Name: bladder smooth muscle strip contractility as a method to evaluate lower urinary tract pharmacology
Uploaded: 2014-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
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この研究は、LBにNIH R37 DK54824およびR01 DK57284助成金によってサポートされていました

ここで説明するすべての手順は、ピッツバーグ大学のIACUC委員会により承認されています。 1。ソリューション<ol><li>レシピに従ってKrebs溶液を調製します。 mM単位組成：NaClの118、塩化カリウム4.7、 塩化カルシウム1.9、 硫酸マグネシウム1.2、 炭酸水素ナトリウム24.9、KH 2 PO 4 1.2、ブドウ糖11.7。 </li><li> 95％O 2、5％CO 2で曝気クレブスを、実験全体にわたって使用される37ºC水浴中に置き。脇に置く〜室温で曝気クレブス溶液200mlを組織切開に使用する。 </li><li>曝気クレブスのpH（〜7.4）と、浸透圧（〜300 mOsmで）を測定します。 </li></ol> 2。実験セットアップ（回路図図1A） <ol><li> （95％O 2、5％CO 2）を10mlのクレブスとチャンバー曝気埋める。 </li><li> 37℃にチャンバを加熱する循環水ポンプを始動;アンプ（S）、刺激剤（：必要な機器の電源を入れるs）とレコーディングソフトウェア。 </li><li> 1グラムの重量を有する変換器を校正します。 </li></ol> 3組織（図1B） ：以下の手順に従って、大人のナイーブな女性のSprague Dawleyラット（〜10〜12週齢200〜250グラム）から膀胱を削除する<ol><li>解剖エリアと必要な器具の準備：電気カミソリ、歯鉗子、メスの刃、解剖ハサミ、microscissorsを、2解剖鉗子は、組織·クリップ（または絹縫合糸）、クレブスとしたシルガードコーティングされた解剖皿（著者は、デュモン鉗子＃3を好む）組織切開端子です。 </li><li>誘導チャンバー内のイソフルラン吸入（O 2中4％）で動物を麻酔。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。継続的に反射を撤回呼吸数、外部刺激に応答して、リア四肢の喪失を観察することによって、麻酔のレベルを監視します。 </li><li>動物は、ひげをそる下腹部A麻酔をされた場合レア。腹部正中切開により骨盤臓器を公開します。膀胱と尿道を特定します。近位尿道の近くに膀胱頸部で切断することにより、膀胱を削除します。曝気クレブス溶液で満たされたシルガードコーティングされた皿に、すぐに組織を置きます。 </li><li>必要であれば、この時点で追加の組織を除去する：尿道、胃腸（GI）管および/ ​​または前立腺の断片など </li><li> IACUC承認された方法（ 例えば 、麻酔薬の過剰投与または二次の方法に続いてCO 2窒息）を用いて動物を生け贄に捧げる。 </li><li>さらに解剖のための組織を安定させるために、膀胱ドーム、首、尿管を通って組織切開のピンを挿入します。組織を伸ばさない。存在する場合、脂肪、結合組織、近位尿道および尿管を取り外します。 </li><li>平坦なシートを作成するためにドームにベースから膀胱を開き、漿膜側を下/腔側アップ（ 図1B）。組織の各コーナーに解剖のピンを配置します。膀胱D​​OMを削除するeと首組織。 </li><li>実験の目的は粘膜（尿路上皮と固有層-ダイアグラム図1Cを参照）の寄与を決定することである場合には、平滑筋収縮をして、添付粘膜ずに排尿筋ストリップの特性を比較。このために、帯状に組織を切断する前に、慎重にアイリスを用いて粘膜層を除去し、ハサミ、解剖顕微鏡下で、微細鉗子を春。実験の最後に、粘膜の完全な除去を確認するために、H＆E染色のためにストリップを固定します。この手順は、ラットの膀胱に比べて、マウスの膀胱内に簡単であることに注意してください。 </li><li> 〜2×8ミリメートル（ 図1B）の短冊状にドームにベースから縦に組織を切断する。接続するか、各ストリップの両端に、組織のクリップを取り付けます。 注：ワンラットの膀胱は、通常は4ストリップに切断することができますが、ストリップの数は、動物/膀胱サイズに応じて増減することができます。 </li><li> EXPERにストリップを転送imental室。固定されたガラス/金属棒に組織収縮を測定する力変換器に各ストリップの一端を取り付け、その他。 注：組織チャンバーのサイズは（20ミリリットル以上0.2 ml）を変化させる。げっ歯類ブラダーのための典型的なチャンバーは完全に溶液中に浸漬するストリップのために十分な高さを提供する5〜20ミリリットルである。一部のチャンバーは、内蔵の刺激電極と他人をしない来る。ケアは、特に電場刺激が信頼できない、電極のすべての接続が良好な状態であることを保証するために注意すべきである。 </li><li>ベースライン張力が1g（〜を10mN）に達するまで穏やかに組織を延伸することによって、各ストリップに力が規定量を適用する。当初は組織は、ベースラインの張力の減少として記録されているリラックスする傾向がある。ウォッシュ暖かい曝気クレブスを用いて組織ごとに約15分であり、各洗浄後に1グラムのベースライン張力を調整すること。 （ベースラインテンションが安定している組織は〜のために1〜2時間まで、または平衡化することを許可するすなわち 、それ以上の組織弛緩）。 </li><li>直接〜5分間浴、またはプラトー応答が到達するまでのKCl（80ミリモル）を添加することにより、試験組織の生存率。 KClを高濃度に応答も実験中または実験の最後に反復し（データ解析部の下に正規化を参照）、他の薬物またはストリップ間の応答を正規化するために使用することができる。 </li><li>組織が前処理条件に戻れるようにする温かい曝気クレブスで洗う組織を複数回（3-5x）。 </li></ol> 4。刺激プロトコル<ol><li>自発的な筋原性活動や平滑筋緊張に対する病理学の影響を調査するために、平滑筋などのSCI、BOOなどの異なる動物モデルからのストリップ、または新生児を使用します。 図2に、開発中に膀胱の自発活動の変化を調査するためにこの方法を使用することを示し、 SCI後。さらに、薬理学的薬剤は、種を調節するために使用され得るontaneous活動。 図3に、自発的な活動と平滑筋の緊 ​​張に、KCNQチャネル調節、フルピルチンとXE991の効果を示す。 </li><li>定義された時間間隔で浴に直接濃縮ストック溶液から化合物を添加することにより薬理平滑筋刺激コンストラクト濃度応答曲線である。車両や時間の影響を考慮するために平行なストリップに薬物および車両を使用してください。 <ol><li> 1000倍の最終使用濃度において所望の試験化合物のストック溶液を作る。 10 -5 M、3×10 -5 M、10 -4 M、3×10 -4 M、10 -3 M、3×10 -3 M：カルバコール（CCH）、ムスカリン性受容体作動薬は、以下のストックを調製、10 -2 M.浴中の最終濃度は10 -5 M（ 図4C、D）を10 -8 Mである。 10 -8 M、10 -7：ニューロメジンB（NMB）、ボンベシン受容体サブタイプ1アゴニストは、以下の株式を準備M、10 -6 M、10 -5 M、10 -4 M、10 -3 Mと浴中の最終濃度である10 -11 M〜10 -6 MのCChとNMB両方は、組織の収縮性を増加することが予想される。 </li><li> 10ミリリットル組織槽の場合は、できるだけ早く応答がプラトー（ 図4C、D）に到達するように、各制御CHのストック溶液10μlを加える。平行なストリップでは車両の等量（水）を追加します。同様に、各ニューロメジンBストック溶液10μl毎〜5分を追加します。 注： 図4の異なる種からのストリップにおける平滑筋緊張に対するNMBとのCChの興奮効果を観察します。 </li><li>興奮剤は、通常のCChまたはKClで予め収縮組織中の平滑筋の弛緩特性を調査します。 </li><li>アゴニスト応答をブロックするには、事前のアゴニスト刺激に対する組織の浸透を、可能にするためにアンタゴニストで10〜20分間、組織を前処理。 </li></ol></li><li>神経stimのためにまた、電場刺激（EFS）と呼ばれる平滑筋のulationは、3.13〜ステップ1に従い、以下に説明するように継続する。 EFSを選択的に平滑筋に対する神経を活性化することを意図している。刺激のパラメータは、慎重に直接平滑筋の刺激を避けるように選択すべきである。 <ol><li>刺激パラメータを確立します。刺激のタイプ（単一パルスまたは電車）、持続時間（パルス持続時間と列持続時間）、頻度と強度は、以下の手順で説明し、 図5A、Bに示すように。 <ol><li>単一パルス刺激は、パルス持続時間、刺激間間隔および所望の刺激の数を設定する。通常の刺激持続時間パラメータは、所望の間隔（ 図5A）で供給0.05〜0.3ミリ秒の持続時間の単一のパルスである。刺激強度に対するステップ4.3.1.4に従ってください。 </li><li>列車の刺激のために、列持続時間およびインタートレイン間隔を設定します。膀胱組織の典型的な値は3〜10秒には、少なくとも1メートルを配信されます離れにある（ 図5B）。組織疲労が（ つまり、EFS収縮が制御期間中に減少）が発生した場合は、インタートレイン間隔を増やします。 </li><li>電車の中で列車の刺激の周波数（パルスの数を確立 - 図5B）。 0.5〜50 Hzの範囲の周波数応答曲線を実行します。膀胱のための典型的な周波数は、ATPとのAChによって仲介再現性のある安定した収縮を与える10-20 Hzである。この方法は、コリン作動性神経伝達にプリンのメカニズムの寄与を評価するために使用できる方法を示す図5のマウスの膀胱ストリップにおけるEFS刺激に対する周波数依存応答を観察します。 </li><li>刺激の強度を確立する：（使用して列車は周波数を一定に保つ場合）収縮の振幅がプラトーに達するまで体系的に刺激の強度（電圧）を増大させる。 </li><li>に応じて刺激の強さを設定実験の目的。目的は、神経誘発収縮を増加させることである場合には、収縮の振幅が最大収縮の約50％であるような準最大強度を使用する。目的は、神経誘発収縮を減少させることである場合は、組織の疲労を回避するために、最大振幅の〜80％に強度を設定する。 </li></ol></li><li>刺激パラメータ（期間、頻度と強度）が確立されると、EFS-のため20〜30分は、薬物検査の前に安定させるために収縮を誘発〜許す。 注：Na +チャネル遮断薬で、神経伝達を遮断、神経伝達のためにEFSの選択性を確認するには、テトロドトキシン（TTX; 0.5〜1μM）。 TTXは、比較的簡単に洗い流すように、実験開始時にこの手順を実行します。また、（ステップ4.3.5を参照してください。下の）実験の最後に、これを実行します。 </li><li>のために1,000倍の最終作業濃度でストック溶液を準備します。アルファ、ベータメチレンATP（ABMA;プリン受容体活性化剤と減感）10 -2 M、アトロピン（ムスカリン受容体拮抗薬）10 -3 M（ 図5C）。図6の他の例を観察する。5HT4受容体アゴニスト、シサプリド（3×10 -6 M、10 -6 Mを、3×10 -5 M、10 -5 M、3×10 -4 Mを、10 -4 M、 3×10 -3 M、10 -3 M）は、組織の収縮およびSB-203186（3×10 -3 M）、5HT4受容体拮抗薬が増加しシサプリドの効果を逆転させる。 </li><li> EFS（ 図5C）にABMAおよびアトロピンの効果を試験するために、2つの制御周波数応答曲線を実行する。 10μMの最終濃度浴に10 -2 M ABMA10μlのを追加します。これは、平滑筋におけるプリン受容体の直接刺激に組織を収縮する。ベースラインへの応答が戻った後、周波数応答曲線を繰り返す。最後のconcentrat 10 -3 Mのアトロピン10μlのを追加1μMのイオン。 （ムスカリン受容体を遮断するアトロピンのために必要）〜10分後、周波数応答曲線を繰り返す。平行なストリップでは、各ステップにおいて、車両、水10μlを加える。 注： 図6の他の例については、定義された時間間隔で、各シサプリドストック溶液10μlを加える（〜15分毎に、説明を参照）、お風呂に直接SB-203186のストック溶液10μlが続き、に対するそれらの効果を監視するEFS誘発収縮。平行なストリップでは車両のDMSO 10μlを加える。シサプリドの効果を観察し、 図6のヒト膀胱と回腸組織におけるEFS誘発収縮に対する5HT4受容体作動薬は、。さらに、ヒト膀胱および回腸組織におけるEFS誘発収縮に対するDMSOの影響、シサプリドのための車両を観察。 </li><li> EFSプロトコルの終わりに、Na +チャネル遮断薬、テトロドトキシン（TTXで神経伝達を遮断することにより、EFSの選択性を検証する。0.5-1＆＃181; M）。 TTX抵抗性の収縮がまだ存在している場合は、その後の実験では、刺激の持続時間と強度を調整することをお勧めします。 </li></ol></li><li>前または後シナプス部位（ 図7A）に対する薬物の効果を測定するために4.3.2ステップ1に従ってください。カルバコールとEFSに再現性のある反応を確立し、その後、薬物Xを追加</li><li>実験の最後に、クリップを取り除くまたはストリップをほどく、余分な液を除去し、天秤を使用して各ストリップの重量を測定するためにティッシュ紙の上にそっとブロット。また、断面積を決定するために、キャリパーを用いて組織の長さを測定する。この情報は、データの正規化のために使用されます（セクション5.4を参照）。 </li></ol> 5。データ解析適切なソフトウェア（ 例えば 、Windaq、LabChartの）を使用してデータを分析します。 <ol><li>自発的活動のために、薬剤誘発性応答のピークの前とで少なくとも30秒のウィンドウを選択してくれASURE振幅と筋原性活動の頻度（ 図3）。 <ol><li>膀胱の異なる部分の間に相違がある応答の収縮性かどうかに寄与する周波数のスペクトルを決定するために、高速フーリエ変換解析を使用して（ 例えば 、首対ドーム）または開発、病理学、および薬8である。 </li></ol></li><li>平滑筋の緊張への影響については前と薬剤誘発性応答のピークで少なくとも10〜30秒のウィンドウを選択し、収縮の振幅を測定。 </li><li>神経誘発収縮に対する効果について（少なくとも3）の前に、薬剤誘発性応答のピーク時に収縮の曲線下振幅、持続時間と面積を測定します。 NOTE：プリン作動性およびコリン作動性の成分が異なる速度を持っているので、EFS誘導性収縮の振幅曲線下面積の両方を測定する必要がある。プリンコンポーネントは迅速かつ一過性である（ATPはpurinergiを活性化させるカルシウムの迅速な流入を可能にするようなP2X1などのCイオンチャネル型チャンネルは、それらは、このように曲線下面積に対するピーク振幅応答に対してより少ない貢献、）脱感作。コリン作動性成分（アセチルコリンが最終的に収縮を誘導するために、平滑筋を脱分極イオンチャネルを活性化する細胞内経路を活性化するために多くの時間を必要とする代謝型ムスカリン受容体を活性化する）遅く、持続的である。このように、ムスカリン性成分は曲線下面積を測定することによって、より良いキャプチャされます。 </li><li>ストリップ及び薬理学的治療を横切っ結果を比較することができるようにデータを正規化する。正規化のために選択されたパラメータは、病理学的状態を研究や実験計画、試験化合物によって影響されるべきではありません。これらのパラメータのうち、利用ストリップの重量、断面積、塩化カリウム応答（ 図4B）、最大応答（ 図7B）の％または別の収縮剤に対する最大応答の％（ 例えば 、のCCh）やリラックス剤（ 例えば 、パパベリン）。 </li></ol>

著者は、彼らが競合する金融利害がないことを宣言します。

本論文では、膀胱生理学および病理学に関連する重要な科学的問題の数だけでなく、膀胱機能不全を治療する新薬の発見を助けるに対処するために使用することができ、簡単なin vitroでの平滑筋収縮方法を説明した。私たちは、膀胱平滑筋の収縮（ 図2-4）、神経伝達変調（ 図5-7A）、種差（ 図4）、臓器差（ 図6）、発達病理学的およ?...

膀胱平滑筋は、尿貯蔵及び契約は、尿排泄を誘発することができるように緩和する。リラクゼーションには、固有の平滑筋の特性によっておよび排尿筋におけるβアドレナリン受容体（ヒトにおけるβ3 AR）を活性化する交感神経からのノルエピネフリンの持続放出（NE）によって媒介される。排尿は、交感神経入力を抑制し、膀胱平滑筋1を収縮させるアセチルコリン/ ATPを放出する副交感神経を活性化することによって達成される。脳および/ ​​または脊髄損傷、神経変性疾患、糖尿病、膀胱出口閉塞または間質性膀胱炎を含む多くの病理学的状態は 、重度の生命2の患者の質に深刻な影響を与え、膀胱機能を変化させることができる。平滑筋、求心性または遠心性神経および/またはこれらの条件は、膀胱の1つ以上の構成要素に影響を与えることにより、平滑筋の収縮性を変化させる粘膜。 膀胱機能を研究するin vivoおよびin vitroの方法にはいくつか開発されている。 インビボでは 、膀胱内圧測定は、膀胱機能の主要な測定である。これは生理的条件に近い条件下での情報の収集を可能にする無傷製剤であるが、平滑筋ストリップの使用が優先される状況が多数ある。これらは、外科的および/ ​​または薬理学的操作は生存およびインビボでの製剤の安定性、または影響を与える状況を含む研究は、ヒト組織または高価な化学薬品の使用を必要とする場合。この方法はまた、膀胱の各コンポーネントに対する薬剤、年齢や病状の効果の検討を容易にする平滑筋、粘膜、求心性及び遠心性神経、すなわち 。 膀胱ストリップは、科学的な質問の数に答えるために、多くのグループによって長年にわたって使用されてきた。彼らは、エヴァに使用された病理学によって誘導された筋原自発活動のluate変化。この活動は、過活動膀胱（OAB）の緊急性と周波数の症状に寄与すると考えられ、したがって、OAB 3-9のために開発されて薬物のための標的である。膀胱ストリップはまた、イオンチャネルおよび/ ​​または平滑筋の弛緩または収縮のいずれかを誘導するために標的化され得る受容体および/ ​​または細胞内経路を発見する目的で、平滑筋緊張を調節する筋原性および神経因子を調査するために使用された3,10- 13。他の研究では、送信機及び受容体関与しており、病理14,15によって誘導された変更を含む、神経伝達の性質に焦点を当てている。さらに、この方法は、器官19-21、および薬物の構造活性相関の評価の22〜24の間、異なる種からの組織の16〜18間の比較のために使用されてきた。この方法の拡張は、MEASURするために使用されている遠心性神経25から伝達物質の放出に対する薬物の効果を電子。さらに、組織（膀胱、尿道、消化管、GI）（研究のために承認手術または臓器ドナー組織からの）動物またはヒトから採取し、脊髄損傷（SCI）、膀胱出口閉塞などの動物モデルの多様から多様な（BOO）、または間質性膀胱炎（IC）は、この技術を使用して調べることができる。 本論文では、上記のいくつかの科学的問題に対処するために、必要な実験プロトコルと一緒に、このメソッドの使用例を示します。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Tissue Bath System with Reservoir</td><td>Radnoti, LLC</td><td>159920</td><td>isolated tissue baths</td></tr><tr><td>Warm water recirculator pump</td><td>Kent Scientific Corporation&amp;nbsp;</td><td>TPZ-749</td><td>to keep tissue baths to 37 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>Computer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Data Acquisiton System</td><td>DataQ Instruments</td><td>DI-710-UH</td><td>To view, record and analyze data</td></tr><tr><td>Transbridge Transducer Amplifier</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-TBM4M</td><td>Transducer amplifier</td></tr><tr><td>Grass stimulator</td><td>Grass Technologies</td><td>Model S88</td><td>Stimulator</td></tr><tr><td>Anesthesia System</td><td>Kent Scientific Corporation&amp;nbsp;</td><td>ACV-1205S</td><td>To anesthetesize the animal</td></tr><tr><td>Anesthetizing Box</td><td>Harvard Apparatus</td><td>500116</td><td>To anesthetesize the animal</td></tr><tr><td>Anesthesia Masks</td><td>Kent Scientific Corporation&amp;nbsp;</td><td>AC-09508</td><td>To anesthetesize the animal</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Materials and Surgical Instruments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning Corp</td><td>184 SIL ELAST KIT</td><td>To pin, dissect, &amp;amp; cut tissue</td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Corning</td><td>3160-152</td><td>To dissect/cut tissue</td></tr><tr><td>Insect Pins</td><td>ENTOMORAVIA Austerlitz Insect Pins</td><td>Size 5</td><td>To pin tissue</td></tr><tr><td>Bench Pad</td><td>VWR International</td><td>56617-014</td><td>Absorbent bench underpads</td></tr><tr><td>Rat surgical Kit</td><td>Kent Scientific Corporation&amp;nbsp;</td><td>INSRATKIT</td><td>To remove and dissect tissue</td></tr><tr><td>2 Dumont #3 Forceps</td><td>Kent Scientific Corporation&amp;nbsp;</td><td>INS500064</td><td>To remove and dissect tissue</td></tr><tr><td>Tissue Forceps</td><td>Kent Scientific Corporation&amp;nbsp;</td><td>INS500092</td><td>To remove and dissect tissue</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Kent Scientific Corporation&amp;nbsp;</td><td>INS500236</td><td>To remove and dissect tissue</td></tr><tr><td>Scalpel blade</td><td>Kent Scientific Corporation&amp;nbsp;</td><td>INS500239</td><td>To remove and dissect tissue</td></tr><tr><td>Professional Clipper&amp;nbsp;</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>CLP-223&amp;nbsp;45</td><td>To remove fur</td></tr><tr><td>Suture Thread</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-50</td><td>Tie tissue</td></tr><tr><td>Tissue Clips</td><td>Radnoti, LLC</td><td>158802</td><td>Attach tissue to rod/transducer</td></tr><tr><td>1 g weight</td><td>&amp;nbsp;Mettler Toledo</td><td>11119525</td><td>For transducer calibration</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Krebs Solution:&lt;br /&gt;Sodium chloride&lt;br/&gt; Potassium chloride&lt;br/&gt; Monobasic potassium phosphate&lt;br/&gt; Magnesium sulfate&lt;br/&gt; Dextrose&lt;br/&gt; Sodium bicarbonate&lt;br/&gt; Calcium chloride&lt;br/&gt; Magnesium chloride</td><td>&amp;nbsp;&lt;br /&gt;Sigma&lt;br/&gt; Fisher&lt;br/&gt; Fisher&lt;br/&gt; Fisher&lt;br/&gt; Fisher&lt;br/&gt; Sigma&lt;br/&gt; EMD&lt;br/&gt; Baker</td><td>&amp;nbsp; &lt;br /&gt;S7653&lt;br/&gt; P217-500&lt;br/&gt; P285-3&lt;br/&gt; M65-500&lt;br/&gt; D16-500&lt;br/&gt; S5761&lt;br/&gt; CX0130-2&lt;br/&gt; 2444</td><td>To prepare Krebs solution</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>029405</td><td>To anesthetesize the animal</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Oxygen tank</td><td>Matheson Tri Gas</td><td>ox251</td><td>To use with anesthesia system</td></tr><tr><td>Carbogen Tank (95% Oxygen; 5% Carbon Dioxide)&amp;nbsp;</td><td>Matheson Tri Gas</td><td>Moxn00hn36D</td><td>To aerate Krebs solutions</td></tr></tbody></table>

bladder smooth muscle strip contractility as a method to evaluate lower urinary tract pharmacology

私たちは、 インビトロ膀胱平滑筋の収縮性を測定する方法、及び生理学的および薬理学的な平滑筋の特性ならびに病理学によって誘導された変化を調査するためのその使用を記載している。この方法は、外科的および薬理学的調製物の安定性および生存に影響を与える操作が、ヒト組織の使用、および/ ​​または高価な化学物質の使用のようなin vivo実験において遭遇する主要な方法論的な困難を克服しながら膀胱機能を理解するための重要な情報を提供する。また、健康的で病的状態で各袋コンポーネント（ すなわち 、平滑筋、粘膜、神経）の特性を調べるための方法を提供します。 膀胱は、麻酔した動物から取り出しクレブス溶液中に入れ、ストリップに切断される。ストリップは温かいKrebs溶液で満たされたチャンバ内に配置されている。一端はアイソメトリックtensioに取り付けられている収縮力を測定するためのn個のトランスデューサ、他端が固定されたロッドに取り付けられている。組織を直接浴にまたはインビボで膀胱収縮をトリガーに似神経を活性化する電場刺激電極によって化合物を添加することによって刺激される。個々の膀胱の成分の役割は、平滑筋活性の調節に関与する因子、発達中および実験的脊髄損傷後の神経伝達（関連する送信機および受容体）の性質を自発的平滑筋収縮性を評価するために、この方法の使用を実証する、と種との薬理学的薬剤に応答して、臓器の違い。さらに、それは伝達物質の放出の収縮および/または平滑筋の弛緩、薬物の構造活性相関評価に関与する細胞内経路を調査するために使用することができる。 in vitroでの平滑筋収縮法がfoは広く使用されている50歳以上のR、および大幅に膀胱機能の理解にも同様に、現在膀胱管理のために臨床的に使用される化合物の医薬開発に貢献したデータを提供してきました。

自発筋原アクティビティ 自発筋原活性は生後発達6-9および病理学的変化（ 例えば 、SCI、BOO）3-5を受ける重要な平滑筋の特徴である。この活性は、過活動膀胱（OAB）2の症状に寄与すると考えられるので、それを調節する受容体、細胞内経路及び薬理学的薬剤の評価は、OABおよびその他の平滑筋機能障害のための有効な治療を?...

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Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

この原稿は、薬理学的薬剤または神経刺激に応答して平滑筋収縮性を評価するためのインビトロの方法で 、シンプルでありながらパワフルなを提示します。主な用途は、薬物スクリーニングと理解組織生理学、薬理学、病理学である。

下部尿路薬理学を評価するための方法として膀胱平滑筋収縮ストリップ

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

26.2K ビュー.  University of Pittsburgh School of Medicine. この原稿は、薬理学的薬剤または神経刺激に応答して平滑筋収縮性を評価するためのインビトロの方法で 、シンプルでありながらパワフルなを提示します。主な用途は、薬物スクリーニングと理解組織生理学、薬理学、病理学である。 

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Mouse Bladder Wall Injection

Mouse bladder wall injection is a useful technique to orthotopically study bladder phenomena, including stem cell, smooth muscle, and cancer biology. Before starting injections, the surgical area must be cleaned with soap and water and antiseptic solution. Surgical equipment must be sterilized before use and between each animal. Each mouse is placed under inhaled isoflurane anesthesia (2-5% for induction, 1-3% for maintenance) and its bladder exposed by making a midline abdominal incision with scissors. If the bladder is full, it is partially decompressed by gentle squeezing between two fingers. The cell suspension of interest is intramurally injected into the wall of the bladder dome using a 29 or 30 gauge needle and 1 cc or smaller syringe. The wound is then closed using wound clips and the mouse allowed to recover on a warming pad. Bladder wall injection is a delicate microsurgical technique that can be mastered with practice.

Mouse bladder wall injection is a useful approach to orthotopically study bladder stem cell and cancer biology. This delicate microsurgical method can be mastered with careful technique and practice.

マウスの膀胱壁インジェクション

Mouse bladder wall injection is a useful technique to orthotopically study bladder phenomena, including stem cell, smooth muscle, and cancer biology. ...

医学

Manual Muscle Testing:  A Method of Measuring Extremity Muscle Strength Applied to Critically Ill Patients 

Survivors of acute respiratory distress syndrome (ARDS) and other causes of critical illness often have generalized weakness, reduced exercise tolerance, and persistent nerve and muscle impairments after hospital discharge.1-6 Using an explicit protocol with a structured approach to training and quality assurance of research staff, manual muscle testing (MMT) is a highly reliable method for assessing strength, using a standardized clinical examination, for patients following ARDS, and can be completed with mechanically ventilated patients who can tolerate sitting upright in bed and are able to follow two-step commands. 7, 8 
This video demonstrates a protocol for MMT, which has been taught to &ge;43 research staff who have performed &gt;800 assessments on &gt;280 ARDS survivors. Modifications for the bedridden patient are included. Each muscle is tested with specific techniques for positioning, stabilization, resistance, and palpation for each score of the 6-point ordinal Medical Research Council scale.7,9-11 Three upper and three lower extremity muscles are graded in this protocol: shoulder abduction, elbow flexion, wrist extension, hip flexion, knee extension, and ankle dorsiflexion. These muscles were chosen based on the standard approach for evaluating patients for ICU-acquired weakness used in prior publications. 1,2.

Manual Muscle Testing:  A Method of Measuring Extremity Muscle Strength Applied to Critically Ill Patients

Survivors of acute respiratory distress syndrome (ARDS) and critical illness frequently develop long-lasting muscle weakness. Manual muscle testing (MMT) is a standardized clinical examination commonly used to measure strength of peripheral skeletal muscle groups. This video demonstrates MMT using the 6-point Medical Research Council scale.

徒手筋力テスト：四肢筋力の測定方法は、危篤状態の患者に適用

Survivors of acute respiratory distress syndrome (ARDS) and other causes of critical illness often have generalized weakness, reduced exercise tolerance, ...

Evaluation of Biomaterials for Bladder Augmentation using Cystometric Analyses in Various Rodent Models

Renal function and continence of urine are critically dependent on the proper function of the urinary bladder, which stores urine at low pressure and expels it with a precisely orchestrated contraction. A number of congenital and acquired urological anomalies including posterior urethral valves, benign prostatic hyperplasia, and neurogenic bladder secondary to spina bifida/spinal cord injury can result in pathologic tissue remodeling leading to impaired compliance and reduced capacity1. Functional or anatomical obstruction of the urinary tract is frequently associated with these conditions, and can lead to urinary incontinence and kidney damage from increased storage and voiding pressures2. Surgical implantation of gastrointestinal segments to expand organ capacity and reduce intravesical pressures represents the primary surgical treatment option for these disorders when medical management fails3. However, this approach is hampered by the limitation of available donor tissue, and is associated with significant complications including chronic urinary tract infection, metabolic perturbation, urinary stone formation, and secondary malignancy4,5.
Current research in bladder tissue engineering is heavily focused on identifying biomaterial configurations which can support regeneration of tissues at defect sites. Conventional 3-D scaffolds derived from natural and synthetic polymers such as small intestinal submucosa and poly-glycolic acid have shown some short-term success in supporting urothelial and smooth muscle regeneration as well as facilitating increased organ storage capacity in both animal models and in the clinic6,7. However, deficiencies in scaffold mechanical integrity and biocompatibility often result in deleterious fibrosis8, graft contracture9, and calcification10, thus increasing the risk of implant failure and need for secondary surgical procedures. In addition, restoration of normal voiding characteristics utilizing standard biomaterial constructs for augmentation cystoplasty has yet to be achieved, and therefore research and development of novel matrices which can fulfill this role is needed.
In order to successfully develop and evaluate optimal biomaterials for clinical bladder augmentation, efficacy research must first be performed in standardized animal models using detailed surgical methods and functional outcome assessments. We have previously reported the use of a bladder augmentation model in mice to determine the potential of silk fibroin-based scaffolds to mediate tissue regeneration and functional voiding characteristics.11,12 Cystometric analyses of this model have shown that variations in structural and mechanical implant properties can influence the resulting urodynamic features of the tissue engineered bladders11,12. Positive correlations between the degree of matrix-mediated tissue regeneration determined histologically and functional compliance and capacity evaluated by cystometry were demonstrated in this model11,12. These results therefore suggest that functional evaluations of biomaterial configurations in rodent bladder augmentation systems may be a useful format for assessing scaffold properties and establishing in vivo feasibility prior to large animal studies and clinical deployment. In the current study, we will present various surgical stages of bladder augmentation in both mice and rats using silk scaffolds and demonstrate techniques for awake and anesthetized cystometry.

Surgical stages of bladder augmentation are described using 3-D scaffolds in murine and rat models. To test the efficacy of biomaterial configurations for use in bladder augmentation, techniques for both awake and anesthetized cystometry are presented.

各種齧歯類モデルで内圧分析を用いた膀胱補強のためのバイオマテリアルの評価

Renal function and continence of urine are critically dependent on the proper function of the urinary bladder, which stores urine at low pressure and ...

生物工学

The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation

The lower urinary tract (LUT) functions as a dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a convenient time. While storing urine, however, the bladder is exposed for prolonged periods to waste products. By acting as a tight barrier, the epithelial lining of the LUT, the urothelium, avoids re-absorption of harmful substances. Moreover, noxious chemicals stimulate the bladder's nociceptive innervation and initiate voiding contractions that expel the bladder's contents. Interestingly, the bladder's sensitivity to noxious chemicals has been used successfully in clinical practice, by intravesically infusing the TRPV1 agonist capsaicin to treat neurogenic bladder overactivity1. This underscores the advantage of viewing the bladder as a chemosensory organ and prompts for further clinical research. However, ethical issues severely limit the possibilities to perform, in human subjects, the invasive measurements that are necessary to unravel the molecular bases of LUT clinical pharmacology. A way to overcome this limitation is the use of several animal models2. Here we describe the implementation of cystometry in mice and rats, a technique that allows measuring the intravesical pressure in conditions of controlled bladder perfusion.
	After laparotomy, a catheter is implanted in the bladder dome and tunneled subcutaneously to the interscapular region. Then the bladder can be filled at a controlled rate, while the urethra is left free for micturition. During the repetitive cycles of filling and voiding, intravesical pressure can be measured via the implanted catheter. As such, the pressure changes can be quantified and analyzed. Moreover, simultaneous measurement of the voided volume allows distinguishing voiding contractions from non-voiding contractions3.
	Importantly, due to the differences in micturition control between rodents and humans, cystometric measurements in these animals have only limited translational value4. Nevertheless, they are quite instrumental in the study of bladder pathophysiology and pharmacology in experimental pre-clinical settings. Recent research using this technique has revealed the key role of novel molecular players in the mechano- and chemo-sensory properties of the bladder.

Cystometry is an efficient technique to measure bladder function of small animals in vivo. The bladder is continuously infused at rates controlled through an intravesical catheter, whereas the urethra is left free for micturition. This allows for repetitive filling and emptying of the bladder, while intravesical pressure and voided volume are recorded.

小型げっ歯類における膀胱内圧測定の使用：膀胱Chemosensationの研究

	The lower urinary tract (LUT) functions as a  dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a  convenient time. While ...

Contractility Measurements of Human Uterine Smooth Muscle to Aid Drug Development

Discovery and characterization of novel pharmaceutical compounds or biochemical probes rely on robust and physiologically relevant assay systems. We describe methods to measure ex vivo myometrium contractility. This assay can be used to investigate factors and molecules involved in the modulation of myometrial contraction and to determine their excitatory or inhibitory actions, and hence their therapeutic potential in vivo. Biopsies are obtained from women undergoing cesarean section delivery with informed consent. Fine strips of myometrium are dissected, clipped and attached to a force transducer within 1 mL organ baths superfused with physiological saline solution at 37 &#176;C. Strips develop spontaneous contractions within 2&#8211;3 h under set tension and remain stable for many hours (&#62;6 h). Strips can also be stimulated to contract such as by the endogenous hormones, oxytocin and vasopressin, which cause concentration-dependent modulation of contraction frequency, force and duration, to more closely resemble contractions in labor. Hence, the effect of known and novel drug leads can be tested on spontaneous and agonist-induced contractions.
This protocol specifically details how this assay can be used to determine the potency of known and novel agents by measuring their effects on various parameters of human myometrial contraction. We use the oxytocin- and V1a receptor antagonists, atosiban and SR49059 as examples of known compounds which inhibit oxytocin- and vasopressin-induced contractions, and demonstrate how this method can be used to complement and validate pharmacological data obtained from cell-based assays to aid drug development. The effects of novel agonists in comparison to oxytocin and vasopressin can also be characterized. Whilst we use the example of the oxytocin/ vasopressin system, this method can also be used to study other receptors and ion channels that play a role in uterine contraction and relaxation to advance the understanding of human uterine physiology and pathophysiology.

This article describes experimental protocols to study ex vivo contractions of human myometrium and their application in drug discovery. This technique is used to improve the understanding of myometrial physiology and pathophysiology as well as to validate pharmacological data from novel research probes or drug leads.

援助医薬品開発への人間の子宮平滑筋の収縮力測定

Discovery and characterization of novel pharmaceutical compounds or biochemical probes rely on robust and physiologically relevant assay systems. We ...

Ultrasonography of the Adult Male Urinary Tract for Urinary Functional Testing

The incidence of clinical benign prostatic hyperplasia (BPH) and lower urinary tract symptoms (LUTS) is increasing due to the aging population, resulting in a significant economic and quality of life burden. Transgenic and other mouse models have been developed to recreate various aspects of this multifactorial disease; however, methods to accurately quantitate urinary dysfunction and the effectiveness of new therapeutic options are lacking. Here, we describe a method that can be used to measure bladder volume and detrusor wall thickness, urinary velocity, void volume and void duration, and urethral diameter. This would allow for the evaluation of disease progression and treatment efficacy over time. Mice were anesthetized with isoflurane, and the bladder was visualized by ultrasound. For non-contrast imaging, a 3D image was taken of the bladder to calculate volume and evaluate shape; the bladder wall thickness was measured from this image. For contrast-enhanced imaging, a catheter was placed through the dome of the bladder using a 27-gauge needle connected to a syringe by PE50 tubing. A bolus of 0.5 mL of contrast was infused into the bladder until a urination event occurred. Urethral diameter was determined at the point of the Doppler velocity sample window during the first voiding event. Velocity was measured for each subsequent event yielding a flow rate. In conclusion, high frequency ultrasound proved to be an effective method for assessing bladder and urethral measurements during urinary function in mice. This technique may be useful in the assessment of novel therapies for BPH/LUTS in an experimental setting.

We describe the use of high frequency ultrasound with contrast imaging as a method to measure bladder volume, bladder wall thickness, urine velocity, void volume, void duration, and urethral diameter. This strategy can be used to assess voiding dysfunction and treatment efficacy in various mouse models of lower urinary tract dysfunction (LUTD).

尿機能検査のための成人男性尿路の超音波検査

The incidence of clinical benign prostatic hyperplasia (BPH) and lower urinary tract symptoms (LUTS) is increasing due to the aging population, resulting ...

A Decentralized (Ex Vivo) Murine Bladder Model with the Detrusor Muscle Removed for Direct Access to the Suburothelium during Bladder Filling

Previous studies have established the release of chemical substances from flat bladder mucosa sheets affixed in Ussing chambers and exposed to changes in hydrostatic pressure or mechanical stretch and from cultured urothelial cells upon hydrostatic pressure changes, stretch, cell swelling, or drag forces, and in bladder lumen at end of filling. Such findings led to the assumption that these mediators are also released in suburothelium (SubU)/lamina propria (LP) during bladder filling, where they affect cells deep in the bladder wall to ultimately regulate bladder excitability. There are at least two obvious limitations in such studies: 1) none of these approaches provide direct information about the presence of mediators in SubU/LP, and 2) the stimuli used are not physiological and do not recapitulate authentic filling of the bladder. Here, we discuss a procedure that enables direct access to the suburothelial surface of the bladder mucosa in the course of bladder filling. The murine detrusor-free preparation we created closely resembles filling of the intact bladder and allows pressure-volume studies to be performed on the bladder in the absence of confounding signaling from spinal reflexes and detrusor smooth muscle. Using the novel detrusor-free bladder model, we recently demonstrated that intravesical measurements of mediators cannot be used as a proxy to what has been released or present in the SubU/LP during bladder filling. The model enables examination of urothelium-derived signaling molecules that are released, generated by metabolism and/or transported into the SubU/LP during the course of bladder filling to transmit information to neurons and smooth muscle of the bladder and regulate its excitability during continence and micturition.

A Decentralized Ex Vivo Murine Bladder Model with the Detrusor Muscle Removed for Direct Access to the Suburothelium during Bladder Filling

The detrusor-free bladder model enables direct access to the suburothelium to study local mechanisms for regulation of biologically active mediator availability in suburothelium/lamina propria during storage and voiding of urine. The preparation closely resembles filling of an intact bladder and allows pressure-volume studies to be performed without systemic influences.

膀胱充填中にスブロテリウムに直接アクセスするために脱皮筋を除去した分散型(Ex Vivo)マウス膀胱モデル

Previous studies have established the release of chemical substances from flat bladder mucosa sheets affixed in Ussing chambers and exposed to changes in ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

薬理研究に単離された組織のバース·アプリケーションにおける平滑筋機能の測定

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

生物学

In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents

ATP, released from the urothelium in response to bladder distension, is thought to play a significant sensory role in the control of micturition. Therefore, accurate measurement of urothelial ATP release in a physiological setting is an important first step in studying the mechanisms that control purinergic signaling in the urinary bladder. Existing techniques to study mechanically evoked urothelial ATP release utilize cultured cells plated on flexible supports or bladder tissue pinned into Ussing chambers; however, each of these techniques does not fully emulate conditions in the intact bladder. Therefore, an experimental setup was developed to directly measure ATP concentrations in the lumen of the rodent urinary bladder.
In this setup, the bladders of anesthetized rodents are perfused through catheters in both the dome of the bladder and via the external urethral orifice. Pressure in the bladder is increased by capping the urethral catheter while perfusing sterile fluid into the bladder through the dome. Measurement of intravesical pressure is achieved using a pressure transducer attached to the bladder dome catheter, akin to the setup used for cystometry. Once the desired pressure is reached, the urethral catheter's cap is removed, and fluid collected for ATP quantification by luciferin-luciferase assay. Through this experimental setup, the mechanisms controlling both mechanical and chemical stimulation of urothelial ATP release can be interrogated by including various agonists or antagonists into the perfusate or by comparing results between wildtype and genetically modified animals.

In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents

This protocol describes the procedure for measuring ATP concentrations in the lumen of the bladder in an anesthetized rodent.

インビボ げっ歯類における膨満誘発性尿路上皮ATP放出の内腔測定

ATP, released from the urothelium in response to bladder distension, is thought to play a significant sensory role in the control of micturition. ...

Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents

Detrusor smooth muscle (DSM) cells present within the urinary bladder wall ultimately facilitate urine storage and voiding. Preparation of the viable, fresh, and isolated DSM cells presents an important technical challenge whose achievement provides optimal cells for subsequent functional and molecular studies. The method developed and elaborated herein, successfully used by our group for over a decade, describes dissection of human urinary bladder specimens obtained from open bladder surgeries followed by an enzymatic two-step treatment of DSM pieces and mechanical trituration to obtain freshly isolated DSM cells. The initial step involves dissection to separate the DSM layer (also known as muscularis propria) from mucosa (urothelium, lamina propria, and muscularis mucosa) and the adjacent connective, vascular, and adipose tissues present. The DSM is then cut into pieces (2-3 mm x 4-6 mm) in nominal Ca2+-containing dissection/digestion solution (DS). DSM pieces are next transferred to and sequentially treated separately with DS containing papain and collagenase at ~37 &#176;C for 30-45 min per step. Following washes with DS containing enzyme-free bovine serum and trituration with a fire-polished pipette, the pieces release single DSM cells. Freshly isolated DSM cells are ideally suited for patch-clamp electrophysiological and pharmacological characterizations of ion channels. Specifically, we show that the TRPM4 channel blocker 9-phenanthrol reduces voltage-step evoked cation currents recorded with the amphotericin-B perforated patch-clamp approach. DSM cells can also be studied by other techniques such as single cell RT-PCR, microarray analysis, immunocytochemistry, in situ proximity ligation assay, and Ca2+ imaging. The main advantage of utilizing single DSM cells is that the observations made relate directly to single cell characteristics revealed. Studies of freshly isolated human DSM cells have provided important insights characterizing the properties of various ion channels including cation-permeable in the urinary bladder and will continue as a gold standard in elucidating DSM cellular properties and regulatory mechanisms.

We describe a method for preparation of the single freshly isolated detrusor smooth muscle cells from human urinary bladder specimens employing a two-step enzymatic procedure. The obtained viable DSM cells can be studied by various single cell techniques including the described amphotericin-B patch-clamp electrophysiology to reveal physiological and pharmacological properties.

9-フェナントロル感受性カチオン電流の特性評価のための新たに分離されたヒトデトルサトール平滑筋細胞の調製と利用

Detrusor smooth muscle (DSM) cells present within the urinary bladder wall ultimately facilitate urine storage and voiding. Preparation of the viable, ...

下部尿路薬理学を評価するための方法として膀胱平滑筋収縮ストリップ

要約

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マウスの膀胱壁インジェクション

徒手筋力テスト：四肢筋力の測定方法は、危篤状態の患者に適用

各種齧歯類モデルで内圧分析を用いた膀胱補強のためのバイオマテリアルの評価

小型げっ歯類における膀胱内圧測定の使用：膀胱Chemosensationの研究

援助医薬品開発への人間の子宮平滑筋の収縮力測定

尿機能検査のための成人男性尿路の超音波検査

膀胱充填中にスブロテリウムに直接アクセスするために脱皮筋を除去した分散型(Ex Vivo)マウス膀胱モデル

薬理研究に単離された組織のバース·アプリケーションにおける平滑筋機能の測定

インビボげっ歯類における膨満誘発性尿路上皮ATP放出の内腔測定

9-フェナントロル感受性カチオン電流の特性評価のための新たに分離されたヒトデトルサトール平滑筋細胞の調製と利用

下部尿路薬理学を評価するための方法として膀胱平滑筋収縮ストリップ

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インビボ げっ歯類における膨満誘発性尿路上皮ATP放出の内腔測定

9-フェナントロル感受性カチオン電流の特性評価のための新たに分離されたヒトデトルサトール平滑筋細胞の調製と利用

インビボげっ歯類における膨満誘発性尿路上皮ATP放出の内腔測定