This work was supported in part by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 to S.J.C.), the National Institutes of Health (NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), start-up funds from the UConn Health Center (to SJC) and the Kim Family Fund (UCHC in support of K.I.C.).

동물을 포함한 모든 절차는 동물 애호 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 정책에 따라 수행 된 실험 동물 복지 사무소 (NIH)에 의해 만 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인과 규정 코네티컷 보건 센터. 혼합 폐해 문화의 1 준비 <ol><li> 사용하기 전에 모든기구를 소독. 차가운 유지하기 위해 얼음에 유지 세 멸균 60mm 배양 접시에 (MG 2 + 또는 칼슘을 2 +)에는 양이온을 포함하지 않는 얼음처럼 차가운 무균 행크의 균형 소금 용액 (HBSS) 3 ㎖를 추가합니다. </li><li> 이전 17, 18 설명한 바와 같이, 산후 P0-P2 마우스 새끼의 피질을 분리합니다. 참고 : 같은 해마와 같은 피질 하 구조는, 이러한 문화에 포함되지 않습니다. </li><li> NE를 사용하여 조심스럽게 수막을 제거하고 신선한 HBSS에 고립 피질을 전송하고 효소 조직을 떼어 놓다제조 업체의 프로토콜에 따라 우랄 조직 해부 키트. </li><li> 플레이트 멸균 T-175 플라스크에 세포와 미디어에 밤새 품어 [둘 베코 변형 이글 배지 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신이 포함 된 10 % 소 태아 혈청 (DMEM) (FBS)]. </li><li> 신선한 미디어 다음 일 모든 미디어를 교체합니다. 약 3 주 동안 또는 세포 단층이 설정 될 때까지, 일반 미디어 변화, 문화를 배양하기 위해 계속합니다. 주 : 1 비율 19 :이 단층은 약 10 성상 세포 및 미세 아교 세포로 구성됩니다. </li></ol> 혼합 폐해 문화에서 2 Globoid 세포 유도 <ol><li> ECM 코팅 된 커버를 준비합니다. <ol><li> 30 분 동안 멸균 페트리 접시에 멸균 한 N 염산 (HCL) 원형 커버 슬립 (95 %)을 적 십니다. 멸균 수의 3 배에 커버 슬립을 세척 한 후 적어도 20 분 동안 95 %의 EtOH에 흡수. 다음 자연 건조를 할 수 있습니다. </li><li> 희석 세포 MATR 장소 방울파라 필름의 시트 상 IX (ECM) 단백질 도료 (ML 멸균 인산 완충 용액에 용해 라미닌 10 μg / 예 : 150-250 μL / 액적 [PBS]). 이 물방울에 배치 할 때 커버 슬립 터치 없기 때문 방울을 배포합니다. 조심스럽게 집게를 사용하여 물방울에 건조 된 각 coverslip에 배치합니다. </li><li> 약에 대한 방울에 커버 슬립을 둡니다. 새시와 문화 후드 내부에 4 ~ 6 시​​간 마감했다. </li><li> 24 - 웰 플레이트의 각 웰에 ECM - 코팅 된 커버 (ECM 코팅 사이드)를 놓는다. 멸균 PBS 배와 잘 각을 세척하고 필요할 때까지 4 ° C에 보관하십시오. </li></ol></li><li> Coverslips는에 도금에 대한 폐해 세포를 준비합니다. <ol><li> 아교 문화에서 매체를 대기음 부드럽게 멸균 PBS의 10 ml의 폐해 단층 배를 씻는다. 다음으로, T-175에 8 ~ 10 ㎖의 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 추가하고, 37 ° C에서 5 ~ 10 분 동안 배양한다. </li><li> 단일 층의 대부분이 분리 된 경우, 완전한 미디어 (20)를 가하여플라스크에 트립신을 중지합니다. 50ml의 원뿔형 튜브에 분리 된 세포를 포함하는 매체를 수집하고, 실온에서 300 XG에서 10 분 동안 스핀. </li><li> 부드럽게 P1000 피펫을 사용하여 용액을 피펫 팅하여 신선한 완전한 미디어 2 ㎖에 세포를 다시 일시 중지 한 후 펠렛을 방해하지 않고 상등액을 흡인하고. </li><li> 원하는 밀도 (예를 들면 105 세포 / ㎖)에 완전 배지에서 세포를 일시 중지 한 후 다시 혈구를 사용하여 세포의 수를 결정하고. ECM - 코팅 된 커버 (24 웰 플레이트의 각 웰에 500 ㎕의 예) 위에 세포 플레이트. 37 ° C에서 배양의 각 웰 3-5 일 추가 신선한 전체 미디어를 추가하거나 세포가 원하는 시각적 합류로 성장할 때까지. </li></ol></li><li> Psychosine로 처리. <ol><li> 주식 농도 디메틸 설폭 사이드에서 (108.3 밀리미터) (DMSO)에 psychosine를 복원합니다. 작업 주식을 만들기 위해 100 %의 EtOH이 주식을 희석하는 수n은 10 μM의 최종 농도를 달성하기 위하여 24 웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. </li><li> psychosine를 추가하는 때, 부드럽게 문화 미디어에 psychosine을 혼합 배양 플레이트 소용돌이 친다. 일주에 10 μM 다른 모든 일의 상당을 추가하여 psychosine 보충. </li></ol></li><li> psychosine 치료 7 일 후, 미디어와 각 웰에 차가운 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 피펫 500 μl를 수집합니다. 20 분 세포를 해결하기 위해 상온에서 품어. 그런 다음, PBS로 각 웰 배를 씻어 (아래 참조) 면역 세포 화학 처리 될 때까지 4 ° C에서 접시를 유지합니다. 주 : 필요한 경우 세포 배양액이 시점에서 효소 또는 ELISA 분석을 위해 수집 될 수있다. </li></ol> 3 면역 세포 화학 (ICC)는 Globoid 세포를 시각화 <ol><li> 버퍼 [PBS + 0.3 % 트윈 20 + 5 % 정상 염소 혈청 (NGS)] 차단에 PBS를 교체하고 실온에서 1 시간 동안 세포를 배양한다. </li><li> 에서년 Iba-1에 대해 차 항혈청에 고정 된 세포를 cubate [(1 : 1000) PBS에 희석 + 0.3 % + 2 % NGS-20 트윈] 실온에서 적어도 1 시간 동안, 그 다음 PBS 3X 5 분 간격으로 각을 잘 씻어 / 씻는다. </li><li> 핵을 식별 할 수 : 4 &#39;, 6 - diamidino-2 - 페닐 인돌 (1000 DAPI, 1)와 항체 라벨 및 카운터 얼룩 차를 식별 할 수있는 적절한 보조 형광 접합 된 항체를 추가합니다. 실온에서 1 시간 동안 차 항체 용액에 부화 PBS 3X 5 분간 씻어. </li><li> 설치 매체를 사용하여 슬라이드를 현미경 각 커버 글라스를 탑재합니다. 시각 및 정량 분석​​을위한 형광 현미경에서 볼 슬라이드. </li></ol> (4) 분석 및 차 문화 Globoid 세포의 특성 <ol><li> 문화 globoid 셀을 식별하기 위해 다음과 같은 세 가지 형태 학적 기준을 사용 <ol><li> , 미세 아교 세포 마커 면역 양성 라벨에 의해 이바-1 +를 형광 현미경을 사용하여 globoid 세포를 식별합니다. </li><li> 확인polynucleated (즉, 포함 된 두 개 이상의 DAPI 긍정적 인 핵)로 globoid 세포. </li><li> 미세 아교 세포를 휴식의 높은 지형 모양과 구별 둥근 형태로 globoid 세포를 식별합니다. NOTE : 세포 배양에서 이러한 유동 세포 계측법에 의해 세포 표면 마커 분석 및 정량을 위해 수집 될 수있다. </li></ol></li><li> 미세 아교 세포 및 globoid 세포의 탐식 활성을 측정 <ol><li> psychosine 처리 된 미세 아교 세포의 탐식 활성을 평가하기 위해, 제조업체의 지침에 따라 우물에 FITC 표지 라텍스 구슬을 추가합니다. 이전 PFA로 고정에 형광 - 복합 라텍스 구슬 48 시간을 추가합니다. (3 절에서 설명) 면역 세포 화학 (2.4 절에서 언급 한 바와 같이) 구슬로 처리 된 세포 및 프로세스를 수정합니다. </li><li> 그들은 형광 표지 된 비드 형광 발광 스펙트럼을 겹치지 않도록 형광 공역 이차 항체를 선택한다. </li><li> Analyz전자 해당 셀 식별하여 이바-1 + 미세 아교 세포의 phagocytotic 프로필 형광 표지 구슬 주식 - 지역화. 참고 : Psychosine는 미세 아교 세포를 활성화합니다. Phagocytosed 구슬이 문화 속에서 단핵 및 다핵 이바-1 + 세포 내에서 확인할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 정제 된 미세 아교 세포 배양에서 Globoid 세포의 (5) 유도 참고 : 성상 세포 및 미세 아교 세포 사이의 세포 간 신호를 해독하는 다른 방법이 체외 globoid 셀 모델의 또 다른 장점이다. 다음 단계 (5.2 절 참조)에 설명 된대로 replating 또는 공동 배양을위한 기본 미세 아교 세포의 정제, 문화에서 자신의 낮은 준수 속성에 의해 달성 될 수있다. <ol><li> 50 ML 원뿔 튜브에 합류 혼합 된 아교 문화 매체를 수집하고 배양기에서 37 ° C에서 그것을 유지한다. </li><li> 차 혼합 폐해 문화에서 미세 아교 격리입니다.<ol><li> 합류 혼합 신경교 배양 T175 플라스크에서 매체를 제거한 후, [+ 25 mM의 4 - (2 - 히드 록시 에틸) -1 - 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) + 25 mM의 중탄산 나트륨 (시그마) 완전한 미디어 이루어지는] 따뜻한 흔들면서 용지를 추가한다. 100 회전 (37 ° C에서) 진탕 기에서 3 ~ 4 시간 동안 플라스크를 흔들어. 50 ML 원뿔 튜브에이 동요 플라스크에서 용지를 수집합니다. 참고 :이 미디어 플라스크에서 덜 부착 된 미세 아교 세포가 포함됩니다. </li><li> 실온에서 10 분 동안 300 XG에서 미디어 스핀. 성상 세포 에어컨 미디어 2 ㎖의 세포를 다시 일시 중지 한 후 뜨는을 대기음 (단계 5.1에서 수집). </li><li> 혈구를 사용하고 기판 코팅 된 커버 상에 미세 아교 세포를 플레이트 인수 세포의 수를 구축 면역 세포 화학 (2.1 절 참조), 또는 다른 종류의 세포와 공동 배양 globoid 세포의 미래를 수집 초저 준수의 웰 플레이트에 접시, 같은 희소 돌기 아교 세포로 (내림차순으로) 다음 섹션에서 ribed. 참고 : 일단 미세 아교 세포가 (2.3 절 참조) 전술 한 바와 같이 psychosine (10 μM)로 처리 할 수​​있다 도금. </li></ol></li><li> 세포 독성 분석을위한 기본 희소 돌기 아교 세포와 공동 배양. NOTE : 기본 희소 돌기 아교 세포의 배양, 또는 희소 돌기 아교 세포의 전구 세포 상에 후속 공동 배양 낮은 부착 판으로부터 psychosine 처리 된 미세 아교 세포의 컬렉션은 시험 관내에서 이러한 globoid 유사 세포의 잠재적 인 세포 독성 기능을 검사하는데 사용될 수있다. <ol><li> 설립 방법 (18, 20)를 사용하여 기본 희소 돌기 아교 세포의 문화를 개발한다. psychosine 처리 된 미세 아교 세포를 수집하려면, 부드럽게 우물의 바닥에서 느슨하게 부착 세포를 분리 피펫. 10 분 동안 300 XG에서, 원심 분리기를 세포를 수집하고 신중 Neurobasal 매체 이루어지는 희소 돌기 아교 세포의 분화 매체 [에서 재현 탁, L-글루타민 (1X), B-27 보조제 (1X), 및 트리 요오 도티 로닌 (T3, 10 NG / ㎖ )]. </li><li> 혈구를 이용하여 세포의 수를 계산하고 대략 한 결과, 1 × 105 세포 / ml로 배양 희소 돌기 아교 세포 상에 미세 아교 세포를 시드 : 2 소교 / 희소 돌기 아교 세포의 비율. 최대 3 일 동안 공동 문화로 품어. </li><li> 면역 세포에 대한 세포를 수정 (2.4 절 참조). ELISA를위한 세포 배양 배지를 수집하거나 필요한 화학 분석. </li></ol></li></ol>

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The authors declare no conflicts of interest.

본원에 기재된 프로토콜 개발 및 미세 아교 세포 활성화 및 세포 globoid 기능적 특성을 연구하는 새로운 모델 시스템을 제공한다. 임 외의 사전 작업. HEK293 세포주를 사용하여 globoid 셀 형상 (21)의 연구에 대한 본 프로토콜의 개발을위한 템플릿을 제공 하였다. 이 모델에서 파생 된 globoid 세포가 GLD에 식별 가능한 고유 globoid 세포에서 다르다는 것을 지적하는 것도 중요합니다. GLD에서...

또한 크라 질환으로 알려져 Globoid 세포 leukodystrophy (GLD)는, galatocerebrosidase (galc) 유전자 하나의 기능 돌연변이의 손실로 인한 ​​치명적인 탈수 초성 질환이다. GLD의 가장 일반적인 형태는 초기 아동기에 발병으로 대표되는 자주 시대 2,3의 오년 전에 모터와 조기 사망으로 이어지는인지 기능 저하의 공격적인 임상 경과 특징으로 유아 변종이다. 유전자 검사는 GLD (4)의 진단을 확인하는 데 사용된다. GLD의 신경 병리학은 globoid 세포 5-7라는 대폭적인 탈수 초화, 신경 쇠약, astrogliosis과 부풀어 오른 멀티 핵 미세 아교 세포의 존재를 알 수있다. 이러한 눈에 띄는 세포의 특정 기능이 애매 남아있다하더라도 종종 자신의 세포질에서 tubulous 내포물을 포함 globoid 세포의 식별은 지난 구십칠년에 대한 GLD의 정의하는 기능을하고있다. 비 myel의 참여GLD의 병인에 inating 아교 세포 (미세 아교 세포와 성상 세포는) 길이의이 질병 팔에 심각한 탈수 초화에 차 반응으로 간주되고있다. 흥미롭게도, 1916 5 KNUD 크라 만든이 질병의 첫 번째 설명,라는 이름의 한 지질 파편을 포함하는 다핵 식세포의보고 형성은 &#39;세포를 globoid&#39;이 질병의 특성을 정의합니다. GLD에서의 역할 오랫동안 무시되어 있지만 Globoid 세포는 GLD 병리의 특징 기능입니다. 흥미롭게도,이 세포는 GLD의 CNS 조직에서 가장 오래된 특성을 변경 중입니다. 지식의 부족으로 인해 다핵 식세포, 다른 질환이라는 거대 세포의 형성은 일반적으로 오히려 초기 병원성 원동력이 9보다 병리의 결과로 간주되는 것을 전제로하고 있습니다. 따라서, WHI에 의한 메커니즘을 조사하는 몇몇 연구가 있었다CH globoid 세포는 특히 GLD의 CNS에서 식세포로부터 형성된다. 이 보고서에 기술 된 절차에 CNS globoid 셀 형성의 중요성과 탐식 활성의보다 높은 수준을 나타내 시험 관내 미세 아교 세포 및이 세포의 유도 psychosine multinucleation 이전 시연에 초점을 맞춘다. 이러한 관찰과 일치, twitcher 뇌에서 globoid 세포 자주 식세포 활동의 높은 수준을 제안, PAS 양성 파편이 포함되어 있습니다. Globoid 세포도 페리틴에 대한 면역 양성으로 발견된다 (미세 아교 세포 마커) 10, KP-1 / CD68 (단핵 세포 마커), 그리고 일부는 멘틴에 대한 긍정적 인 (중간 필라멘트 단백질과 성상 세포의 마커 및 활성화 된 미세 아교 세포) 11, HLA-DRA (MHCII 표면 수용체), 및 TNF-α 07 및 12 년 Iba-1 (미세 아교 세포를 식별하는 데 사용되는 칼슘 결합 단백질). 마커의 컬렉션을 기반으로 globoid 세포를 개발하는 미세 아교 세포에서 발생독특한 표현형. 자신의 고유성에도 불구하고, 특정 기능과 GLD의 병인에 대한 GC를 기부금은 크게 간과하고있다. Globoid 세포는 만성 탈수 초화의 이차 결과로 생각되고있다. 그러나 GLD의 백질 병리 globoid 세포의 시간적 관계를 검사하는 과거의 연구는 출생 초기 기간의 후반에 globoid 배아 세포의 존재를 확인했다; 희소 돌기 아교 세포의 세포 사멸 및 명백한 탈수 초화 (13) 위의 시간. 따라서, GLD의 신경 병리학의 발달의 시간적 순서 globoid 세포가이 병 (14)에서 탈수 초화의 사전에 형성되는 것이 나왔다. 이 GLD에서 globoid 세포의 초기 형성이 희소 돌기 아교 세포 손상 15 차, 반응성 응답보다는 정의 병원성 이벤트를 나타낼 수있는 우리의 가설되었다. 또한, GLD에서 미세 아교 세포 활동의 조절 이상은 사실상 간주하고있다R 16이 질병을 치료하기위한 hematopeotic 줄기 세포 요법의 장기 효능을 제한. 따라서 psychosine에 응답하여 미세 아교 세포 기능 및 조절, 및 globoid 세포를 조사 GLD의 병인에 새로운 통찰력을 제공 할 것으로 기대된다. 최근까지 globoid 세포 형성을 연구하기에 적절한 모델의 부족은 정확한 기능과 GLD의 병리 이러한 세포의 기여에 대한 이해를 제한했다. 최근 연구에서, globoid 유사 세포가 GLD 축적 병원성 지질 독소 psychosine 직접적인 반응으로 형성 될 수 있다고 판단 하였다. 우리는 미세 아교 세포를 발견,하지만 대식 세포는 활성화되고 15 psychosine에 대한 응답으로 주 아교 문화 globoid 세포로 변환됩니다. globoid 세포로이 변환은 세포 외 단백질 분해 효소, 매트릭스 메탈 (MMP) -3 (15)에 의해 매개되는 것으로 밝혀졌다. 최근 우리이 체외 모델 시스템 개발이 psychosine 활성화 된 미세 아교 세포 및 globoid 세포를 이러한 연구 결과를 확장하고 결정한 희소 돌기 아교 세포 및 희소 돌기 아교 세포의 전구 세포에 강력하게 독성이. 따라서, GLD, psychosine와이 질병의 미세 아교 세포에 대한 신흥 차 및 가능한 병원성 역할을 지원할 것이다 탈수 초화 이전 globoid 세포 형성의 초기 축적의 맥락에서 고려 될 때. 우리는이 질병에 대한 우리의 이해에 기여할 GLD의 발병 기전에 대한 새로운 정보를 발표 할 예정이다 globoid 세포 형성의 연구를 제안한다. 또한, GLD의 새로운 휴대 전화 모델은 새로운 치료 접근 방법이 질병의 병리학 적 변화를 테스트 할 수 해결할 수있는 새로운 형식을 제공 할 수있다. 따라서이 보고서에서 우리는 비 myelinating 아교 세포의 차 문화 psychosine 유도 globoid 세포의 체외 개발에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;).</td><td>Life technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Neural Tissue Dissociation Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;#956;m cell-strainer</td><td>Fisherbrand</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;).</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified eagle medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycin</td><td>Life technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Life technologies</td><td>25299-056</td><td></td></tr><tr><td>Psychosine</td><td>Sigma</td><td>P9256</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>19208</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum (NGS)</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>Iba-1</td><td>WAKO</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor conjugated antisera</td><td>Life Technologies</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Media</td><td>Southern Biotech</td><td>OB100-01</td><td></td></tr><tr><td>Phagocytic Assay Kit</td><td>Cayman Chemicals</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>BP310-500</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro model for the study of cellular pathophysiology in globoid cell leukodystrophy

globoid 셀 leukodystrophy (GLD)의 중추 신경계에서 독특한 풍부 globoid 세포 불리는 다중 핵 미세 아교 세포의 정확한 기능은 불분명하다. 지식이 격차는 연구를위한 체외 모델의 적절한의 부족에 의해 방해되었다. 여기서, 우리는 기본 뮤린 신경교 배양 시스템을 설명 GLD 검색된 특성 globoid 세포 닮은 미세 아교 세포의 multinucleation psychosine에서 결과하는 치료. 이 신규 한 시스템을 사용하여, 우리는 globoid 세포 연구 및 분석 조건의 모드를 정의. 이 모델 시스템의 사용 가능성은 매트릭스 메탈 (MMP)에 대한 잠재적 인 역할을 식별 우리의 이전 연구에서 입증되었다 -3 GLD에서. 시험 관내 시스템이 신규 이러한 독특한 세포의 형성 및 기능뿐만 아니라 잠재적 인 치료 조작, 공부하는 유용한 모델이 될 수있다.

이 프로토콜은 서면으로, 마무리 (: 실험 워크 플로 계획 그림 1 참조) 시작부터 완료하는 데 약 삼십육일이 걸릴 것으로 예상된다. 그것은이 주 문화 시스템 &#39;globoid 같은&#39;세포의 개발은 신뢰성과 재현성 모두 것을 우리의 경험이다 : psychosine 님의 다핵 세포의 형성은 지속적으로 치료 칠일으로 관찰된다. 대형의 식별을 가능하게 핵 반대 얼룩과 함께 이바-1?...

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An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

<em&gt; 체외</em&gt; Globoid 셀 Leukodystrophy에서 휴대 병태 생리의 연구에 대한 모델

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

an-vitro-model-for-study-cellular-pathophysiology-globoid-cell

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

7.8K 조회수.  University of Connecticut Health Center. Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells. 

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Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and Schwann cells in the peripheral nervous system (PNS). We use an in vitro myelination assay, an established model for studying CNS myelination in vitro. To do this, oligodendrocyte precursor cells (OPCs) are added to the purified primary rodent dorsal root ganglion (DRG) neurons to form myelinating co-cultures. In order to specifically interrogate the roles that particular proteins expressed by oligodendrocytes exert upon myelination we have developed protocols that selectively transduce OPCs using the lentivirus overexpressing wild type, constitutively active or dominant negative proteins before being seeded onto the DRG neurons. This allows us to specifically interrogate the roles of these oligodendroglial proteins in regulating myelination. The protocols can also be applied in the study of other cell types, thus providing an approach that allows selective manipulation of proteins expressed by a desired cell type, such as oligodendrocytes for the targeted study of signaling and compensation mechanisms. In conclusion, combining the in vitro myelination assay with lentiviral infected OPCs provides a strategic tool for the analysis of molecular mechanisms involved in myelination.

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.

생산 및 선택적으로 형질 도입 기본 희소 돌기 아교 세포 전구체 세포에 렌티 바이러스의 사용을위한<em&gt; 체외</em&gt; 수초 분석

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

연구

발생학

Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.

쥐 희소 돌기 아교 세포 전구 문화의 준비 및 Oligodendrogenesis의 정량화 이중 적외선 형광 스캔을 사용하여

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating ...

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors within the oligodendrocytic cell lineage. Recently, these cells have been studied as potential source for restorative therapies in white matter diseases. Periventricular leukomalacia (PVL) is the leading cause of non-genetic white matter disease in childhood and affects up to 50% of extremely premature infants. The data suggest a heightened susceptibility of the developing brain to hypoxia-ischemia, oxidative stress and excitotoxicity that selectively targets nascent white matter. Glial restricted precursors (GRP), oligodendrocyte progenitor cells (OPC) and immature oligodendrocytes (preOL) seem to be key players in the development of PVL and are the subject of continuing studies. Furthermore, previous studies have identified a subset of CNS tissue that has increased susceptibility to glutamate excitotoxicity as well as a developmental pattern to this susceptibility. Our laboratory is currently investigating the role of oligodendrocyte progenitors in PVL and use cells at the GRP stage of development. We utilize these derived GRP cells in several experimental paradigms to test their response to select stresses consistent with PVL. GRP cells can be manipulated in vitro into OPCs and preOL for transplantation experiments with mouse PVL models and in vitro models of PVL-like insults including hypoxia-ischemia. By using cultured cells and in vitro studies there would be reduced variability between experiments which facilitates interpretation of the data. Cultured cells also allows for enrichment of the GRP population while minimizing the impact of contaminating cells of non-GRP phenotype.

This protocol outlines the derivation of Glial Restricted Precursors from fetal spinal cords and maintained in vitro either for transplantation or for the study of oligodendrocytic lineage.

E13 생쥐에서 Glial 제한된 엽 성의 전구 물질의 유도

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

신경과학

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

<em&gt; 생체 내</em&gt; 급성 뇌 조각의 희소 돌기 아교 세포 지시 T 세포 공격의 모델

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

면역학 및 감염병학

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 모델

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are still important because they offer an efficient cellular alternative for studying cellular and molecular events. Though C2C12 myoblast cells have been widely used to study myogenesis, resistance to gene transfection, or viral transduction, hinders research in C2C12 cells. Here, we describe an optimized protocol that includes daily maintenance, transfection and transduction procedures to introduce genes into C2C12 myoblasts and the induction of myocyte differentiation. Collectively, these procedures enable best transfection/transduction efficiencies, as well as consistent differentiation outcomes. The protocol described in establishing DM1 myoblast cell models would benefit the study of myotonic dystrophy, as well as other muscular diseases.

In this protocol, we present the procedures in establishing myotonic dystrophy 1 myoblast models, including optimized C2C12 cell maintenance, gene transfection/transduction, and myocyte differentiation.

C2C12 근육 모세포의 세포에 근긴장 성 이영양증 1 모델링

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

의학

Adult Mouse DRG Explant and Dissociated Cell Models to Investigate Neuroplasticity and Responses to Environmental Insults Including Viral Infection

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory neurons and glial satellite cells. These are useful and versatile models to investigate a variety of biological responses associated with physiological and pathological conditions of the peripheral nervous system (PNS) ranging from neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and viral infection. The usage of DRG explant is scientifically advantageous compared to simplistic single cells models for multiple reasons. For instance, as an organotypic culture, the DRG explant allows ex vivo transfer of an entire neuronal network including the extracellular microenvironment that play a significant role in all the neuronal and glial functions. Further, DRG explants can also be maintained ex vivo for several days and the culture conditions can be perturbed as desired. In addition, the harvested DRG can be further dissociated into an in vitro co-culture of primary sensory neurons and satellite glial cells to investigate neuronal-glial interaction, neuritogenesis, axonal cone interaction with the extracellular microenvironment, and more general, any aspect associated with the neuronal metabolism. Therefore, the DRG-explant system offers a great deal of flexibility to study a wide array of events related to biological, physiological, and pathological conditions in a cost-effective manner.

In this report, the advantages of organotypic cultures and dissociated primary cultures of mouse-derived dorsal root ganglia are highlighted to investigate a wide range of mechanisms associated with neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and response to viral infection.

성인 마우스 DRG Explant와 해리 셀 모델 Neuroplasticity 바이러스 성 감염을 포함 한 환경 모욕에 대 한 응답을 조사 하

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

Danio rerio를 사용하여 병적 인 인간 게놈의 생체 모델링에

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

생물학

Ex Vivo Myelination and Remyelination in Cerebellar Slice Cultures as a Quantitative Model for Developmental and Disease-Relevant Manipulations

Studying myelination&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo poses numerous challenges. The differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs)&#160;in vitro, although scalable,&#160;does not recapitulate axonal myelination. OPC-neuron cocultures and OPC-fiber cultures allow for the examination of in vitro myelination, but they lack additional cell types that are present in vivo, such as astrocytes and microglia. In vivo&#160;mouse models, however, are less amenable to chemical, environmental, and genetic manipulation and are much more labor intensive. Here, we describe&#160;an&#160;ex vivo mouse cerebellar slice culture (CSC) quantitative system that is useful for: 1) studying developmental myelination, 2) modeling demyelination and remyelination, and 3) conducting translational research. Sagittal sections of the cerebellum and hindbrain are isolated from postnatal day (P) 0&#8211;2 mice, after which they myelinate&#160;ex vivo&#160;for 12 days. During this period, slices can be manipulated in various ways, including the addition of compounds to test for an effect on developmental myelination. In addition, tissue can be fixed for electron microscopy to assess myelin ultrastructure and compaction. To model disease, CSC can be subjected to acute hypoxia to induce hypomyelination. Demyelination in these explants can also be induced by lysolecithin, which allows for the identification of factors that promote remyelination. Aside from chemical and environmental modifications, CSC can be isolated from transgenic mice and are responsive to genetic manipulation induced with Ad-Cre adenoviruses and tamoxifen. Thus, cerebellar slice cultures are a fast, reproducible, and quantifiable model for recapitulating myelination.

Presented is a protocol for an ex vivo quantitative model of demyelination and remyelination using mouse cerebellar slice cultures. This method closely recapitulates an in vivo model with its full complement of CNS cell types in intact tissue, while maintaining the chemical, genetic, and environmental amenability of an in vitro system.

Studying myelination&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo poses numerous challenges. The differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs)&#160;in ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

여러 중추 신경계 영역에서 쥐 아교 세포의 해부 및 분리

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

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생산 및 선택적으로 형질 도입 기본 희소 돌기 아교 세포 전구체 세포에 렌티 바이러스의 사용을위한