This work was supported in part by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 to S.J.C.), the National Institutes of Health (NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), start-up funds from the UConn Health Center (to SJC) and the Kim Family Fund (UCHC in support of K.I.C.).

動物に関わるすべての手順は、実験動物の愛護管理と使用に関する方針に従って行った実験動物福祉（NIH）の事務所が定めるだけの大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）から承認を得てコネチカット保健センター。 混合グリア培養物の調製<ol><li>使用前にすべての楽器を滅菌する。冷たい保つために氷の上で維持さ3の滅菌60ミリメートルペトリ皿にマグネシウム（Mg 2 +またはCa 2 +を）全くの陽イオンを含まない氷冷滅菌ハンクス液（HBSS）の3ミリリットルを追加します。 </li><li>以前に17,18に記載されているように、出生後のP0〜P2の仔マウスからの皮質を分離します。 注：このような海馬などの皮質下構造は、これらの培養物に含まれていません。 </li><li>ねを使って、慎重に髄膜を除去した後、新鮮なHBSSに隔離皮質を転送し、酵素的に組織を解離製造業者のプロトコルに従ってウラル組織切開キット。 </li><li>プレート細胞無菌T-175フラスコに及び[1×ペニシリン/ストレプトマイシンを含む10％ウシ胎児血清（FBS）を含むダ​​ルベッコ改変イーグル培地（DMEM）]を培地中で一晩インキュベートする。 </li><li>新鮮な培地と次の日、すべてのメディアを交換してください。約3週間または携帯単層が確立されるまで、通常のメディアの変化と、文化をインキュベートし続けます。 注：1の比率19：この単層は、約10とアストロサイトとミクログリアから構成されます。 </li></ol>混合グリア培養における2球様細胞の誘導<ol><li> ECMでコーティングされたカバースリップを準備します。 <ol><li> 30分間滅菌したペトリ皿中の滅菌1N塩酸酸（HCl）で円形のカバースリップを浸す。滅菌水の3倍とカバーガラスを洗浄した後、少なくとも20分間、95％エタノールに浸します。した後、空気乾燥させます。 </li><li>希釈された細胞外MATR地滴パラフィルムのシート上九（ECM）タンパク質コーティング材料（滅菌リン酸緩衝液[PBS]中に溶解ラミニンを10μg/ mlの、例えば 150〜250μlの/滴）。これらの液滴の上に置かれたときにカバーガラスが接触しないように液滴を配布します。静かに鉗子を用いて、液滴上にそれぞれ乾燥したカバースリップを配置。 </li><li>約のための小滴上にカバースリップのままにしておきます。サッシと培養フード内部の4-6時間はクローズ。 </li><li> 24ウェルプレートのウェルのそれぞれにECMコーティングされたカバースリップ（ECMコーティングされた面を上）を配置します。滅菌PBSで3回で各ウェルを洗浄し、必要になるまで4℃で保管してください。 </li></ol></li><li>カバーガラス上にめっき用のグリア細胞を調製する。 <ol><li>グリア培養物から培地を吸引除去し、穏やかに滅菌PBS 10mlでグリア単層3回洗う。次に、T-175 8〜10 mlトリプシン-EDTA溶液を加え、37℃で5〜10分間インキュベートする。 </li><li>単層の大部分が分離されたら、完全培地20mlのを追加フラスコにトリプシン処理を停止します。 50mlの円錐チューブに分離した細胞を含む培地を収集し、室温で300×gで10分間スピン。 </li><li>優しくP1000ピペットを用いて溶液をピペッティングすることによって新鮮な完全培地2ml中で細胞を再懸濁後、ペレットを乱すことなく、上清を吸引します。 </li><li>所望の密度（ 例えば 、10 5細胞/ ml）での血球計算板を用いて細胞、完全培地中で再懸濁した細胞の数を決定します。プレートのECMコーティングされたカバーガラス上に細胞（ 例えば 500μlの24ウェルプレートの各ウェルに）。 37℃でのインキュベーションの3〜5日間の各ウェルに追加の新鮮な完全メディアを追加するか、細胞が所望の視覚コンフルエンスに成長するまで。 </li></ol></li><li>サイコシンでの治療。 <ol><li>ストック濃度のジメチルスルホキシド（108.3ミリモル）（DMSO）にサイコシンを再構成。ワーキングストックを作るために100％EtOHにこのストックを希釈することができますnは10μMの最終濃度を達成するために、24ウェルプレートの各ウェルに添加すること。 </li><li>プシコシンを追加する時に、穏やかに培養培地中にプシコシンを混合する培養プレートを旋回させる。一週間一日おきに、10μMと同等のものを追加することでサイコシンサプリメント。 </li></ol></li><li>プシコシン処置の7日後、各ウェルに冷4％パラホルムアルデヒド（PFA）の培地および500μlのピペットを収集する。細胞を固定するために20分間室温でインキュベートする。その後、PBSで各ウェル3回洗浄し（下記参照）、免疫細胞化学のために処理するまで、4℃でプレートを保つ。 注記：所望であれば、細胞培養培地は、この時点で酵素的またはELISAアッセイ用に回収することができる。 </li></ol>球様細胞を可視化するために3。免疫細胞化学（ICC） <ol><li>ブロッキング緩衝液をPBSに交換し、[PBS + 0.3％のTween-20 + 5％正常ヤギ血清（NGS）]、そして室温で1時間、細胞をインキュベートする。 </li><li>中に伊庭-1に対する一次抗血清中の固定された細胞をcubate [（1：1,000）PBSで希釈+ 0.3％+ 2％NGS-20トゥイーン]室温で少なくとも1時間、その後PBSで3回、5分間でそれぞれをよく洗う/洗う。 </li><li>核を識別するための4 &#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（千DAPI、1）で抗体標識及び対比染色のプライマリを識別するために適切な二次蛍光標識抗体を加える。室温で1時間、二次抗体溶液中でインキュベートし、PBSで3×5分間洗浄する。 </li><li>封入剤を使用したスライドを顕微鏡に、各カバーガラスをマウントします。ビューは、視覚的·定量分析のための蛍光顕微鏡にスライドさせる。 </li></ol> 4。分析と初代培養中球様細胞の特性評価<ol><li>培養中の球様細胞を識別するために、次の3つの形態学的基準を使用します。 <ol><li>ミクログリアマーカー、伊庭-1 +のための免疫標識により、蛍光顕微鏡を用いて、球様細胞を識別します。 </li><li>確認する多核として球様細胞（ すなわち 2つ以上のDAPI陽性核を含む）。 </li><li>ミクログリア細胞休止の高度に分岐した外観とは異なる丸い形態によって球様細胞を識別します。 注：細胞はまた、これらの培養物からのフローサイトメトリーによる細胞表面マーカー分析および定量のために回収することができる。 </li></ol></li><li>ミクログリアおよび球様細胞の貪食活性化を測定する<ol><li>プシコシン処理したミクログリアの食作用活性を評価するために、メーカーの指示に従ってウェルにFITCで標識したラテックスビーズを加える。前PFAで固定し、蛍光共役ラテックスビーズ48時間を追加します。ビーズで処理した細胞（セクション2.4で述べたように）、および免疫細胞化学のためのプロセスを（セクション3で説明したように）修正しました。 </li><li>彼らは、フルオロフォア標識されたビーズの蛍光発光スペクトルと重複しないようにフルオロフォア結合二次抗体を選択する。 </li><li> ANALYZ電子蛍光標識ビーズと共局在する細胞を同定することにより、伊庭-1 +ミクログリアの貪食プロファイル。 注：サイコシンがミクログリアを活性化します。貪食ビーズは、この培養設定で単核および多核伊庭-1 +細胞内で識別されます。 </li></ol></li></ol>精製ミクログリア培養から球様細胞の誘導5。 注：アストロサイトとミクログリアの間に間シグナルを解読するための代替アプローチは、 この in vitro球様細胞モデルのもう1つの利点である。次の手順（セクション5.2を参照）で説明したように再播種または共培養のための一次ミクログリア細胞の精製は、培養中のそれらのより低い粘着性によって達成することができる。 <ol><li> 50mlの円錐チューブにコンフルエント混合グリア培養物からメディアを集め、インキュベーター中、37℃で、それを維持する。 </li><li>次混合グリア培養物からミクログリア離。<ol><li>コンフルエント混合グリア培養T175フラスコから培地を除去した後、[+ 25mMの4-（2 - ヒドロキシエチル）-1 - ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）+ 25 mMの重炭酸ナトリウム（Sigma）を完全培地からなる]暖かい振盪メディアを追加する。 100rpmで（37℃）で、オービタルシェーカーで3〜4時間にわたってフラスコを振る。 50mlコニカルチューブにこれらの振とうフラスコから培地を収集します。 注：このメディアは、フラスコからあまり付着性ミクログリアが含まれます。 </li><li>室温で10分間300×gでメディアをスピン。アストロサイト馴化培地2ml中の細胞を再懸濁後、上清を吸引し、（ステップ5.1に集め）。 </li><li>血球計数器を用いて獲得したセルの数を確立した後、基板コーティングしたカバーガラス上にミクログリア細胞をプレート（セクション2.1を参照）免疫細胞化学のために、または他の細胞型との共培養のための球様細胞の将来の収集のために超低付着ウェルプレート上にプレート、そのようなオリゴデンドロサイトなど（DESCなど次の項のribed）。 注：一度（セクション2.3を参照）のようにミクログリアはサイコシン（10μM）で処理することができるメッキ。 </li></ol></li><li>細胞毒性分析のための一次オリゴデンドロサイトとの共培養。 NOTE：オリゴデンドロサイト、またはオリゴデンドロサイト前駆細胞の初代培養物へのその後の共培養のための低接着プレートからプシコシン処理したミクログリアの収集は、 インビトロでのこれらのグロボイド細胞様細胞の潜在的な細胞傷害性機能を調べるために使用することができる。 <ol><li>確立された方法18,20を使用して、プライマリオリゴデンドロサイトの培養液を開発する。サイコシン処理したミクログリアを収集するには、静かに井戸の底から緩く接着細胞を分離するためにピペット。細胞を収集し、10分間300×gで遠心分離し、次に注意深くオリゴデンドロサイト分化培地に再懸濁[（1×）L-グルタミン、神経基本培地からなる、B-27サプリメント（1×）、およびトリヨードチロニン（T3、10ng / mlの）]。 </li><li>血球計数器を用いて細胞数をカウントした後、おおよそ1になり、1×10 5細胞/ mlで、オリゴデンドロサイト培養上ミクログリアをシード：2ミクログリア/オリゴデンドロサイトの比率。最大3日間共培養として培養する。 </li><li>免疫細胞化学のために細胞を修正しました。（セクション2.4を参照）。 ELISAのために細胞培養培地を収集したり、必要に応じて化学分析。 </li></ol></li></ol>

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The authors declare no conflicts of interest.

ここに記載されているプロトコルは、活性化したミクログリアと球様細胞の発達および機能的特徴を研究するための新しいモデルシステムを提供します。イムらによる以前の研究。 HEK293細胞株を使用する球様細胞形成の研究のための21本のプロトコルの開発のためのテンプレートを提供した。それは、モデルで導出球様細胞がGLDにおける識別可能なネイティブ球様細胞とは異?...

また、クラッベ病として知られている球様細胞白質萎縮症（GLD）は、galatocerebrosidase（GALC）遺伝子1における機能変異の喪失に起因する致命的な脱髄性疾患である。 GLDの最も一般的な形態は、幼児期に発症に代表される、多くの場合、年齢2,3、5年前にモーターと早死につながる認知機能低下の積極的な臨床経過することを特徴とする乳児変種です。遺伝子検査は、GLD 4の診断を確認するために使用される。 GLDの神経病理は、球様細胞5-7と呼ばれる広範な脱髄、神経細胞の萎縮、アストログリオーシスおよび充血多核ミクログリアの存在が明らかになる。これらの目立つ細胞の特定の機能は、とらえどころのない推移しているものの、多くの場合、それらの細胞質内に管のある介在物を含む球様細胞の同定は、過去97年間のGLDの決定的な特徴となっている。 非myelの関与GLDの病因におけるinatingグリア（ミクログリアおよびアストロサイト）は、長いこの病気8における深遠な脱髄に二次応答と考えられてきた。興味深いことに、1916年5クヌードクラッベによるこの病気の最初の説明は、「球様細胞」と命名し、この病気の決定的な特徴であるされた脂質の破片を含む多核食細胞の形成を報告した。 GLDでの役割は長い間無視されてきたが、球様細胞は、GLDの病理学の顕著な特徴である。興味深いことに、これらの細胞は、GLDのCNS組織における最も初期の特徴的な変化の一つである。知識の欠如が原因多核食細胞の形成は、他の疾患における巨細胞と呼ばれることを前提に、一般的に病理の結果ではなく、初期の病原性駆動力9とみなされている可能性があります。したがって、WHIのメカニズムを調査し、いくつかの研究がなされているchのグロボイド細胞が特にGLDのCNSにおいて、食細胞から形成される。本報告書に記載されている手順は、CNS中球様細胞の形成及びin vitroでのミクログリアのこれまでのデモサイコシン誘発性多核化の重要性に焦点を当て、これらの細胞は食作用活性の高いレベルを示した。これらの観​​察と一致して、トウィッチャー脳における球様細胞は、頻繁に食作用活性の高いレベルを示唆し、PAS陽性の破片が含まれています。グロボイド細胞はまた、フェリチンのために免疫陽性であることが見出されている（小膠細胞のマーカー）10、KP-1 / CD68（単球マーカー）、およびいくつかはまた、ビメンチンに対して陽性である（中間径フィラメントタンパク質およびアストロサイトのマーカーおよび活性化ミクログリア）11、 HLA-DRA（MHCII表面受容体）、およびTNF-α7、及び伊庭-1 12（小膠細胞を識別するために使用されるカルシウム結合タンパク質）。マーカーのこのコレクションをもとに、球様細胞が発達ミクログリアから発信ユニークな表現型。 彼らの独自性にもかかわらず、特定の機能とGLDの病因へのGCの寄与が大部分は見落とされています。球様細胞は、慢性脱髄の二次的な結果であると考えられてきた。しかし、GLDの白質の病理学に球様細胞の時間的関連性を検討し、過去の研究では、出生後早期の期間に、後期胚形成中球様細胞の存在を同定した。オリゴデンドロサイトのアポトーシスおよび明白な脱髄13に先行回。したがって、GLDにおいて神経病理の発症の時間的シーケンスは、グロボイド細胞がこの疾患の14脱髄の予め形成されていることを示唆している。これはGLD中球様細胞の初期形成はオリゴデンドロサイトのダメージ15に二次的に、反応性応答ではなく、定義する病原性事象を表すことが私たちの仮説につながった。さらに、GLDにおけるミクログリアの活性の調節不全は、事実上考えられてきたrは、この疾患を治療するための16 hematopeotic幹細胞治療の長期有効性を制限する。したがって、プシコシンに応答して細胞機能及びミクログリアの規制、グロボイド細胞を、調査GLDの病因に新たな洞察を提供することが期待される。 最近まで、球様細胞の形成を研究するための適切なモデルの欠如は、GLDの病理学にこれらの細胞の正確な機能と貢献の理解を制限されていた。最近の研究では、グロボイド細胞様細胞がプシコシンに直接応答して、GLDに蓄積する病原性脂質毒素を形成することができることが判明した。私たちは、ミクログリアを発見したではなく、マクロファージは、活性化され、15をサイコシンに応じて、一次グリア培養における球様細胞に形質転換する。球様細胞へのこの変換は、細胞外プロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）-3 15により媒介されることが見出された。さらに最近では、私たちこのin vitroモデル系で開発されたものサイコシン活性化ミクログリアと球様細胞をこれらの調査結果を拡張し、決定したオリゴデンドロサイトおよびオリゴデンドロサイト前駆細胞に強力に有毒である。したがって、GLD、サイコシンやこの疾患におけるミクログリアのための新たなプライマリおよびおそらく病原性の役割を支持する脱髄の前に球様細胞の形成の初期の蓄積の文脈で考えると。 私たちは、球様細胞形成の研究は、この病気の理解に貢献するGLDの病因に関する新しい情報を明らかにすることを提案する。また、GLDこの新しい細胞モデルは、この疾患の病理学的変化に対処するための新規な治療的アプローチをテストすることができ、そこから新たなフォーマットを提供することができる。したがって、本報告書で、私たちは、非ミエリン形成グリアの初代培養からサ ​​イコシン誘発性球様細胞のインビトロ開発のための詳細なプロトコルを提供する。

<table><tbody><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;).</td><td>Life technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Neural Tissue Dissociation Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;#956;m cell-strainer</td><td>Fisherbrand</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;).</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified eagle medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycin</td><td>Life technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Life technologies</td><td>25299-056</td><td></td></tr><tr><td>Psychosine</td><td>Sigma</td><td>P9256</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>19208</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum (NGS)</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>Iba-1</td><td>WAKO</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor conjugated antisera</td><td>Life Technologies</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Media</td><td>Southern Biotech</td><td>OB100-01</td><td></td></tr><tr><td>Phagocytic Assay Kit</td><td>Cayman Chemicals</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>BP310-500</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro model for the study of cellular pathophysiology in globoid cell leukodystrophy

球様細胞白質萎縮症（GLD）の中枢神経系においてユニークに豊富に存在する球様細胞と呼ばれる多核ミクログリアの正確な機能は、不明である。知識のこのギャップは、研究のためのin vitroモデルで適切なの欠如によって妨げられてきた。ここで、私たちは初代マウスグリア培養系を記述するGLDで見られる特徴的な球様細胞に似たミクログリアの多核化におけるサイコシン結果による治療中。この新規なシステムを用いて、グロボイド細胞の研究のための条件および分析のモードを定義した。このモデル系の使用の可能性は、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）のための潜在的な役割を同定し、当社の以前の研究で検証された-3 GLDに。 インビトロ系でのこの小説はこれらのユニークな細胞の形成と機能だけでなく、潜在的な治療操作を、研究するのに有用なモデルかもしれません。

このプロトコルは、書かれたように、（：実験ワークフロースキーム図1を参照してください）最初から最後まで完了するのに約36日かかると予想される。サイコシンに応答した多核細胞の形成は、一貫して7日間の処理で観察されている：それは、この初代培養系における「球様様」細胞の開発は信頼性と再現性の両方であることを私たちの経験をされています。 <p class="jove_co...

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An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

アン<em&gt;体外</em球様細胞白質萎縮症における細胞病態の研究のための&gt;モデル

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

an-vitro-model-for-study-cellular-pathophysiology-globoid-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

7.8K ビュー.  University of Connecticut Health Center. Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells. 

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Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and Schwann cells in the peripheral nervous system (PNS). We use an in vitro myelination assay, an established model for studying CNS myelination in vitro. To do this, oligodendrocyte precursor cells (OPCs) are added to the purified primary rodent dorsal root ganglion (DRG) neurons to form myelinating co-cultures. In order to specifically interrogate the roles that particular proteins expressed by oligodendrocytes exert upon myelination we have developed protocols that selectively transduce OPCs using the lentivirus overexpressing wild type, constitutively active or dominant negative proteins before being seeded onto the DRG neurons. This allows us to specifically interrogate the roles of these oligodendroglial proteins in regulating myelination. The protocols can also be applied in the study of other cell types, thus providing an approach that allows selective manipulation of proteins expressed by a desired cell type, such as oligodendrocytes for the targeted study of signaling and compensation mechanisms. In conclusion, combining the in vitro myelination assay with lentiviral infected OPCs provides a strategic tool for the analysis of molecular mechanisms involved in myelination.

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.

生産と選択的に伝達する一次オリゴデンドロサイト前駆細胞へのレンチを使用するための<em&gt;インビトロ</em&gt;髄鞘形成アッセイ

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

発生生物学

Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.

デュアル赤外線蛍光スキャンを用いてラットオリゴデンドロサイト前駆細胞培養およびOligodendrogenesisの定量化の準備

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating ...

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors within the oligodendrocytic cell lineage. Recently, these cells have been studied as potential source for restorative therapies in white matter diseases. Periventricular leukomalacia (PVL) is the leading cause of non-genetic white matter disease in childhood and affects up to 50% of extremely premature infants. The data suggest a heightened susceptibility of the developing brain to hypoxia-ischemia, oxidative stress and excitotoxicity that selectively targets nascent white matter. Glial restricted precursors (GRP), oligodendrocyte progenitor cells (OPC) and immature oligodendrocytes (preOL) seem to be key players in the development of PVL and are the subject of continuing studies. Furthermore, previous studies have identified a subset of CNS tissue that has increased susceptibility to glutamate excitotoxicity as well as a developmental pattern to this susceptibility. Our laboratory is currently investigating the role of oligodendrocyte progenitors in PVL and use cells at the GRP stage of development. We utilize these derived GRP cells in several experimental paradigms to test their response to select stresses consistent with PVL. GRP cells can be manipulated in vitro into OPCs and preOL for transplantation experiments with mouse PVL models and in vitro models of PVL-like insults including hypoxia-ischemia. By using cultured cells and in vitro studies there would be reduced variability between experiments which facilitates interpretation of the data. Cultured cells also allows for enrichment of the GRP population while minimizing the impact of contaminating cells of non-GRP phenotype.

This protocol outlines the derivation of Glial Restricted Precursors from fetal spinal cords and maintained in vitro either for transplantation or for the study of oligodendrocytic lineage.

E13マウスからグリア制限前駆体の導出

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

神経科学

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

アン<em&gt;エクスビボ</em急性脳スライスにおけるオリゴデンドロサイト指向T細胞攻撃の&gt;モデル

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

免疫・感染学

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

使用してリンパ球血管外漏出の分析<em&gt;インビトロ</em&gt;ヒト血液脳関門のモデル

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are still important because they offer an efficient cellular alternative for studying cellular and molecular events. Though C2C12 myoblast cells have been widely used to study myogenesis, resistance to gene transfection, or viral transduction, hinders research in C2C12 cells. Here, we describe an optimized protocol that includes daily maintenance, transfection and transduction procedures to introduce genes into C2C12 myoblasts and the induction of myocyte differentiation. Collectively, these procedures enable best transfection/transduction efficiencies, as well as consistent differentiation outcomes. The protocol described in establishing DM1 myoblast cell models would benefit the study of myotonic dystrophy, as well as other muscular diseases.

In this protocol, we present the procedures in establishing myotonic dystrophy 1 myoblast models, including optimized C2C12 cell maintenance, gene transfection/transduction, and myocyte differentiation.

C2C12筋芽細胞における筋強直性ジストロフィー1のモデル化

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

医学

Adult Mouse DRG Explant and Dissociated Cell Models to Investigate Neuroplasticity and Responses to Environmental Insults Including Viral Infection

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory neurons and glial satellite cells. These are useful and versatile models to investigate a variety of biological responses associated with physiological and pathological conditions of the peripheral nervous system (PNS) ranging from neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and viral infection. The usage of DRG explant is scientifically advantageous compared to simplistic single cells models for multiple reasons. For instance, as an organotypic culture, the DRG explant allows ex vivo transfer of an entire neuronal network including the extracellular microenvironment that play a significant role in all the neuronal and glial functions. Further, DRG explants can also be maintained ex vivo for several days and the culture conditions can be perturbed as desired. In addition, the harvested DRG can be further dissociated into an in vitro co-culture of primary sensory neurons and satellite glial cells to investigate neuronal-glial interaction, neuritogenesis, axonal cone interaction with the extracellular microenvironment, and more general, any aspect associated with the neuronal metabolism. Therefore, the DRG-explant system offers a great deal of flexibility to study a wide array of events related to biological, physiological, and pathological conditions in a cost-effective manner.

In this report, the advantages of organotypic cultures and dissociated primary cultures of mouse-derived dorsal root ganglia are highlighted to investigate a wide range of mechanisms associated with neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and response to viral infection.

アダルト マウス後根神経節外植体し、解離細胞モデル神経可塑性とウイルス感染を含む環境の侮辱への応答を調査するため

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

ゼブラフィッシュを用いた病的ヒトゲノムの in vivoモデルで

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

生物学

Ex Vivo Myelination and Remyelination in Cerebellar Slice Cultures as a Quantitative Model for Developmental and Disease-Relevant Manipulations

Studying myelination&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo poses numerous challenges. The differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs)&#160;in vitro, although scalable,&#160;does not recapitulate axonal myelination. OPC-neuron cocultures and OPC-fiber cultures allow for the examination of in vitro myelination, but they lack additional cell types that are present in vivo, such as astrocytes and microglia. In vivo&#160;mouse models, however, are less amenable to chemical, environmental, and genetic manipulation and are much more labor intensive. Here, we describe&#160;an&#160;ex vivo mouse cerebellar slice culture (CSC) quantitative system that is useful for: 1) studying developmental myelination, 2) modeling demyelination and remyelination, and 3) conducting translational research. Sagittal sections of the cerebellum and hindbrain are isolated from postnatal day (P) 0&#8211;2 mice, after which they myelinate&#160;ex vivo&#160;for 12 days. During this period, slices can be manipulated in various ways, including the addition of compounds to test for an effect on developmental myelination. In addition, tissue can be fixed for electron microscopy to assess myelin ultrastructure and compaction. To model disease, CSC can be subjected to acute hypoxia to induce hypomyelination. Demyelination in these explants can also be induced by lysolecithin, which allows for the identification of factors that promote remyelination. Aside from chemical and environmental modifications, CSC can be isolated from transgenic mice and are responsive to genetic manipulation induced with Ad-Cre adenoviruses and tamoxifen. Thus, cerebellar slice cultures are a fast, reproducible, and quantifiable model for recapitulating myelination.

Presented is a protocol for an ex vivo quantitative model of demyelination and remyelination using mouse cerebellar slice cultures. This method closely recapitulates an in vivo model with its full complement of CNS cell types in intact tissue, while maintaining the chemical, genetic, and environmental amenability of an in vitro system.

Studying myelination&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo poses numerous challenges. The differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs)&#160;in ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

複数の中枢神経系領域からのマウスグリアの解剖と分離

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

アン

要約

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生産と選択的に伝達する一次オリゴデンドロサイト前駆細胞へのレンチを使用するための

デュアル赤外線蛍光スキャンを用いてラットオリゴデンドロサイト前駆細胞培養およびOligodendrogenesisの定量化の準備

E13マウスからグリア制限前駆体の導出

アン

使用してリンパ球血管外漏出の分析

C2C12筋芽細胞における筋強直性ジストロフィー1のモデル化

アダルトマウス後根神経節外植体し、解離細胞モデル神経可塑性とウイルス感染を含む環境の侮辱への応答を調査するため

ゼブラフィッシュを用いた病的ヒトゲノムの in vivoモデルで

Ex Vivo Myelination and Remyelination in Cerebellar Slice Cultures as a Quantitative Model for Developmental and Disease-Relevant Manipulations

複数の中枢神経系領域からのマウスグリアの解剖と分離

アン

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生産と選択的に伝達する一次オリゴデンドロサイト前駆細胞へのレンチを使用するための

デュアル赤外線蛍光スキャンを用いてラットオリゴデンドロサイト前駆細胞培養およびOligodendrogenesisの定量化の準備

E13マウスからグリア制限前駆体の導出

アン

使用してリンパ球血管外漏出の分析

C2C12筋芽細胞における筋強直性ジストロフィー1のモデル化

アダルト マウス後根神経節外植体し、解離細胞モデル神経可塑性とウイルス感染を含む環境の侮辱への応答を調査するため

ゼブラフィッシュを用いた病的ヒトゲノムの in vivoモデルで

Ex Vivo Myelination and Remyelination in Cerebellar Slice Cultures as a Quantitative Model for Developmental and Disease-Relevant Manipulations

複数の中枢神経系領域からのマウスグリアの解剖と分離

アダルトマウス後根神経節外植体し、解離細胞モデル神経可塑性とウイルス感染を含む環境の侮辱への応答を調査するため