の用途のために使用されることを期待している。

原発緑内障は、人生を変える失明と失明2につながる可能性が世界1を通じて推定6050万人に影響を与える壊滅的な眼疾患である。病気のメカニズムの研究、および緑内障のための新規治療薬の開発は、病理学の特徴の一部を再現疾患の良いモデルに依存している。 我々はSamsel らの方法に基づいて、ここでラット緑内障モデルを提示する。3この技術の全体的な目標は、前房内に磁性微小球を注入し、磁性リングを使用して眼における眼内圧（IOP）を増大させることで、ダイレクト虹彩角膜角にそれら。これは神経損傷と細胞損失につながる、IOPを増加させ、水性流出を、妨げる。プロトコルは、緑内障の単純な、誘導性のモデルを提供しようとするために開発された。 このプロトコルは、いくつかの利点を有し得る既存の技術上。そのようなDBA / 2Jのような遺伝子マウスモデルが開始するために、手順を必要としない、利用可能です。しかしながら、これらは、疾患の進行4の予測不可能な発現を有していてもよい。対照的に、外科的にげっ歯類においてIOPを上昇させるに頼るほとんどは誘導性モデルは、開始は、ユーザによって制御することができるという利点を有する。これらの方法のいくつかを含む5つの技術的に困難である、しかし、自分自身の欠点を有していてもよく、高められたIOP 6を維持するために、複数の手順を必要とし得る。 対照的に、本稿で詳述誘導方法は、再注入のための最小限の必要性と圧力の安定した、強固な増加を生成する、単純な、効果的で、再現可能な技術である。加えて、高価な装置を必要としない、とだけ実行する基本的な外科技術を必要とする。このプロトコルは、より少ない技術的に要求の厳しい誘導性をセットアップしようとしている読者のために適切であるかもしれない彼らの実験室での緑内障モデル。

<table><tbody><tr><td>250 - 300g female Brown Norway ex-breeder rats</td><td>Harlan UK</td><td>203</td><td></td></tr><tr><td>Tonolab Rebound Tonometer</td><td>Tiolat</td><td>TV02</td><td></td></tr><tr><td>Ketaset (ketamine)</td><td>Fort Dodge Animal health</td><td>BN1000118</td><td>37.5 mg/kg</td></tr><tr><td>Domitor (medetomidine hydrochloride)</td><td>Orion Pharma</td><td>140-999</td><td>0.25 mg/kg</td></tr><tr><td>Povidone iodine</td><td>Ecolab</td><td>BN4369LE10</td><td>5% in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Minim&#039;s Saline Solution</td><td>Bausch and Lomb</td><td>PL00033/5017</td><td></td></tr><tr><td>Toroidal magnet</td><td>Supermagnete</td><td>R-10-07-03-N</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Microspheres</td><td>Bangs Laboratories</td><td>UMC4N/9692</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>33 G beveled needle</td><td>Hamilton</td><td>7747-01</td><td>Custom needle</td></tr><tr><td>Luer tip syringe</td><td>Hamilton</td><td>80601</td><td></td></tr><tr><td>Antisedan (atipemezole hydrochloride )</td><td>Orion Pharma</td><td>141-003</td><td>0.25 mg/kg</td></tr><tr><td>Chloramphenicol ointment</td><td>Medicom</td><td>18956-0005</td><td></td></tr><tr><td>TUNEL staining kit</td><td>Promega</td><td>G3250</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting media</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present here a protocol for elevating intraocular pressure (IOP) in the rat, by injecting magnetic microspheres into the anterior chamber of the eye. The use of magnetic particles allows the user to manipulate the beads into the iridocorneal angle, thus providing a very effective blockade of fluid outflow from the trabecular meshwork. This leads to long-lasting IOP rises, and eventually neuronal death in the ganglion cell layer (GCL) as well as optic nerve pathology, as seen in patients with the disease. This method is simple to perform, as it does not require machinery, specialist surgical skills, or many hours of practice to perfect. Furthermore, the pressure elevations are very robust, and reinjection of the magnetic microspheres is not usually required unlike in some other models using plastic beads. Additionally, we believe this method is suitable for adaptation for the mouse eye.

隅角への磁気ビーズの注入は常に最初の時点で容易に観察可能であった圧力で長時間堅牢上昇（ 図1）、3日後に注射を誘導した。さらに、圧力の増加は、実験期間を通して維持された、活動の時間経過は、18日後にポスト噴射を終了しているが、他の人は、圧力は、長期3を持続することを報告している。平均IOPは対照実験の全長に亘って平均化、非ビーズ注射した眼は、ビーズを注入した眼のための40.5±2.8 mmHgの（P &lt;0.001）と比較して、19.7±0.3 mmHgであった。さらに、ピークIOPは49.9±2.3 mmHgのに22.8±0.3 mmHgでから増加。 IOPの上昇が網膜神経節細胞の死につながるかどうかを決定するために、我々は、網膜上のTUNEL染色を行い、横方向視神経切片上組織学（ 図2）。網膜の<html>私たちは、上昇したIOPでビーズを注射した眼でTUNEL染色（ 図2A）の増加を観察した。アポトーシス核の数は、高血圧網膜における24.5±0.5細胞（; P &lt;0.05 図2B）に、反対側のコントロールで1.6±0.5細胞から、約15倍に増加しました。さらに、目にした磁気ビーズを注入したが、圧力を（これは虹彩角膜角の不完全閉塞する可能性が高い）は増加しなかった、TUNEL陽性細胞の数は、未注射のコントロール（P&gt; 0.05）とは有意に異ならなかった。これは、細胞死は、磁気微小球の直接的な毒性によるものではない圧力が増加すると、に関連していたことを示唆している。最後に、緑内障モデルにおける視神経病理を調査し、これらの細胞プロセス（ 図2C）の変性を示し、軸索の多くでトルイジンブルーの蓄積を見た。 URE 1 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 52400 / 52400fig1highres.jpg &quot;/&gt; 前房への磁気マイクロスフェアの図1.磁気微小球を使用して、眼圧の上昇。注射は反対側のコントロール、非注射の目と比較して、眼圧（IOP）で堅牢な、大幅な上昇を誘導した。 Y軸の単位=水銀柱ミリメートル（mmHg）で。データ=平均±SEM。 * = P &lt;0.001; N = 12この図は、フォクストンらから変更されている、アム。。 J. Pathol 182（4）：1379年から1390年。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52400/52400fig2highres.jpg" /> 神経節細胞層（GCL）中のニューロン死誘導される隅角に磁性ミクロスフェアの注射によるIOPの図2に昇格。 （A）コントロール（左）と緑内障TUNEL（緑によるアポトーシス核について染色（右）目から網膜の代表的な画像。IOPが上昇としてアポトーシス核の数が増加したことを示す白矢印）およびDAPI（青）、（B）GCLにおけるTUNEL陽性細胞の定量は、上昇したIOP（中央）と目を、と比較して有意に多くのアポトーシス細胞を有したことを示しコントロール（左）。対照的に、圧力（右）が上昇しなかったビーズを注入した眼において、TUNEL染色の有意な増加は観察されなかった。データ=平均±SEM。 * = P &lt;0.05。 N = 7から8（C）代表視神経染色の画像、緑内障（右）から損傷を受けた軸索におけるトルイジンブルー蓄積の増加（黒矢印）を実証したが、制御できない眼（左）。。スケールバー=50μmである。この図は、フォクストンらから変更されている。、アム。 J. Pathol 182（4）：1379年から1390年。

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Experimental Glaucoma Induced by Ocular Injection of Magnetic Microspheres

We present a method for inducing elevated intraocular pressure (IOP), by injecting magnetic microspheres into the rat eye, to model glaucoma. This leads to strong pressure rises, and extensive neuronal death. This protocol is easy to perform, does not require repeat injections, and produces stable long-lasting IOP rises.

磁気マイクロスフェアの眼注射によって誘発実験緑内障

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

17.0K ビュー.  University College London Institute of Ophthalmology. We present a method for inducing elevated intraocular pressure (IOP), by injecting magnetic microspheres into the rat eye, to model glaucoma. This leads to strong pressure rises, and extensive neuronal death. This protocol is easy to perform, does not require repeat injections, and produces stable long-lasting IOP rises.

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A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model of ocular hypertension to mimic human high-tension glaucoma. Here laser illumination is applied to the corneal limbus to photocoagulate the aqueous outflow, inducing angle closure. The changes of IOP are monitored using a rebound tonometer before and after the laser treatment. An optomotor behavioral test is used to measure corresponding changes in visual capacity. The representative result from one mouse which developed sustained IOP elevation after laser illumination is shown. A decreased visual acuity and contrast sensitivity is observed in this ocular hypertensive mouse. Together, our study introduces a valuable model system to investigate neuronal degeneration and the underlying molecular mechanisms in glaucomatous mice.

Chronic ocular hypertension is induced using laser photocoagulation of the trabecular meshwork in mouse eyes. The intraocular pressure (IOP) is elevated for several months after laser treatment. The decrease of visual acuity and contrast sensitivity of experimental animals are monitored using the optomotor test.

ビジュアル欠陥を特徴づけるために慢性高眼圧症のレーザー誘起マウスモデル

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model ...

医学

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and postsynaptic projections to the visual cortex. Based on its distinct anatomical structure and convenient accessibility, it has become the favored structure for studies on neuronal survival, axonal regeneration, and synaptic plasticity. Recent advancements in MR imaging have enabled the in vivo visualization of the retino-tectal part of this projection using manganese mediated contrast enhancement (MEMRI). Here, we present a MEMRI protocol for illustration of the visual projection in mice, by which resolutions of (200 &#181;m)3 can be achieved using common 3 Tesla scanners. We demonstrate how intravitreal injection of a single dosage of 15 nmol MnCl2 leads to a saturated enhancement of the intact projection within 24 hr. With exception of the retina, changes in signal intensity are independent of coincided visual stimulation or physiological aging. We further apply this technique to longitudinally monitor axonal degeneration in response to acute optic nerve injury, a paradigm by which Mn2+ transport completely arrests at the lesion site. Conversely, active Mn2+ transport is quantitatively proportionate to the viability, number, and electrical activity of axon fibers. For such an analysis, we exemplify Mn2+ transport kinetics along the visual path in a transgenic mouse model (NF-&#954;B p50KO) displaying spontaneous atrophy of sensory, including visual, projections. In these mice, MEMRI indicates reduced but not delayed Mn2+ transport as compared to wild type mice, thus revealing signs of structural and/or functional impairments by NF-&#954;B mutations.
In summary, MEMRI conveniently bridges in vivo assays and post mortem histology for the characterization of nerve fiber integrity and activity. It is highly useful for longitudinal studies on axonal degeneration and regeneration, and investigations of mutant mice for genuine or inducible phenotypes.

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

This video illustrates a method, using a clinical 3 T scanner, for contrast-enhanced MR imaging of the na&#239;ve mouse visual projection and for repetitive and longitudinal in vivo studies of optic nerve degeneration associated with acute optic nerve crush injury and chronic optic nerve degeneration in knock-out mice (p50KO).

マウスにおける造影MRIによる視神経線維の整合性in vivoイメージング

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

神経科学

A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial neurodegenerative disease. With the advent of numerous transgenic mouse lines, there is increasing interest in inducible murine models of ocular hypertension. Here, we present an occlusion model of glaucoma based on the injection of magnetic microbeads into the anterior chamber of the eye using a modified microneedle with a facetted bevel. The magnetic microbeads are attracted to the iridocorneal angle using a handheld magnet to block the drainage of aqueous humour from the anterior chamber. This disruption in aqueous dynamics results in a steady elevation of intraocular pressure, which subsequently leads to the loss of retinal ganglion cells, as observed in human glaucoma patients. The microbead occlusion model presented in this manuscript is simple compared to other inducible models of glaucoma and also highly effective and reproducible. Importantly, the modifications presented here minimize common issues that often arise in occlusion models. First, the use of a bevelled glass microneedle prevents backflow of microbeads and ensures that minimal damage occurs to the cornea during the injection, thus reducing injury-related effects. Second, the use of magnetic microbeads ensures the ability to attract most beads to the iridocorneal angle, effectively reducing the number of beads floating in the anterior chamber avoiding contact with other structures (e.g., iris, lens). Lastly, the use of a handheld magnet allows flexibility when handling the small mouse eye to efficiently direct the magnetic microbeads and ensure that there is little reflux of the microbeads from the eye when the microneedle is withdrawn. In summary, the microbead occlusion mouse model presented here is a powerful investigative tool to study neurodegenerative changes that occur during the onset and progression of glaucoma.

Here, we present a protocol to induce ocular hypertension in the murine eye that results in the loss of retinal ganglion cells as observed in glaucoma. Magnetic microbeads are injected into the anterior chamber and attracted to the iridocorneal angle using a magnet to block the outflow of aqueous humour.

磁気マイクロビーズ閉塞モデルマウスにおける緑内障高眼圧症依存誘導すること

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the brain for visual perception. Damage to RGCs and their axons leads to vision loss and/or blindness. Although the specific cause of glaucoma is unknown, the primary risk factor for the disease is an elevated intraocular pressure. Glaucoma-inducing procedures in animal models are a valuable tool to researchers studying the mechanism of RGC death. Such information can lead to the development of effective neuroprotective treatments that could aid in the prevention of vision loss. The protocol in this paper describes a method of inducing glaucoma - like conditions in an in vivo rat model where 50 &#181;l of 2 M hypertonic saline is injected into the episcleral venous plexus. Blanching of the vessels indicates successful injection. This procedure causes loss of RGCs to simulate glaucoma. One month following injection, animals are sacrificed and eyes are removed. Next, the cornea, lens, and vitreous are removed to make an eyecup. The retina is then peeled from the back of the eye and pinned onto sylgard dishes using cactus needles. At this point, neurons in the retina can be stained for analysis. Results from this lab show that approximately 25% of RGCs are lost within one month of the procedure when compared to internal controls. This procedure allows for quantitative analysis of retinal ganglion cell death in an in vivo rat glaucoma model.

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

緑内障誘導の手順<em&gt;インビボ</em&gt;ラットモデルと全体のマウント網膜準備

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

A Model of Glaucoma Induced by Circumlimbal Suture in Rats and Mice

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known risk factor for glaucoma. This protocol demonstrates a step-by-step guide on this technique in Long Evans rats and C57BL/6 mice. Under general anesthesia, a "purse-string" suture is applied on the conjunctiva, around the equator and behind the limbus of the eye. The fellow eye serves as an untreated control. Over the duration of our study, which was a period of 8 weeks for rats and 12 weeks for mice, IOP remained elevated, as measured regularly by rebound tonometry in conscious animals without topical anesthesia. In both species, the sutured eyes showed electroretinogram features consistent with preferential inner retinal dysfunction. Optical coherence tomography showed selective thinning of the retinal nerve fiber layer. Histology of the rat retina in cross-section found reduced cell density in the ganglion cell layer, but no change in other cellular layers. Staining of flat-mounted mouse retinae with a ganglion cell specific marker (RBPMS) confirmed ganglion cell loss. The circumlimbal suture is a simple, minimally invasive and cost-effective way to induce ocular hypertension that leads to ganglion cell injury in both rats and mice.

Chronic ocular hypertension is induced by applying a circumlimbal suture in rats and mice, leading to functional and structural deterioration of the retinal ganglion cells consistent with glaucoma.

ラットおよびマウスの Circumlimbal 縫合による緑内障のモデル

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known ...

A Reversible Silicon Oil-Induced Ocular Hypertension Model in Mice

Elevated intraocular pressure (IOP) is a well-documented risk factor for glaucoma. Here we describe a novel, effective method for consistently inducing stable IOP elevation in mice that mimics the post-operative complication of using silicone oil (SO) as a tamponade agent in human vitreoretinal surgery. In this protocol, SO is injected into the anterior chamber of the mouse eye to block the pupil and prevent inflow of aqueous humor. The posterior chamber accumulates aqueous humor and this in turn increases the IOP of the posterior segment. A single SO injection produces reliable, sufficient, and stable IOP elevation, which induces significant glaucomatous neurodegeneration. This model is a true replicate of secondary glaucoma in the eye clinic. To further mimic the clinical setting, SO can be removed from the anterior chamber to reopen the drainage pathway and allow inflow of aqueous humor, which is drained through the trabecular meshwork (TM) at the angle of the anterior chamber. Because IOP quickly returns to normal, the model can be used to test the effect of lowering IOP on glaucomatous retinal ganglion cells. This method is straightforward, does not require special equipment or repeat procedures, closely simulates clinical situations, and may be applicable to diverse animal species. However, minor modifications may be required.

Here, we present a protocol to induce ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse eyes by intracameral injection of silicone oil and the procedure for silicone oil removal from the anterior chamber to return elevated intraocular pressure to normal.

マウスにおける可逆シリコンオイル誘発眼圧モデル

Elevated intraocular pressure (IOP) is a well-documented risk factor for glaucoma. Here we describe a novel, effective method for consistently inducing ...

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic nerve and retinal ganglion cell (RGC) degeneration, resulting in visual dysfunction by interrupting the transmission of visual information from the eye to the brain. Elevated intraocular pressure is the most important risk factor; thus, several models of ocular hypertension have been developed in rodents by either genetic or experimental approaches to investigate the causes and effects of the disease. Among those, some limitations have been reported such as surgical invasiveness, inadequate functional assessment, requirement of extensive training, and highly variable extension of retinal damage. The present work characterizes a simple, low-cost, and efficient method to induce ocular hypertension in rodents, based on low-temperature, full-circle cauterization of the limbal vascular plexus, a major component of aqueous humor drainage. The new model provides a technically easy, noninvasive, and reproducible subacute ocular hypertension, associated with progressive RGC and optic nerve degeneration, and a unique post-operative clinical recovery rate that allows in vivo functional studies by both electrophysiological and behavioral methods.

The goal of this protocol is to characterize a novel model of glaucomatous neurodegeneration based on 360&#176; thermic cauterization of limbal vascular plexus, inducing subacute ocular hypertension.

げっ歯類の外科的緑内障に対する辺縁血管神経叢の全周焼灼

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

A Hypertonic Saline Injection Technique for Inducing Glaucoma in Rats

Source: Gossman, C. A. et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53831">Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates glaucoma induction in an anesthetized rat by injecting hypertonic saline into the episcleral vein. The saline enters the trabecular meshwork via Schlemm&#39;s canal, causing tissue scarring, which blocks aqueous humor outflow and raises intraocular pressure. The elevated pressure damages retinal ganglion cells, leading to glaucoma.

ラットの緑内障誘発のための高張生理食塩水注射法

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Epilepsy and Seizure Disorders

Experimental Glaucoma Induction via Iridocorneal Angle Obstruction In a Mouse Model

Source: Bunker, S., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/52400">Experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres.</a> J. Vis. Exp. (2015)
In this video, an anesthetized rat undergoes an ocular procedure where magnetic beads are injected into the anterior chamber under a magnetic field to block the iridocorneal angle. This blockage obstructs the trabecular meshwork, preventing aqueous humor drainage and leading to increased intraocular pressure, damaging the retinal ganglion cells and optic nerve. This develops a glaucoma-like condition.

Source: Bunker, S., et al. Experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres. J. Vis. Exp. (2015)
In this video, an anesthetized ...

Neurodegenerative Diseases

Inducing Experimental Glaucoma Induction via Iridocorneal Angle Obstruction with Magnetic Beads

After anesthetizing the rats, apply ocular ointment to the unoperated contralateral eye to keep it moist during anesthesia. Apply 0.5% pro procaine hydrochloride local anesthetic to the operative eye. Next, wash this eye with 5% povidone iodine in water. After 5 minutes, wick off the povidone iodine and wash the eye with 0.9% sterile saline solution.
Keep the eye moist during anesthesia with regular application of sterile saline. Now, place a toroidal magnet around the eye. To minimize the risk of iris trauma and minimize bead loss, orient the needle tangential to the corneal surface as parallel to the iris as possible. Proceed to inject 25 microliters of 30 milligrams per millimeter gamma irradiated magnetic microspheres into the anterior chamber.
Leave the needle in place for one minute post-injection, to ensure that beads settle into the iridocorneal angle to impede aqueous drainage from the trabecular meshwork. Slightly angle the needle a few seconds after the beads have initially settled to allow some leakage of aqueous, and to minimize transient increases in intraocular pressure.
To ensure continued use of the needle in separate procedures, flush the needle with PBS, then 70% ethanol, followed by distilled water. At this stage, if necessary, remove the magnet and use it to draw beads into areas of incomplete coverage. Leave the magnet in place around the eye for a further 10 minutes post-injection, to ensure beads settle well into the iridocorneal angle.