この作品は、PDにし、JM低から医師の医療教育研究財団（テネシー大学）賞で持続可能なエネルギー教育研究センター賞（テネシー大）、PDに米国心臓協会賞13SDG14500046によってサポートされていました彼の揺れインキュベーター、卓上遠心、およびウエスタンブロット分析装置の使用のためにエリック·T. Boder（テネシー大学）;、著者らは、フェロプラストに分裂酵母を変換するためのプロトコルのためにキャロラインLeplante（エール大学）に感謝し、センター彼らの超遠心機を使用するための環境バイオテクノロジー（東大テネシー州）、酵母抗体についてのギュンター·ダウム（グラーツ大学技術、オーストリア）;技術支援のための産婦人科（東大テネシー州の医療センター）の職員。

1。 （分裂）酵母細胞から脂肪滴を分離酵母サッカロミセス·セレビシエ 、 出芽人気のモデル生物からの液滴の単離は、以下のプロトコル6とほぼ同じです。調剤の違いに注目している。 1。成長している酵母細胞<ol><li>メディアを準備します。ガラス瓶や培養フラスコ中のdH 2 Oリットル当たりYE5Sの粉末36グラムを兼ね備えています。メディアの約2 Lは必要とされるであろう。 20分間121℃でオートクレーブ媒体。媒体を室温まで冷却させる。 S.のためのcerevisiaeの YPDでYE5Sを交換してください。 </li><li>無菌技術を使用して、250ミリリットルの培養フラスコに冷却YE5Sメディアの10〜20ミリリットル入れます。無菌木の棒または同等を使用した寒天プレートからの酵母細胞の少量のメディアを接種する。細胞は30℃で所望の光学密度まで成長させAでの光学密度を測定する分光光度計を用いて波長595nm。 </li><li> 2.8 Lのフラスコ内に残っ​​ているメディアをセットします。振盪インキュベーター中で細胞増殖の間に適切な混合を確実にするために2.8 Lのフラスコあたり培地1 L以下で使用しない。湿った細胞の最終収率は、プロテオミクスとlipidomic分析のための十分な脂肪滴を取得することができるように約10グラムである必要があります。 </li><li>各ステップ1.1で調製した培地を1リットルた2.8 Lのフラスコにステップ1.2から細胞を紹介する。 </li><li> 30℃で所望の密度まで細胞を増殖させる</li><li>細胞は脂肪滴があることを確認してください。準備金の細胞の1ミリリットル。試料の光学密度（OD）を測定する。サンプルに細胞のODあたりのエタノールにBODIPY 503分の493の100 mMストックの0.1ミリリットルを追加します。ガラススライドとカバーガラスの間にサンプルを3μLを配置します。 GFPフィルター（ 図1A）と蛍光顕微鏡下で可視化する。 </li><li> 4＆＃でステップ1.5から細胞をペレット化176、C 10分間3800×gで。遠心管の容量に応じて、バッチで動作します。 </li><li> YE5Sメディアを捨て、ソルビトール、EMM + 600 mMの緩衝液で細胞を洗浄。ソルビトールは、浸透サポートを提供します。 </li><li>無菌の50ml遠心チューブに細胞を移し、10分間、2,000×gで4℃で細胞をペレット化。上清を取り除きます。湿潤細胞を秤量する。細胞1グラムあたり（EMM + 600mMのソルビトール）緩衝液2mlで細胞を再懸濁する。 </li></ol> 2。スフェロとその後の溶解に分裂酵母細胞への変換<ol><li> ）酵母溶解酵素を5 mgの1をそれぞれ追加し、2）酵母トリコデルマハルジアナムあたりのグラムステップ1.9で計量した湿った細胞の由来の酵素を溶解する。 S.のためのセレビシエはザイモリアーゼ同量のこれらの酵素を増強する。 </li><li> 60分間、100rpmで穏やかに振とう下、30℃で細胞をインキュベートする。 </li><li>スフェロ脂質DRを持っていることを確認してくださいoplets。ステップ1.6（ 図1B）を繰り返すことにより。 </li></ol> 3。密度勾配遠心<ol><li> 5分間、2,000×gで4℃で遠心分離することにより、スフェロプラストをペレット化。 </li><li>慎重にプラスチック製のトランスファーピペットを用いて上清を除去します。 </li><li>優しくソルビトールの氷冷10mMトリス-HCl、600 mmのペレット状のスフェロプラストを再懸濁し、200μMのEDTA。スフェロは非常に脆弱であることに留意してください。 </li><li>ステップ3.1と同じ設定を使用して、もう一度フェロプラストをペレット化。慎重に上清を除去し、2ミリリットル/ G-細胞の濃度で12％のFicoll、10 mMトリス-HCl、および200μMのEDTA中のプラスチックトランスファーピペットを使用してスフェロ再懸濁します。 </li><li>ガラスホモジナイザーに再懸濁フェロプラストを移し、ゆっくりとガラスホモジナイザーのゆったり乳棒を用いて、氷の上で、20〜30ストロークを均質化する。 </li><li>遠心管に溶解したスフェロプラストを転送し、同じVOオーバーレイ12％フィコール、10mMトリス-HCl、および200μMEDTA緩衝液LUME。各チューブは、約3分の2杯になるように使用する遠心管の数を選択してください。 </li><li> SW28ローターまたは同等の中で1.5時間、100,000×gで4℃で遠心します。ストップ（ローター減速= 0）に海岸にローターを許可します。 </li><li>優しくピペッターまたは曲がっパスツールピペットのいずれかを使用して、新しい遠心管（複数可）に、液滴を含む最白浮き層（ 図2A）、転送します。それは大まかに遠心管の3分の1を満たすように、試料に12％の十分な容量のFicollを追加し、10 mMトリス-HCl、および200μMのEDTA緩衝液。 </li><li>新しい遠心管（S）のサンプル（S）の先頭に8％のFicoll相当ボリュームを追加し、10 mMトリス-HCl、および200μMのEDTA緩衝液。この添加後、チューブをバッファフルの三分の二程度にする必要があります。 </li><li> SW28ローターまたは同等の中で1時間、100,000×gで4℃で遠心します。 R（停止するまで惰性ローターを許可するotor減速= 0）。 </li><li>優しくピペッターまたは曲がっパスツールピペットのいずれかを使用して、新しい遠心管（複数可）に、液滴を含むことになるトップ浮遊白層（ 図2B）を 、転送します。それは遠心管の約3分の1を満たすように600mMのソルビトールを追加し、8％フィコール、10mMトリス-HCl、試料200μMEDTA緩衝液。 </li><li>新しい遠心管（S）のサンプル（S）のトップにソルビトール250 mMと同等のボリュームを追加し、10 mMトリス-HCl、および200μMのEDTA緩衝液。この添加後、チューブをバッファフルの三分の二程度にする必要があります。 </li><li> SW28ローターまたは同等の中で1時間、100,000×gで4℃で遠心します。ストップ（ローター減速= 0）に海岸にローターを許可します。 </li><li>透析管に、唯一の脂質小滴と結合したタンパク質を含有し、そしてフィコールを排除するために10mMトリス-HCl及び200μMEDTA緩衝液中にO / Nを透析する必要があり頂白色層（ 図2C）を転送する。 </li></ol><pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 2。ヒト胎盤絨毛細胞から脂肪滴を分離胎盤は、シングルトン妊娠前任期で自然分娩の発症に選択的帝王切開の配信を受けている健康な女性から採取した。被験者は、自分の胎盤を収集するための書面によるインフォームドコンセントを与えた。胎盤の収集、およびその後の使用は、テネシー大学からの承認を得て行われ、ノックス治験審査委員会の医学のテネシー大学大学院（＃の8757Bと＃3338、それぞれ）した。 1。ヒト胎盤絨毛細胞を単離するプロトコルの第1部では、ペトロフらの以前公開されたプロトコルの変形である。26 次の解決策を準備します。 <ul><li> NaCl水溶液（1 L）：1 Lの溶液を得たのdH 2 O 9のNaCl（M 58.4グラム/モル）を溶解する。濾過滅菌（0.2;の膜）。 </li><li> 10倍ハンクス液（10×HBSS）（1 L）：4のKCl（M 74.5グラム/モル）、0.6グラムのKH 2 PO 4（M 136.086グラム/モル）、80グラムのNaCl（M 58.44グラム/モル）; 10gのD-グルコース（M 180.16グラム/モル）、2 HPO 4（M 141.96グラム/モル）のNa。 1 Lの溶液を得たのdH 2 O中の成分の各々を溶解する。濾過滅菌（0.2μmの膜）。 </li><li>酵素消化緩衝液（0.6ミリリットル）：3.3ミリリットル、7.5％のNaビスカーボネート、17.5ミリリットルの1MのHEPES、及び266.1ミリリットルのdH 2 Oで70ミリリットル10倍のHBSSを組み合わせ、濾過滅菌（0.2μm膜）。 4℃で保存する</li><li> DNアーゼ私は：使用直前に、DNA分解酵素のバイアルに5ミリリットルの無菌の0.9％NaClを追加します。 -20℃での使用·保管まで氷上に保つ</li></ul><ol><li>解剖の準備胎盤<ol><li>できるだけ配達時に近いヒト胎盤およびプロセスを取得します。このような胎盤を輸送する冷却器として密封容器を使用してください。とき手は、常に十分注意してください玲人間の生体物質。 </li><li>生物学的安全フード、滅菌オートクレーブ容器に胎盤を転送し、慎重に無菌の0.9％NaCl（生理食塩水）溶液を用いて、胎盤および膜から血を洗う。液体生物学的廃棄物として1リットルのビーカーに血まみれの生理食塩水を捨てる。 </li><li>滑らかな表面を上に向け臍帯を保有して、無菌領域に胎盤を置きます。シャープ、ファインポイントハサミとピンセットで胎児の膜および臍帯を削除します。 </li><li>母体の表面（粗面）が上を向いているように、胎盤を裏返し。上層基板組織、表面から約3ミリメートルを削除します。 </li></ol></li><li>胎盤を解剖<ol><li>絨毛膜板を避けて一度に1子葉を解剖。生理食塩水250ミリリットルビーカーに絨毛組織を収集しています。 </li><li>液体廃棄物の1リットルのビーカーを使用して、ピンセットで回転させることによって、0.9％NaClを別のビーカー内の組織数回すすいでください。 </li><li> 150ミリメートルペトリ皿に一度に1子葉を転送します。ピンセットで保持し、シャーレ上の血管からかみそりの刃で組織をこすり。 0.9％NaClを含む別のビーカー中に掻き組織を置きます。すべての組織片について、この手順を繰り返します。 </li><li>細胞解離ふるいに組織の一部を転送し、溶出液が透明になるまで徹底的に0.9％NaClですすいでください。全ての組織に対して、この手順を繰り返します。 </li><li>細胞解離ふるいに掻き組織をすすいだ後、余分な液体と重さ、それを排出します。 この時点で、組織は、O / N DMEM中で4℃で無菌三角フラスコ内に格納することができる。 </li></ol></li><li>胎盤組織の酵素消化<ol><li>あらかじめ温めておいた酵素希釈緩衝液100ml、1ミリリットルのDNase Iと20ミリリットル2.5％10Xトリプシン：組織消化液を調製する。 </li><li> 500ミリリットルの滅菌三角フラスコに総採取した組織（通常は約250〜300グラム）から60グラムを転送する、組織を分割する。 </li><l私は&gt;組織を含む三角フラスコに組織消化物を追加し、150 rpmで45分間シェーカーで37℃でインキュベートする。 </li></ol></li><li>解離した細胞を回収する<ol><li>組織が安定するまで最初の45分解離した後、傾斜で消化フラスコを設定します。 </li><li>未解離組織を収集しないように注意しながら、上清を集める。回収した上清に、HBSSを同量を追加し、滅菌15mL遠心管に移す。解離していない組織の追加部分については、解離していない組織とステップ3.2から始まる手順を繰り返してください。 </li><li>遠心分離機で15分間、1,000×gで4℃でホモジネート。 </li><li>各バッチには、遠心分離後、ペレットを乱すことなく、上清を吸引除去する。胎盤絨毛細胞は赤血球の上にある、ペレットの白い部分に主にある。 </li><li> STに絨毛細胞（ペレットの白い部分）を転送erile 50ミリリットルコニカル遠心管、氷上に保つ。 </li><li> 3つ全ての消化段階から細胞を収集した後、滅菌50mlコニカル遠心管の最上部に挿入さ100μmナイロン細胞ストレーナーを用いて懸濁液を濾過する。細胞懸濁液の濾過が遅くなる場合は、チューブ内に真空を引くために、フィルタを上に持ち上げる。 </li><li> 10分間1,000×gで4℃で遠心。慎重にペレットを乱すことなく、上清を除去します。 </li></ol></li></ol> 2。胎盤絨毛細胞をホモジナイズ<ol><li>分離プロセスを開始する前に、20mMのトリス-HCl、pH7.4および1mMのEDTAを含有する低張溶解培地（HLM）を50mlを調製する。使用直前に、HLMにプロテアーゼ阻害剤を添加し、氷上でメディアを保持します。 </li><li>生物学的安全フード内で、細胞への氷冷HLMの4倍の細胞ペレットの量を追加します。やさしく、徹底的に細胞をピペッティングして細胞を再懸濁アップANを10mlピペットを用いてdをダウン。 </li><li> 10分間氷上に懸濁した細胞をインキュベートします。 </li><li>氷の上でなければなりませんダウンスホモジナイザーに細胞を移す。ゆっくりホモジナイザーのゆったりした乳棒で20〜25穏やかなストロークを適用することにより、細胞を均質化する。 </li><li>遠心未破壊細胞、核および細胞破片を除去するために10分間3,000×gで4℃で細胞溶解物。 </li><li>上清を回収し、（25,000×gで遠心分離することができるまたは代替）SW28チューブに移す。ミトコンドリアを除去するために20分間25000×gで4℃で遠心します。 </li></ol> 3。超遠心分離によって脂質小滴を単離する<ol><li> 100mMの炭酸ナトリウム（M 106グラム/モル）緩衝液（pH 11.5）および60％スクロース（w / w）の溶液50mlを50mlを調製する。使用直前に炭酸ナトリウム緩衝液にプロテアーゼ阻害剤を添加し、氷上に保つ。 </li><li> 50ミリリットル遠心管にステップ2.6から上清を回収し、調整SW28ローター、または同等のための超遠心管の底部へのスクロースおよび転写の20％。 〜氷冷100mMの炭酸ナトリウム緩衝液（pH 11.5）を10mlのチューブに充填するために、氷冷HLM 0.5〜1 mlの密度に調整オーバーレイ上清。 </li><li> SW28スイングバケットローターを使用して45分間13万×gで4℃で遠心します。ストップ（ローター減速= 0）に海岸にローターを許可します。 </li><li>浮遊層を集め、10％ショ糖に調整し、SW41Tiローター用13.2ミリリットル超遠心管の底部、または同等に移す。オーバーレイ密度約5mlの氷冷100mMの炭酸ナトリウム緩衝液（pH 11.5）を、0.5mlの氷冷HLMの上清を用いて調整した。 </li><li> SW41Tiスイングバケットローターを用いて60分間274,000×gで4℃で遠心します。脂肪滴層の破壊を最小限にするために、停止（ロータ減速= 0）に海岸にローターを許可します。 </li><li>慎重に含む最浮動層（ 図2D）を収集1ミリリットルピペットを繰り返しステップ3.4に脂肪滴。 </li><li> SW41Tiスイングバケットローターを用いて30分間274,000×gで4℃で遠心します。ストップ（ローター減速= 0）に海岸にローターを許可します。 </li><li>慎重に100μlのHLMを含む3 1.5mlチューブに曲げたパスツールピペットで脂肪滴を含むトップ白色浮動層を収集します。 </li></ol> 特徴付ける脂質滴画分（プロトコール1及び2） 脂肪滴画分の回収および純度は、光又は電子顕微鏡と組み合わせてウエスタンブロットによって検証することができる。さらに、異なる遠心分離工程後のアリコートを収集することができ、浄化効率を決定するために保持される。ウェスタンブロッティングでは、tは上に他の膜画分に脂肪滴を比較するよりも、全細胞溶解物の当量を表し、脂肪滴の体積分率を比較することがより適切である総タンパク質含有量24の彼が根拠。

<ol>
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L., Tauchi-Sato, K., Hatano, N., Taniguchi, H., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab18+localizes+to+lipid+droplets+and+induces+their+close+apposition+to+the+endoplasmic+reticulum-derived+membrane.">Rab18 localizes to lipid droplets and induces their close apposition to the endoplasmic reticulum-derived membrane.</a> J. Cell Sci. 118, 2601-2611 (2005).</li><li>Yang, H. Y., Galea, A., Sytnyk, V., Crossley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+size+of+lipid+droplets:+lipid+and+protein+factors.">Controlling the size of lipid droplets: lipid and protein factors.</a> Curr. Opin. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+distribution+of+mitochondria+and+lipid+droplets+in+human+muscle+fibres.">Network distribution of mitochondria and lipid droplets in human muscle fibres.</a> Histochem. Cell Biol. 129, 65-72 (2008).</li><li>Goodman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gregarious+lipid+droplet.">The gregarious lipid droplet.</a> J. Biol. Chem. 283, 28005-28009 (2008).</li><li>Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+of+fat:+an+evolving+model+of+lipid+droplet+assembly+and+expansion.">Packaging of fat: an evolving model of lipid droplet assembly and expansion.</a> J. Biol. Chem. 287, 2273-2279 (2012).</li></ol>

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

<html> このプロトコルの中の重要なステップ 培養細胞の成長中のメディアと細胞密度と一致していることを確認します。細胞の脂質滴はそれらに関連するタンパク質は、細胞が17培養された環境に大きく依存している点で独特である。したがって、細胞が成長する培地と細胞の密度は、密接に溶解する前に監視されるべきである。 <p cl...

細胞の脂質滴は、細胞内で複数の機能を果たす動的小器官である。それらはエネルギーに変換またはリン脂質合成のために使用することができる中性脂質の貯蔵のハブである。液滴は、アテローム性動脈硬化症、肥満症および関連する代謝疾患を含む生理学的および病理学的状態において中心的役割を果たし、また、感染症1,2。さらに、それらは、バイオディーゼル燃料のための魅力的な供給源である。 脂肪滴の細胞の役割に関する多くの情報は、幅広い生物3から精製された液滴のプロテオミクスおよびlipidomic分析から得られている。これらの生物は、細菌4,5、酵母6-11含ま12,13植物、14を線虫、そして15,16飛ぶました。ヒトの代謝性疾患における脂肪滴の役割への関心を考慮すると、液滴はまた、培養動物細胞であり、aから単離されているニマル組織。培養細胞株は、3T3-L1脂肪細胞17、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞K2 18、ヒトhepatocyes 19,20、および上皮細胞系21が含まれている。液滴が単離されたから動物組織は、マウス骨格筋22、肝臓23、及び乳腺23が含まれている。上述したように、ほとんどの液滴の分離の研究の目標は、中性およびリン脂質に結合した因子およびlipidomic分析プロテオーム解析を実行することである。 中性脂質以来 - 脂質滴の最も多い成分は - ほとんどの他の細胞材料よりも緻密であり、液滴の分離は、従来、密度勾配遠心分離を用いて行われた。その手法は、ここで紹介するの両方プレップの目玉です。従来の技術は、培養6,24分裂酵母細胞からの液滴の分離を視覚的に結合され、変更されたおよび胎盤組織から得られたヒト細胞をnoncultured。目標は、液滴分離のための出発点に、2つの非常に異なる細胞型を選択することによって、この技術の広い適用可能性を示すことである。この手法は、ほとんどの生物からの液滴を分離したい方のために有用であるはずである。 プロトコル1は、真核細胞分裂の間に25滴形成を観察するためのモデルとして使用されてきた分裂酵母、 シゾサッカロミセス·ポンベから脂質滴の単離が記載されている。出芽酵母サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）は、脂質滴生物学を研究するためのモデル生物として広く使用されている。プロトコル1は、生物や強調されている準備の違いの両方に適用可能である。 プロトコル2は、ヒト満期胎盤から得た順にある胎盤絨毛細胞から脂肪滴の単離を記載している。ザ·満期胎盤のコレクションは、安全かつ倫理的に脂肪滴のかなりの数が含まれ、容易に入手可能なヒト組織26、200〜250を得するユニークな機会を提供します。これは、液滴が培養された細胞に由来高等真核生物における最も脂肪滴分離作業とは対照的である。これらの研究では、脂肪酸は、多くの場合、中性脂質の合成、従って、液滴の成長を促進する培養物に添加される。これは、脂質滴を、胎盤組織中の天然の条件下で形成される、ここでの作業とは対照的である。 脂肪滴の画分の純度は、細胞小器官マーカー抗体を用いたウェスタンブロット分析によって決定される。これら2つのプロトコルが、後続のプロテオームとlipidomic分析するのに適した脂肪滴画分が得られる。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Protocol 1&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;1. Growing yeast cells and converting to spheroplasts&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Edinburgh Minimal Media (EMM)</td><td>Sunrise Science Products</td><td>2005</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract with 5 supplements (YE5S)</td><td>Sunrise Science Products</td><td>2011</td><td>YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD.</td></tr><tr><td>YPD powder</td><td>Sunrise Science Products</td><td>1875</td><td>For &lt;i&gt;S. cerevisiae&lt;/i&gt;</td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP439</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Lytic Enzyme</td><td>MP Biomedicals</td><td>215352610</td><td></td></tr><tr><td>Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1412</td><td></td></tr><tr><td>Zymolayse-20T</td><td>Sunrise Science Products</td><td>N0766391</td><td>For &lt;i&gt;S. cerevisiae&lt;/i&gt;</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>Invitrogen</td><td>D-3922</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Plastic transfer pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>137115AM</td><td></td></tr><tr><td>1 L glass bottle</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml flask</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.8 L flasks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. Yeast lipid droplet isolation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP525</td><td></td></tr><tr><td>12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane</td><td>SpectrumLabs</td><td>132680</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td>irritant</td></tr><tr><td>Dounce Homogenizer&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9938</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Tubes 25 mm x 89 mm (for SW28)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>355642</td><td></td></tr><tr><td>12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane</td><td>SpectrumLabs</td><td>132680</td><td></td></tr><tr><td>Temperature-controlled shaker</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>C25KC</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge</td><td>Thermo-Scientific</td><td>75004521</td><td></td></tr><tr><td>Swinging Bucket Centrifuge Rotor</td><td>Thermo-Scientific</td><td>75003607</td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle Rotor</td><td>Thermo-Scientific</td><td>75003698</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge LB-M</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW28 Ultracentrifuge Rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342204</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Protocol 2&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;1. Placental villous cells isolation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable underpads</td><td>Fisher Scientific</td><td>23666062</td><td></td></tr><tr><td>Autoclavable pan (container), 3 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>1336110</td><td></td></tr><tr><td>Fine scissors, sharp-sharp, straight</td><td>Fine Science Tools</td><td>1406011</td><td></td></tr><tr><td>London Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>1108002</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7b Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>1127020</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Fisher Scientific</td><td>S65921</td><td></td></tr><tr><td>Screen cup for CD-1</td><td>Fisher Scientific</td><td>S1145</td><td></td></tr><tr><td>40 mesh screen&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S0770</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand cell stainers 100 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>150 mm Petri Dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9054771</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S642</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P333</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P386</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Trypsin 10x</td><td>Invitrogen</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>DNase I grade II, from bovine pancreas</td><td>Roche Applied Science</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>500 ml Erlenmeyer flasks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml Beakers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml Centrifuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml Serological pipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Centrifuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. Lipid droplets isolation from villous placental cells&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120</td><td></td></tr><tr><td>D-Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Carbonate&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP357</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td>irritant</td></tr><tr><td>Dounce homogenizer&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9938</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tubes 25 mm x 89 mm (for SW28)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>355642</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear centrifuge tubes 14 mm x 89 mm (for SW41)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Disposable borosilicate glass Pasteur pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820C</td><td></td></tr><tr><td>Biological safety hood&amp;nbsp;</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperature-controlled shaker</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>C25KC</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge</td><td>Thermo-Scientific</td><td>75004521</td><td></td></tr><tr><td>Swinging Bucket Centrifuge Rotor</td><td>Thermo-Scientific</td><td>75003607</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge LB-M</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW28 Ultracentrifuge Rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342204</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Ti Ultracentrifuge Rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Western blot&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-68071</td><td>dilution 1:15,000</td></tr><tr><td>IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-32210</td><td>dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 12% Bis-Tris gels</td><td>Invitrogen</td><td>NP0341</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Primary antibodies for Protocol 1&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erg6p</td><td>gift from Dr. G. Daum</td><td>Graz University of Technology, Austria</td><td>dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>Dpm1p</td><td>Abcam</td><td>ab113686</td><td>4 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Por1p</td><td>gift from Dr. G. Daum</td><td>Graz University of Technology, Austria</td><td>dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>Pma1p</td><td>gift from Dr. G. Daum</td><td>Graz University of Technology, Austria</td><td>dilution 1:10,000</td></tr><tr><td>Vma1p (anti-ATP6V1A)</td><td>Abcam</td><td>ab113745</td><td>0.5 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Primary antibodies for Protocol 2&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perilipin 2 (anti-ADFP)</td><td>Abcam</td><td>ab52355</td><td>2 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Calnexin</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2679</td><td>dilution 1:1,000</td></tr><tr><td>GM130</td><td>Biorbyt</td><td>orb40533</td><td>dilution 1:25</td></tr><tr><td>COX IV</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4850</td><td>dilution 1:1,000</td></tr><tr><td>MEK1</td><td>Biorbyt</td><td>orb38775</td><td>dilution 1:50</td></tr></tbody></table>

isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas

脂肪滴は、ほとんどの真核および特定の原核細胞で見つけることができる動的な細胞小器官である。構造的には、液滴は、リン脂質単分子膜に囲まれた中性脂質のコアで構成されています。液滴の細胞の役割を決定する際に最も有用な技術の1つは、液滴と共に単離することができ、結合したタンパク質のプロテオーム同定されている。分裂酵母とヒト胎盤絨毛細胞：ここでは、二つの方法が2幅広い真核生物からの脂肪滴とその結合したタンパク質を分離するために記述されている。両方の技術は、違いがありますが、mainメソッド - 密度勾配遠心分離を - 両方の製剤で共有されている。これは、提示された液滴分離技術の広い適用可能性を示している。 第一のプロトコルにおいて、酵母細胞は、その細胞壁の酵素消化によって、スフェロプラストに変換される。結果としてフェロプラストはその後紳士ですLYゆったりホモジナイザーで溶解。フィコール密度勾配を提供するために、溶解物に添加し、そして混合物を3回遠心分離する。第一のスピンの後、脂質滴は、小胞体（ER）、原形質膜、および液胞と共に遠心分離管の白色フローティング層に局在している。二つの連続スピンはこれらの他の3小器官を除去するために使用される。結果は滴と結合したタンパク質を持っている層である。 第二のプロトコルでは、胎盤絨毛細胞は、細胞がゆったりホモジナイザーでホモジナイズするトリプシンで酵素消化によりヒト満期胎盤から単離され、DNA分解酵素Iをされています。低速·中速遠心分離工程は、未破壊細胞、細胞破片、核、ミトコンドリアを除去するために使用される。スクロース密度勾配を提供するために、ホモジネートに添加し、混合物を他の蜂巣から脂質滴を分離するために遠心分離されるR画。 両方のプロトコルにおける脂肪滴の純度は、ウェスタンブロット分析によって確認される。両方の調製物からの液滴画分は、その後のプロテオームとlipidomic分析に適している。

期待通りに密度勾配遠心分離が働いていた場合、浮動層が脂肪滴が含まれている必要があり、高速スピンの進行を通じて、他の細胞小器官が枯渇する。 プロトコル1は、ウェスタンブロット、マーカー脂肪滴（Erg6p）に対する抗体、および酵母、ER（Dpm1p）、ミトコンドリア（Por1p）中の脂質滴と相互作用することが見出されている細胞小器官を用いて行った、原形質膜（Pm...

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Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

1つの細胞の脂質滴を単離するための技術）は、酵母細胞および2）ヒト胎盤が提示される。両方の手順は、液滴の中心を含有する得られた浮遊層が容易に、眼によって視覚化抽出し、純度についてウェスタンブロット分析によって定量化することができる密度勾配遠心分離である。

細胞の脂質滴の分離：酵母細胞とヒト胎盤から2精製技術

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

isolation-cellular-lipid-droplets-two-purification-techniques

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.6K ビュー.  University of Tennessee.  1つの細胞の脂質滴を単離するための技術）は、酵母細胞および2）ヒト胎盤が提示される。両方の手順は、液滴の中心を含有する得られた浮遊層が容易に、眼によって視覚化抽出し、純度についてウェスタンブロット分析によって定量化することができる密度勾配遠心分離である。 

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Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most interestingly, sRNAs are also found outside of cells and are stably present in all biological fluids. As such, extracellular sRNAs represent a novel class of disease biomarkers and are likely involved in cell signaling and intercellular communication networks. To assess their potential as biomarkers, sRNAs can be quantified in plasma, urine, and other fluids. Nevertheless, to fully understand the impact of extracellular sRNAs as endocrine signals, it is important to determine which carriers are transporting and protecting them in biological fluids (e.g., plasma), which cells and tissues contribute to extracellular sRNA pools, and cells and tissues capable of accepting and utilizing extracellular sRNA. To accomplish these goals, it is critical to isolate highly pure populations of extracellular carriers for sRNA profiling and quantification. We have previously demonstrated that lipoproteins, particularly high-density lipoproteins (HDL), transport functional microRNAs (miRNA) between cells and HDL-miRNAs are significantly altered in disease. Here, we detail a new protocol that utilizes tandem HDL isolation with density-gradient ultracentrifugation (DGUC) and fast-protein-liquid chromatography (FPLC) to obtain highly pure HDL for downstream profiling and quantification of all sRNAs, including miRNAs, using both high-throughput sequencing and real-time PCR approaches. This protocol will be a valuable resource for the investigation of sRNAs on HDL.

This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.

非コード小型RNA定量化のための高密度リポタンパク質の単離

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

生化学

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of virion morphogenesis. Quantitative lipid droplet proteome analysis can be used to identify proteins that localize to or are displaced from lipid droplets under conditions such as virus infections. Here, we describe a protocol that has been successfully used to characterize the changes in the lipid droplet proteome following infection with HCV. We use Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Culture (SILAC) and thus label the complete proteome of one population of cells with &#34;heavy&#34; amino acids to quantitate the proteins by mass spectrometry. For lipid droplet isolation, the two cell populations (i.e.&#160;HCV-infected/&#34;light&#34; amino acids and uninfected control/&#34;heavy&#34; amino acids) are mixed 1:1 and lysed mechanically in hypotonic buffer. After removing the nuclei and cell debris by low speed centrifugation, lipid droplet-associated proteins are enriched by two subsequent ultracentrifugation steps followed by three washing steps in isotonic buffer. The purity of the lipid droplet fractions is analyzed by western blotting with antibodies recognizing different subcellular compartments. Lipid droplet-associated proteins are then separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Coomassie staining. After tryptic digest, the peptides are quantified by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Using this method, we identified proteins recruited to lipid droplets upon HCV infection that might represent pro- or antiviral host factors. Our method can be applied to a variety of different cells and culture conditions, such as infection with pathogens, environmental stress, or drug treatment.

Lipid droplets are important organelles for the replication of several pathogens, including the Hepatitis C Virus (HCV). We describe a method to isolate lipid droplets for quantitative mass spectrometry of associated proteins; it can be used under a variety of conditions, such as virus infection, environmental stress, or drug treatment.

定量的質量分析のための脂肪滴の分離

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of biological membranes, energy storage and production, cellular signaling, vesicular transport of proteins, organelle biogenesis, and regulated cell death. Because the budding yeast Saccharomyces cerevisiae is a unicellular eukaryote amenable to thorough molecular analyses, its use as a model organism helped uncover mechanisms linking lipid metabolism and intracellular transport to complex biological processes within eukaryotic cells. The availability of a versatile analytical method for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of major classes of lipids within a yeast cell is crucial for getting deep insights into these mechanisms. Here we present a protocol to use liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for the quantitative analysis of major cellular lipids of S. cerevisiae. The LC-MS/MS method described is versatile and robust. It enables the identification and quantification of numerous species (including different isobaric or isomeric forms) within each of the 10 lipid classes. This method is sensitive and allows identification and quantitation of some lipid species at concentrations as low as 0.2 pmol/&#181;L. The method has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. The use of alternative mobile phase additives for electrospray ionization mass spectrometry in this method can increase the efficiency of ionization for some lipid species and can be therefore used to improve their identification and quantitation.

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

We present a protocol using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry to identify and quantify major cellular lipids in Saccharomyces cerevisiae. The described method for a quantitative assessment of major lipid classes within a yeast cell is versatile, robust, and sensitive.

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッカロミセス・セレビシエ細胞リピドームの定量的解析

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Isolation and Processing of Murine White Adipocytes for Transcriptome and Epigenome Analyses

Obesity is a complex disease influenced by genetics, epigenetics, the environment, and their interactions. Mature adipocytes represent the major cell type in white adipose tissue. Understanding how adipocytes function and respond to (epi)genetic and environmental signals is essential for identifying the cause(s) of obesity. RNA and chromatin have previously been isolated from adipocytes using enzymatic digestion. In addition, protocols have been developed for nuclear isolation, where purification is achieved by fluorescence-activated cell sorting (FACS) of adipocyte-specific transgenic reporters. One of the greatest challenges to achieving high yield and quality during such protocols is the substantial amount of lipid contained in adipose tissue. The present protocol describes an optimized procedure for isolating mature adipocytes that leverages heptane to separate lipids from the targets of interest (RNA/chromatin). The resulting RNA has high integrity and generates high-quality RNA-seq results. Likewise, the procedure improves nuclei yield rate and generates reproducible ChIP-seq results across samples. Therefore, the current study provides a reliable and universal murine adipocyte isolation protocol suitable for whole-genome transcriptome and epigenome studies.

The present protocol summarizes a universal method for isolating, purifying, and upstream processing of murine white adipocytes optimized for downstream total RNA sequencing, Nuclei Extraction by SONication (NEXSON), and ChIP-seq.

Obesity is a complex disease influenced by genetics, epigenetics, the environment, and their interactions. Mature adipocytes represent the major cell type ...

遺伝学

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and very simple lipidome, is a valuable model for studying biological functions of various lipid species in multicellular eukaryotes2,3,5. S. cerevisiae has 10 major classes of lipids with chain lengths mainly of 16 or 18 carbon atoms and either zero or one degree of unsaturation6,7. Existing methods for lipid identification and quantification - such as high performance liquid chromatography, thin-layer chromatography, fluorescence microscopy, and gas chromatography followed by MS - are well established but have low sensitivity, insufficiently separate various molecular forms of lipids, require lipid derivitization prior to analysis, or can be quite time consuming. Here we present a detailed description of our experimental approach to solve these inherent limitations by using survey-scan ESI/MS for the identification and quantification of the entire complement of lipids in yeast cells. The described method does not require chromatographic separation of complex lipid mixtures recovered from yeast cells, thereby greatly accelerating the process of data acquisition. This method enables lipid identification and quantification at the concentrations as low as g/ml and has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. Lipids extraction from whole yeast cells for using this method of lipid analysis takes two to three hours. It takes only five to ten minutes to run each sample of extracted and dried lipids on a Q-TOF mass spectrometer equipped with a nano-electrospray source.

We describe a new quantitative lipidomics method for identifying numerous lipid species in yeast using survey-scan electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS). This method exceeds currently available methods for lipid identification and quantification in the ability to resolve various molecular forms of lipids, sensitivity, and speed.

エレクトロスプレーイオン化質量分析法を用いて酵母Lipidomeの定量評価

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

生物学

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de novo&#160;from acetyl-CoA and are primarily present in eukaryotes in the form of triglycerides (TGs) and sterol-esters (SEs). The enzymes responsible for the synthesis of NLs are highly conserved from Saccharomyces cerevisiae (yeast) to humans, making yeast a useful model organism to dissect the function and regulation of NL metabolism enzymes. While much is known about how acetyl-CoA is converted into a diverse set of NL species, mechanisms for regulating NL metabolism enzymes, and how mis-regulation can contribute to cellular pathologies, are still being discovered. Numerous methods for the isolation and characterization of NL species have been developed and used over decades of research; however, a quantitative and simple protocol for the comprehensive characterization of major NL species has not been discussed. Here, a simple and adaptable method to quantify the de novo&#160;synthesis of major NL species in yeast is presented. We apply 14C-acetic acid metabolic labeling coupled with thin layer chromatography to separate and quantify a diverse range of physiologically important NLs. Additionally, this method can be easily applied to study in vivo reaction rates of NL enzymes or degradation of NL species over time.

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Here, a protocol is presented for the metabolic labeling of yeast with 14C-acetic acid, which is coupled with thin layer chromatography for the separation of neutral lipids.

代謝標識と薄層クロマトグラフィーによる サッカロミセス・セレビシエ における中性脂質合成の解析

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are used as models in lipid metabolic research or for industrial lipid production. Lipid droplets are highly dynamic storage bodies and their cellular content represents a convenient readout of the lipid metabolic state. Fluorescence microscopy is a method of choice for quantitative analysis of cellular lipid droplets, as it relies on widely available equipment and allows analysis of individual lipid droplets. Furthermore, microscopic image analysis can be automated, greatly increasing overall analysis throughput. Here, we describe an experimental and analytical workflow for automated detection and quantitative description of individual lipid droplets in three different model yeast species: the fission yeasts Schizosaccharomyces pombe and Schizosaccharomyces japonicus, and the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Lipid droplets are visualized with BODIPY 493/503, and cell-impermeable fluorescent dextran is added to the culture media to help identify cell boundaries. Cells are subjected to 3D epifluorescence microscopy in green and blue channels and the resulting z-stack images are processed automatically by a MATLAB pipeline. The procedure outputs rich quantitative data on cellular lipid droplet content and individual lipid droplet characteristics in a tabular format suitable for downstream analyses in major spreadsheet or statistical packages. We provide example analyses of lipid droplet content under various conditions that affect cellular lipid metabolism.

Here, we present a MATLAB implementation of automated detection and quantitative description of lipid droplets in fluorescence microscopy images of fission and budding yeast cells.

自動画像処理による核分裂および発芽酵母における脂質液滴含有量の解析

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

免疫・感染学

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral lipids encased by a monolayer of phospholipids and proteins. Hepatic LD lipids, such as ceramides, and proteins are implicated in several diseases that cause hepatic steatosis. Although previous methods have been established for LD isolation, they require a time-consuming preparation of reagents and are not designed for the isolation of multiple subcellular compartments. We sought to establish a new protocol to enable the isolation of LDs, endoplasmic reticulum (ER), and lysosomes from a single mouse liver.
Further, all reagents used in the protocol presented here are commercially available and require minimal reagent preparation without sacrificing LD purity. Here we present data comparing this new protocol to a standard sucrose gradient protocol, demonstrating comparable purity, morphology, and yield. Additionally, we can isolate ER and lysosomes using the same sample, providing detailed insight into the formation and intracellular flux of lipids and their associated proteins.

This protocol establishes a novel method of lipid droplet isolation and purification from mouse livers, using a well-established endoplasmic reticulum isolation kit.

老舗のオルガネラの分離キットを使用して急速な脂質液滴の隔離のプロトコル

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Isolation and Characterization of Human Adipocyte-Derived Extracellular Vesicles using Filtration and Ultracentrifugation

Extracellular vesicles (EVs) are lipid enclosed envelopes that carry biologically active material such as proteins, RNA, metabolites and lipids. EVs can modulate the cellular status of other cells locally in tissue microenvironments or through liberation into peripheral blood. Adipocyte-derived EVs are elevated in the peripheral blood and show alterations in their cargo (RNA and protein) during metabolic disturbances, including obesity and diabetes. Adipocyte-derived EVs can regulate the cellular status of neighboring vascular cells, such as endothelial cells and adipose tissue resident macrophages to promote adipose tissue inflammation. Investigating alterations in adipocyte-derived EVs in vivo is complex because EVs derived from peripheral blood are highly heterogenous and contain EVs from other sources, namely platelets, endothelial cells, erythrocytes and muscle. Therefore, the culture of human adipocytes provides a model system for the study of adipocyte derived EVs. Here, we provide a detailed protocol for the extraction of total small EVs from cell culture media of human gluteal and abdominal adipocytes using filtration and ultracentrifugation. We further demonstrate the use of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) for quantification of EV size and concentration and show the presence of EV-protein tumor susceptibility gene 101 (TSG101) in the gluteal and abdominal adipocyte derived-EVs. Isolated EVs from this protocol can be used for downstream analysis, including transmission electron microscopy, proteomics, metabolomics, small RNA-sequencing,&#160;microarrays and can be&#160;utilized in functional in vitro/in vivo studies.

We describe the isolation of human adipocyte-derived extracellular vesicles (EVs) from gluteal and abdominal adipose tissue using filtration and ultracentrifugation. We characterize the isolated adipocyte-derived EVs by determining their size and concentration by Nanoparticle Tracking Analysis and by western blotting for the presence of EV-protein tumor susceptibility gene 101 (TSG101).

Extracellular vesicles (EVs) are lipid enclosed envelopes that carry biologically active material such as proteins, RNA, metabolites and lipids. EVs can ...

Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they are believed to serve a central role in the adaptation and remodeling of the thylakoid membrane under rapidly changing environmental conditions. The capacity to isolate plastoglobules of high purity has greatly facilitated their study through proteomic, lipidomic, and other methodologies. With plastoglobules of high purity and yield, it is possible to investigate their lipid and protein composition, enzymatic activity, and protein topology, among other possible molecular characteristics. This article presents a rapid and effective protocol for the isolation of plastoglobules from chloroplasts of plant leaf tissue and presents methodological variations for the isolation of plastoglobules and related lipid droplet structures from maize leaves, the desiccated leaf tissue of the resurrection plant, Eragrostis nindensis, and the cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC 6803. Isolation relies on the low density of these lipid-rich particles, which facilitates their purification by sucrose density flotation. This methodology will prove valuable in the study of plastoglobules from diverse species.

A fast and efficient protocol is presented for the isolation of plastoglobule lipid droplets associated with various photosynthetic organisms. The successful preparation of isolated plastoglobules is a crucial first step that precedes detailed molecular investigations such as proteomic and lipidomic analyses.

プラストグロビュール 植物葉組織およびシアノバクテリアからの脂肪滴分離

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they ...

細胞の脂質滴の分離：酵母細胞とヒト胎盤から2精製技術

要約

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非コード小型RNA定量化のための高密度リポタンパク質の単離

定量的質量分析のための脂肪滴の分離

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッカロミセス・セレビシエ細胞リピドームの定量的解析

Isolation and Processing of Murine White Adipocytes for Transcriptome and Epigenome Analyses

エレクトロスプレーイオン化質量分析法を用いて酵母Lipidomeの定量評価

代謝標識と薄層クロマトグラフィーによるサッカロミセス・セレビシエにおける中性脂質合成の解析

自動画像処理による核分裂および発芽酵母における脂質液滴含有量の解析

老舗のオルガネラの分離キットを使用して急速な脂質液滴の隔離のプロトコル

Isolation and Characterization of Human Adipocyte-Derived Extracellular Vesicles using Filtration and Ultracentrifugation

プラストグロビュール植物葉組織およびシアノバクテリアからの脂肪滴分離

細胞の脂質滴の分離：酵母細胞とヒト胎盤から2精製技術

要約

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非コード小型RNA定量化のための高密度リポタンパク質の単離

定量的質量分析のための脂肪滴の分離

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッカロミセス・セレビシエ細胞リピドームの定量的解析

Isolation and Processing of Murine White Adipocytes for Transcriptome and Epigenome Analyses

エレクトロスプレーイオン化質量分析法を用いて酵母Lipidomeの定量評価

代謝標識と薄層クロマトグラフィーによる サッカロミセス・セレビシエ における中性脂質合成の解析

自動画像処理による核分裂および発芽酵母における脂質液滴含有量の解析

老舗のオルガネラの分離キットを使用して急速な脂質液滴の隔離のプロトコル

Isolation and Characterization of Human Adipocyte-Derived Extracellular Vesicles using Filtration and Ultracentrifugation

プラストグロビュール 植物葉組織およびシアノバクテリアからの脂肪滴分離

代謝標識と薄層クロマトグラフィーによるサッカロミセス・セレビシエにおける中性脂質合成の解析

プラストグロビュール植物葉組織およびシアノバクテリアからの脂肪滴分離