C. Linn is supported by an NIH grant (NIH NEI EY022795).

動物被験体を使用して、すべての手順は、ウェスタンミシガン大学の動物実験委員会（IACUC）の研究所の基準に準拠していました。 1.動物<ol><li>本研究で雌雄ラットに生後3ヶ月を使用してください。 </li><li>食料と水に自由にアクセスさせて12時間の明/暗サイクルで動物を保​​管してください。 </li></ol>動物麻酔のためのKAXカクテルの調製<ol><li> 1 mLのアセプロマジン（10mg / ml）および蒸留水3mlで5 mlのケタミン（100 mg / mlで）にキシラジン（20 mg / mlで）50mgを溶解します。完全に混合。 </li><li>シリンジフィルターで滅菌し、10ミリリットルの血清ボトルにこのソリューションを保存します。 </li></ol> 3. KAXインジェクション<ol><li>動物（g）を秤量し、注射の準備ができるまで、ケージに戻します。 </li><li> 28 G針で1mlのインスリンシリンジを用いて、腹腔内に0.1 mlのKAX / 100gの動物の体重を注入します。 </li><li>許可します動物のために無意識になるために。足と尾をつまんで反射神経をチェックしてください。 </li><li>安全に手術期間中のラボですべての動物を保管してください。 </li><li>術後、それらのケージに動物を交換し、意識が回復されるまで、RTで快適に保ちます。動物のみが目覚めたときに動物施設に動物を返し、通常の動作を再開します。 </li></ol>手術およびマイクロニードルアセンブリ4.準備<ol><li>無菌の2 M NaCl溶液を作ります。 </li><li> 2細かくテーパーガラスマイクロニードル（ 図1D、図1E）に1 0.86ミリメートル、内径重い研磨標準と薄い壁ホウケイ酸チューブを引っ張って微小電極プラー（ 図1C）を使用します。 </li><li>埋め戻しの注射針と1ml注射器（ 図1B）を使用して、2 M生理食塩水で前の手順から1マイクロニードルを埋め戻し。電極の先端から気泡をタップします。 </li><li> 2 Mで第1ミリリットル注射器を埋めますNaClを。 18 G針を接続し、ポリエチレンチューブ（ 図1A）の長さ（約10インチ）を添付。針を介して生理食塩水でポリエチレン管を埋めるために、シリンジのプランジャーを使用してください。 </li><li>マイクロニードルとチューブの両方を生理食塩水で満たされている場合には、慎重に2を接続してください。それらの間の接続（ 図2）内の任意の空気を排除します。 </li><li>細かくコースペーパータオルの粒に対して非常に軽くこすることによってマイクロニードルの先端を面取り。 </li><li>液体の細い流れは、ペーパータオル上で見ることができるようになるまで静かにシリンジのプランジャーを押すことによってマイクロニードルの抵抗を確認してください。液体の流れは、0.5ミリメートルよりも広いべきではありません。 </li></ol>動物の5.準備<ol><li>適用1から2は、角膜（プロパラカイン塩酸塩点眼液、USP 0.5％）に局所麻酔薬をドロップします。何の眼反射が発生しなくなるまで待ちます。 </li><li>ハサミでウィスカーをト​​リミング。 </li><li> S実験的な目の周りベータダイン液と綿棒エリアで綿棒をaturate。 </li><li>顕微鏡を使用して、目を膨らみ強膜上静脈を露出させ、目の動きを制限するには、下部まぶたをクランプするように止血剤を添付します。 （ 図3、矢印） </li></ol> 6.緑内障誘導生理食塩水注射<ol><li>マイクロニードルアセンブリおよび動物を製造する場合、注射を開始します。 </li><li>動物が足/テールピンチに反応しないことが確認された場合には、慎重に静脈（ 図3、白矢印）に10と20度との間に低角度で来ることにより、マイクロニードルと強膜上静脈を突き刺します。血液はマイクロニードル（ 図3、黒い矢印）の先端に入ったときに静脈に成功したパンクは明らかです。 </li><li>ゆっくりと手動で静脈に約50μlの生理食塩水を注入します。これは、約10秒を取る必要があります。静脈意志塩のthro循環するように白く、白ぐふ血管系（ 図4、矢印）。一部の地域は、血液の赤い外観（ 図4、矢印）を維持することができます。 <ol><li>完全な網膜神経節細胞層への徹底した網膜の損傷を確実にするために、対向する第1の部位に、静脈に二回目の注射を実行します。 注：塩は、血管系を循環するように数分以内に、1は、目の虹彩を通じて明確な曇った外観が表示されるはずです。 </li></ol></li><li>内部コントロールとして使用するための未処理の反対の目を​​残します。 </li></ol> 7.動物の回復<ol><li>止血剤を削除します。 </li><li>止血剤によって、および注射部位にクランプサイトに三重の抗生物質軟膏（バシトラシン亜鉛、硫酸ネオマイシン、polymysin B硫酸塩）を適用するために綿棒を使用してください。目の周りの組織の損傷は、止血剤を使用して発生しません。 </li><li> &gt; PREVする循環温水毛布の上にケージ内麻酔動物を配置しますENT低体温。意識と通常の動作が回復するまで観察下に動物を保管してください。バック動物コロニーに目を覚まし、動物を輸送します。動物は屠殺時まで植民地に残ります。 </li></ol> 8.動物の犠牲と網膜の取り外し<ol><li>緑内障を誘発する手順を、次の1ヶ月、動物をCO 2窒息と二胸椎穿刺によって安楽死させます。 <ol><li>チャンバー内に動物を置き、しっかりとふたを置きます。 </li><li> 20％体積/分でCO 2の変位を可能にするために、CO 2ガス調整弁を開き チャンバー内の酸素。 </li><li>期限切れに動物のために4〜5分を許可します。 </li><li>両方のバルブをオフにします。 </li><li>チャンバーから動物を削除し、滅菌メスで二胸椎穿刺を行います。 </li></ol></li><li>安楽死の後、目の周囲の眼窩内の結合組織を切断するためにメスを使用して、BEI眼球自体に切らないように注意してくださいngの。 </li><li>慎重に無傷の眼球を抽出するために視神経と残りの組織を切断するために湾曲した縁部のはさみを使用しています。新鮮なPBSを含む滅菌60ミリメートルX 15ミリメートルの使い捨てペトリ皿に抽出された眼球を配置します。 </li><li>眼球からアイカップを作ります。これを行うには、メスで小切開を行うだけで、虹彩と強膜との境界に後方。眼球から角膜半球を除去するために、小さな春のハサミで目の周囲に、この切開に従ってください。視神経に接続された半球が残ります。 </li><li>安楽死させた動物からのアイカップの内側に非常に薄いピンク/ベージュ網膜を探します。アイカップを安定化させるために鈍化鉗子で網膜色素上皮層を保持します。非常に優しく、目の奥のオフ全体無傷の網膜をいじめるために、閉じた鉗子の別のペアを使用してください。 、ピンチ引っ張り、または直接網膜を引っ張ることは避けてください。 </li><li>カットする小さな春のはさみを使用視神経がまだ網膜に装着されているエリア。 </li><li>網膜から残留色素上皮または強膜組織を切り取るようにしてください。 </li><li>トランスファーピペットを使用して、非常に静かに新鮮なPBSを含む35ミリメートル×10ミリメートルペトリ皿を被覆したクリーンなシルガードに孤立した網膜を転送します。 </li></ol> 9.ホールマウント網膜準備<ol><li>いったんシルガード皿で、場所で網膜を固定する鉗子と1サボテンの針を使用します。上向きに網膜神経節細胞層を維持し、ダウン視神経。網膜の半球形状も定着後の注目すべきです。網膜神経節細胞層が所望の向きにあるとき、網膜の曲率は、天井に向かってカールします。 </li><li>視神経乳頭から放射状に四つ葉のクローバーの形を作り、4つの象限に網膜をカットするために、小さなはさみを使用してください。 </li><li>可能なwithoとして網膜は限り平坦にするために追加のサボテンの針を持つ網膜の象限をピンストレッチUT（ 図5）。 </li><li> RTで4％パラホルムアルデヒドO / Nの3ミリリットルとのSylgard皿で固定網膜を修正しました。 </li></ol>網膜の10抗体染色注：ステインが（ 図6）網膜におけるニューロンを表示するための一次および二次抗体を用いた網膜を固定。 <ol><li>固定、フラットマウントされた網膜をPBS中で2分間、3回洗浄します。 </li><li> 60分間、PBS中の1％ウシ胎児血清、1％トリトンX-100で網膜を透過。 </li><li>すすぎは、PBS中で3回、2分毎に、網膜。 </li><li> PBS中0.1％トリトンX-100、洗浄当たり5分で二回リンス。 </li><li> 、PBSで2回洗浄当たり5分を洗い流します。 </li><li> 45分間室温でPBS中の1％トリトンX-100および1％ウシ胎児血清をインキュベートします。 </li><li> PBS中0.1％トリトンX-100、洗浄当たり5分で二回リンス。 </li><li> 、PBSで2回洗浄当たり5分を洗い流します。 </li><li> PBSで3ミリリットルの1％ウシ胎児血清中の各網膜をインキュベート精製したマウス抗ラットCD90 /マウスCD90.1（1：300希釈）O / RTでN。 </li><li> 5分間、PBS中の0.1％トリトンX-100で一回網膜をすすぎます。 </li><li> 、PBSで2回洗浄当たり5分を洗い流します。 </li><li>二アレクサフルオロ594ヤギ抗マウスIgGを用いて3 mlのPBS（無FBS）の各網膜をインキュベートし（1：300）O / RTでN。 </li><li>気前PBSで網膜を洗ってください。 </li><li>解剖顕微鏡を使用して、慎重に網膜からサボテンの針を削除します。 </li><li>静かに転送ピペットを用いて顕微鏡スライド上に網膜を転送します。天井に直面している網膜神経節細胞層との方向を維持するようにしてください。網膜の半球形状も定着後の注目すべきです。網膜神経節細胞層が所望の向きにあるとき、網膜の曲率は、天井に向かってカールします。 </li><li>キムワイプまたは他のこのような吸収性材料を用いて余分なPBSを吸収します。網膜を吸収しないように注意してください。 </li><li> 1/2グリセリン5滴を追加し、午前のように重量PBS 1/2ountingメディア。 </li><li>気泡を避け、カバーガラスと網膜をカバーしています。 </li><li>明確なマニキュア、接着剤、または他の接着剤を用いてカバーガラスを固定します。 </li></ol>

The authors have no conflicting or competing interests to disclose.

このプロトコルは、 インビボのラットモデルにおける緑内障のような状態を誘導する方法を記載しています。この手順は、小柱網29、32に瘢痕化を誘導するために高張食塩水の注入を使用しています。瘢痕組織を開発する前房に圧力を増加させ、房水の流出を閉塞します。減少した流出圧力が構築して、弾性靱帯によって吊り下げレンズはバック硝子体腔内に押し込みます。硝...

緑内障は、具体的には、網膜神経節細胞1-2、網膜内ニューロンに影響を及ぼす眼疾患群です。これらの細胞の軸索は、視力が知覚される脳に視覚情報を運ぶ視神経になるように収束します。 RGCとその軸索の損傷は、したがって、視覚的な欠陥を引き起こします。 緑内障の障害に関連する主要な特性は、RGCの変性と死、眼圧の上昇（IOP）、および視神経乳頭陥凹と萎縮しています。これらの機能は、視野欠損、または完全な、不可逆的な失明につながります。現在、緑内障は、世界中7000万人3に失明を引き起こしました。このように、それは失明4の世界第三位の原因です。 緑内障におけるRGC死の正確なメカニズムは不明のまま。多くの研究は謎のロックを解除するために行われてきました。緑内障の主要な危険因子が増加Iであることが知られています眼の前房内の房水（AH）の不規則な循環へのn眼圧。 AHは、眼の無血管前房内の血液のための無色透明の代替として機能します。それは、周囲の細胞に栄養を与える代謝プロセスから分泌された老廃物を除去し、神経伝達物質を搬送し、病理学的状態1の間に薬や眼内の炎症細胞の循環を可能にします。 房水循環の維持は毛様体および小柱網を必要とします。房水は、毛様体により産生されます。その後、眼組織の全体的な健康を維持するために、前房に流入します。 75 - 流体は毛様体筋における海綿状組織の3層を介して濾過されたときに、房水流出の80％が積極的に非色素毛様体上皮を介して分泌されます。小柱網を通じて、どの優先使用シュレム管を通る流体の出口20残りの血液系5【選択に新設-流出の25％は、小柱網をバイパスして受動的にuveo -強膜経路を介して限外濾過し、拡散によって分泌されます。この経路は、眼圧1の相対的に独立であるように見えます。 房水の生産と流出がバランスの外にある場合、圧力は、目の中に構築します。上述のように、眼圧の増加は、緑内障の発症における主要な危険因子です。このような圧力は、目の奥の網膜における神経細胞の複雑な層への損傷を引き起こします。視神経の網膜神経節細胞の軸索の損傷は、もはや正確な視覚情報を受け取るには、脳を引き起こしません。その結果、視覚の認識は失われ、完全な失明が発生する可能性があります。 現在までに、緑内障の治療法は存在しません。別の治療法は、主に眼内圧を低下させることを目指していること存在します。これらは、局所含みますこのようなベータアドレナリン受容体遮断薬などの薬物クラス、または局所プロスタグランジン類似体。ベータ遮断薬は、房水7の産生を減少させることによって眼圧を低下させます。プロスタグランジンは、房水8~14の流出を増加させることにより、IOPを低下させるように機能します。アルファアドレナリン作動薬および炭酸脱水酵素阻害剤はまた、治療の二次方法として使用されています。アルファアドレナリン作動薬は、ブドウ膜強膜経路15-17を介して流出を増加させます。炭酸脱水酵素阻害剤、酵素阻害18 AHの産生を減少させます。はるかに侵襲的な手順はまた、緑内障を治療するために使用されています。レーザー線維柱帯形成術は、房水19の流出を増加させるために使用されます。線維柱帯切除術と呼ばれる別の外科的治療は、従来の小柱経路が20-21ブロックされたときにAHをフィルタリングするための代替排水サイトを作成します。 これらの治療の選択肢は、EFFに知られていますectively IOPを低下させます。しかし、緑内障患者の最大40％が、より完全な治療法の必要性を示す正常なIOPレベルを示す。22,23は、さらにそれが始まり、現在の治療は、疾患の進行を停止しないと、緑内障で見られる網膜神経節細胞死は不可逆的です24-28。これは、神経細胞自体の生存をターゲットに効果的な神経保護治療の必要性を強調しています。緑内障モデルの開発は、この開発のために重要です。 本研究では、元々モリソン29によって概説修飾手順を用いて、成体のロングエバンスラットの緑内障のような効果を誘導する方法を実証しています。この手順では、上強膜静脈叢に2 M高張生理食塩水の注射は、眼圧の上昇とワットRGCの有意な損失につながる小柱網で房水の流出を減らすために組織を瘢痕により、緑内障のような条件を誘発します手順30-31の1ヶ月ithin。このような、ここで説明したものと緑内障を誘発する手順は、緑内障治療における新たな展開のロックを解除するための鍵であってもよいです。

<table><tbody><tr><td>Xylazine hydrochloride, Minimum 99%</td><td>Sigma, Life Science</td><td>X1251-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/ml&amp;nbsp;</td><td>Putney, Inc</td><td>NDC 26637-411-01</td><td>10 ml bottle</td></tr><tr><td>Acepromazine Maleate, 10mg/ml</td><td>Phoenix Pharmaceutical, Inc</td><td>NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408</td><td>50 ml bottle</td></tr><tr><td>Serum bottle, 10 ml</td><td>VWR</td><td>16171319</td><td>Borosilicate glass</td></tr><tr><td>1 ml insulin syringe&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>BD329410</td><td>28 G needle&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S7653</td><td>2 M Solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microelectrode Puller&amp;nbsp;</td><td>Narishige Group</td><td>PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-86-10HP</td><td>without filament, 0.86 mm</td></tr><tr><td>Microfil syringe needle for filling micropipettes</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>MF28G</td><td></td></tr><tr><td>18 gauge Luer-Lock needle</td><td>Fisher Scientific</td><td>1130421</td><td>Syringe needle</td></tr><tr><td>Flexible Polyethylene Tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td>22046941</td><td>0.034 inch diameter, approximately 10 inches&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5%</td><td>Akorn, Inc</td><td>NDC 17478-263-12</td><td>15 ml&amp;nbsp; sterile bottle&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Curved Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>StereoZoom 4</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat Clamp&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>1310912</td><td>curved edge</td></tr><tr><td>Triple Antibiotic Ointment&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0664481</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel handle</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blade #11</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish</td><td>VWR</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate</td><td>Sigma, Life Science&amp;nbsp;</td><td>P7059-1L</td><td>1x dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>Forceps (2), Dumont # 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Transfer Pipets, polyethylene, non sterile</td><td>BD Biosciences</td><td>357524 or 52947-948</td><td>1 and 2 ml graduations</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td></td></tr><tr><td>Cactus Needles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>EMD Millipore&amp;nbsp;</td><td>PX0055-3 or 818715.0100</td><td>Made into a 4% solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>T9284-100 ml</td><td>Made into both a 1% and 0.1% solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11150</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1</td><td>BD Pharmingen</td><td>Cat 554892</td><td>1:300 dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 goat anti-mouse&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>A11005</td><td>1:300 dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>G5516-100 ml&amp;nbsp;</td><td>50% glycerol to 50% PBS, by weight&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Coverglass&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>2975-225</td><td>Thickness 1 22 x 50 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>C2 Eclipse Ti</td><td></td></tr></tbody></table>

glaucoma-inducing procedure in an in vivo rat model and whole-mount retina preparation

緑内障は、網膜神経節細胞（RGC）に影響する中枢神経系の疾患です。視神経を構成するRGC軸索は、視覚のための脳に視覚入力を運びます。 RGCとその軸索の損傷は、視力低下および/または失明につながります。緑内障の特定の原因は不明であるが、疾患の主要な危険因子は、高眼圧です。動物モデルにおける緑内障を誘発する手順は、RGC死のメカニズムを研究する研究者にとって貴重なツールです。このような情報は、視力低下の予防に役立つ可能性があり効果的な神経保護治療法の開発につながることができます。 2 M高張食塩水の50μlを上強膜静脈叢に注入されたin vivoでのラットモデルにおける条件のように-本稿におけるプロトコルは、緑内障を誘導する方法を説明します。血管の白化は、成功した注射を示しています。この手順は、緑内障をシミュレートするために、RGCの損失を引き起こします。次の一ヶ月注射は、動物を屠殺し、眼を除去します。次に、角膜、レンズ、および硝子体は、アイカップを作るために除去されます。網膜は、その後、目の奥から剥離し、サボテン​​の針を使用して、シルガード皿上に固定されています。この時点で、網膜のニューロンは、分析のために染色することができます。このラボからの結果は、内部統制と比較した場合、RGCの約25％は、手順の1カ月以内に失われていることを示しています。この手順は、 インビボでラット緑内障モデルにおける網膜神経節細胞死の定量的分析を可能にします。

このセクションでは、 インビボでラット緑内障モデルにおける緑内障のような状態を誘導するために使用される装置部品及び手順を示します。我々は、眼圧の上昇を引き起こす高張食塩水の注入を実行するために使用される個々のツールおよび機器を示します。私たちは、その特徴的なブランチング効果と結果前房の曇った外観を持つ強膜上静脈叢への注入を...

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Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

緑内障誘導の手順<em&gt;インビボ</em&gt;ラットモデルと全体のマウント網膜準備

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

glaucoma-inducing-procedure-an-vivo-rat-model-whole-mount-retina

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

13.0K ビュー.  Western Michigan University. Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis. 

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Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

ホールマウントラット網膜における免疫組織化学的およびカルシウムイメージング法

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

神経科学

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are an emerging treatment for photoreceptor degenerative diseases that seek to restore vision by artificially stimulating the surviving retinal neurons in the hope of eliciting comprehensible visual perception in patients. Current retinal prostheses have demonstrated success in restoring limited vision to patients using an array of electrodes to electrically stimulate the retina but face substantial physical barriers in restoring high acuity, natural vision to patients. Chemical neurostimulation using native neurotransmitters is a biomimetic alternative to electrical stimulation and could bypass the fundamental limitations associated with retinal prostheses using electrical neurostimulation. Specifically, chemical neurostimulation has the potential to restore more natural vision with comparable or better visual acuities to patients by injecting very small quantities of neurotransmitters, the same natural agents of communication used by retinal chemical synapses, at much finer resolution than current electrical prostheses. However, as a relatively unexplored stimulation paradigm, there is no established protocol for achieving chemical stimulation of the retina in vitro. The purpose of this work is to provide a detailed framework for accomplishing chemical stimulation of the retina for investigators who wish to study the potential of chemical neuromodulation of the retina or similar neural tissues in vitro. In this work, we describe the experimental setup and methodology for eliciting retinal ganglion cell (RGC) spike responses similar to visual light responses in wild-type and photoreceptor-degenerated wholemount rat retinas by injecting controlled volumes of the neurotransmitter glutamate into the subretinal space using glass micropipettes and a custom multiport microfluidic device. This methodology and protocol are general enough to be adapted for neuromodulation using other neurotransmitters or even other neural tissues.

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

This protocol describes a novel method for investigating a form of chemical neurostimulation of wholemount rat retinas in vitro with the neurotransmitter glutamate. Chemical neurostimulation is a promising alternative to the conventional electrical neurostimulation of retinal neurons for treating irreversible blindness caused by photoreceptor degenerative diseases.

バイオミメティック化学ニューロモデュレーション神経伝達物質グルタミン酸の in Vitroラット網膜のための方法論

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are ...

生物工学

A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial neurodegenerative disease. With the advent of numerous transgenic mouse lines, there is increasing interest in inducible murine models of ocular hypertension. Here, we present an occlusion model of glaucoma based on the injection of magnetic microbeads into the anterior chamber of the eye using a modified microneedle with a facetted bevel. The magnetic microbeads are attracted to the iridocorneal angle using a handheld magnet to block the drainage of aqueous humour from the anterior chamber. This disruption in aqueous dynamics results in a steady elevation of intraocular pressure, which subsequently leads to the loss of retinal ganglion cells, as observed in human glaucoma patients. The microbead occlusion model presented in this manuscript is simple compared to other inducible models of glaucoma and also highly effective and reproducible. Importantly, the modifications presented here minimize common issues that often arise in occlusion models. First, the use of a bevelled glass microneedle prevents backflow of microbeads and ensures that minimal damage occurs to the cornea during the injection, thus reducing injury-related effects. Second, the use of magnetic microbeads ensures the ability to attract most beads to the iridocorneal angle, effectively reducing the number of beads floating in the anterior chamber avoiding contact with other structures (e.g., iris, lens). Lastly, the use of a handheld magnet allows flexibility when handling the small mouse eye to efficiently direct the magnetic microbeads and ensure that there is little reflux of the microbeads from the eye when the microneedle is withdrawn. In summary, the microbead occlusion mouse model presented here is a powerful investigative tool to study neurodegenerative changes that occur during the onset and progression of glaucoma.

Here, we present a protocol to induce ocular hypertension in the murine eye that results in the loss of retinal ganglion cells as observed in glaucoma. Magnetic microbeads are injected into the anterior chamber and attracted to the iridocorneal angle using a magnet to block the outflow of aqueous humour.

磁気マイクロビーズ閉塞モデルマウスにおける緑内障高眼圧症依存誘導すること

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial ...

医学

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy (rNAION)

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their lifetime. NAION results in optic nerve edema, selective loss of the retinal ganglion cell neurons (RGCs) and atrophy of the optic nerve. A rodent model of NAION that expresses most NAION features and sequelae has been developed, which is applicable to both rats and mice. This model utilizes a focal laser application of 532 nm wavelength to illuminate a photoactive dye, Rose Bengal (RB), to cause capillary damage and leakage at the targeted anterior optic nerve (the laminar region). After rNAION induction, there is an early optic nerve ischemia, optic nerve edema, and intraneural inflammation, followed by selective RGC and axonal loss. Since the optic nerve is a CNS white matter tract, the rNAION model is applicable to mechanistic studies of selective white matter ischemia, as well as neuroprotective analyses and short and long-term mechanisms of glial and neuronal response to ischemia.

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy rNAION

The following report describes how to replicate the rodent model of nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (rNAION), using the appropriate dye, contact lens and laser parameters. We also reveal the appropriate steps for evaluating the rNAION lesion in vivo.

Nonarteritic前部虚血性視神経症の齧歯類モデル（rNAION）

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their ...

A Model of Glaucoma Induced by Circumlimbal Suture in Rats and Mice

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known risk factor for glaucoma. This protocol demonstrates a step-by-step guide on this technique in Long Evans rats and C57BL/6 mice. Under general anesthesia, a "purse-string" suture is applied on the conjunctiva, around the equator and behind the limbus of the eye. The fellow eye serves as an untreated control. Over the duration of our study, which was a period of 8 weeks for rats and 12 weeks for mice, IOP remained elevated, as measured regularly by rebound tonometry in conscious animals without topical anesthesia. In both species, the sutured eyes showed electroretinogram features consistent with preferential inner retinal dysfunction. Optical coherence tomography showed selective thinning of the retinal nerve fiber layer. Histology of the rat retina in cross-section found reduced cell density in the ganglion cell layer, but no change in other cellular layers. Staining of flat-mounted mouse retinae with a ganglion cell specific marker (RBPMS) confirmed ganglion cell loss. The circumlimbal suture is a simple, minimally invasive and cost-effective way to induce ocular hypertension that leads to ganglion cell injury in both rats and mice.

Chronic ocular hypertension is induced by applying a circumlimbal suture in rats and mice, leading to functional and structural deterioration of the retinal ganglion cells consistent with glaucoma.

ラットおよびマウスの Circumlimbal 縫合による緑内障のモデル

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known ...

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic nerve and retinal ganglion cell (RGC) degeneration, resulting in visual dysfunction by interrupting the transmission of visual information from the eye to the brain. Elevated intraocular pressure is the most important risk factor; thus, several models of ocular hypertension have been developed in rodents by either genetic or experimental approaches to investigate the causes and effects of the disease. Among those, some limitations have been reported such as surgical invasiveness, inadequate functional assessment, requirement of extensive training, and highly variable extension of retinal damage. The present work characterizes a simple, low-cost, and efficient method to induce ocular hypertension in rodents, based on low-temperature, full-circle cauterization of the limbal vascular plexus, a major component of aqueous humor drainage. The new model provides a technically easy, noninvasive, and reproducible subacute ocular hypertension, associated with progressive RGC and optic nerve degeneration, and a unique post-operative clinical recovery rate that allows in vivo functional studies by both electrophysiological and behavioral methods.

The goal of this protocol is to characterize a novel model of glaucomatous neurodegeneration based on 360&#176; thermic cauterization of limbal vascular plexus, inducing subacute ocular hypertension.

げっ歯類の外科的緑内障に対する辺縁血管神経叢の全周焼灼

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal detachment, breakdown of the blood-retinal barrier (BRB), and retinal angiogenesis. An in vivo rat model is a valuable experimental tool to examine the changes in the structure and function of the retina. We propose three different experimental techniques in the rat model to identify morphological changes of retinal cells, retinal vasculature, and compromised BRB. Retinal histology is used to study the morphology of various retinal cells. Also, quantitative measurement is performed by retinal cell count and thickness measurement of different retinal layers. A BRB breakdown assay is used to determine the leakage of extraocular proteins from the plasma to vitreous tissue due to the breakdown of BRB. Fluorescence angiography is used to study angiogenesis and leakage of blood vessels by visualizing retinal vasculature using FITC-dextran dye.

Diabetic retinopathy is one of the leading causes of blindness. Histology, blood-retinal barrier breakdown assay, and fluorescence angiography are valuable techniques to understand the pathophysiology of the retina, which could further enhance the efficient drug screening against diabetic retinopathy.

ラットモデルにおける網膜病態生理学的評価

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular pericytes are central to ophthalmological research. It is vital to choose an appropriate method of visualizing the microvascular pericytes. We describe retinal microvascular pericyte immunohistochemical staining in cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature using antibodies for platelet-derived growth factor receptor &#946; (PDGFR&#946;) and nerve/glial antigen 2 (NG2). This allows us to highlight advantages and shortcomings of each of the three tissue preparations for the visualization of the retinal microvascular pericytes. Cryo-sections provide transsectional visualization of all retinal layers but contain only a few occasional transverse cuts of the microvasculature. Whole-mount provides an overview of the entire retinal vasculature, but visualization of the microvasculature can be troublesome. Hypotonic isolation provides a method to visualize the entire retinal vasculature by the removal of neuronal cells, but this makes the tissue very fragile.

We demonstrate three different tissue preparation techniques for immunohistochemical visualization of rat retinal microvascular pericytes, i.e., cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolation of the vascular network.

網膜の低温電子顕微鏡セクション全体-マウント、および微小血管の免疫組織化学的可視化の低張性分離血管準備

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

生物学

Transconjunctival Approach for Injection into the Rat Optic Nerve

The rat serves as an important model for studying disorders of the optic nerve, including heritable, traumatic, neoplastic, and autoimmune conditions. Accessing the rat optic nerve for experimental manipulations and injections is challenging due to the small size of the orbit and the vascularity of the surrounding orbital tissues. Previous techniques have involved a cutaneous incision, which carries a higher risk of infection and requires wound closure. This study aims to describe a unique, less invasive, and potentially more efficient approach to accessing the rat optic nerve. A transconjunctival incision, along with a rat spinal cord hook, is used to isolate the optic nerve for experimental injections. In these experiments, an adenoviral vector is injected into the optic nerve with the goal of using this technique for direct gene therapy delivery in the future. This technique can also be applied by investigators requiring access to the rat optic nerve for other experimental studies, including drug delivery and optic nerve injury research.

This protocol describes a unique technique using a transconjunctival approach to access the rat optic nerve for injections.

ラット視神経への注射のための経結膜アプローチ

The rat serves as an important model for studying disorders of the optic nerve, including heritable, traumatic, neoplastic, and autoimmune conditions. ...

A Hypertonic Saline Injection Technique for Inducing Glaucoma in Rats

Source: Gossman, C. A. et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53831">Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates glaucoma induction in an anesthetized rat by injecting hypertonic saline into the episcleral vein. The saline enters the trabecular meshwork via Schlemm&#39;s canal, causing tissue scarring, which blocks aqueous humor outflow and raises intraocular pressure. The elevated pressure damages retinal ganglion cells, leading to glaucoma.

ラットの緑内障誘発のための高張生理食塩水注射法

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
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緑内障誘導の手順

要約

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