この共培養画面の開発中に、彼の非常に貴重な助言と支援のための著者のおかげロベルトKolter（ハーバード大学医学部）。彼女は図6の取得の支援についてもわかりやすくするために原稿を読んでくれてありがとうマシューパワーズ、そして嘉義チェン。

<ol>
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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

このプロトコルの固有の制限の一つは、微生物のcultivabilityに依存することである。よく24を文書化してきたように、地球上で最も微生物の人生は（まだ）これまでに検討さ培養条件下で増殖させることができません。これにより、自然環境で発生している微生物種間の相互作用の膨大な数は、このアプローチを用いて検出されないであろう。私たちの願いは、このような相互作用の?...

私たちは、細菌が分泌する代謝物が隣接微生物の生理機能と発展にどのように影響するかを理解することに興味を持っています。多くの代謝物は、他の微生物に及ぼす生理活性効果のために特徴付けられている。 2つのよく記載の実施例は、他の微生物の全体的な遺伝子発現を変化させる他の微生物の増殖を阻害する抗生物質、およびクオラムセンシング分子が含まれる。しかし、細菌は既知の生物活性1を持っていない他の多くの小分子の天然産物を生産する。私たちは、細菌が進化し、彼らは彼らがほとんどの細菌が存在し、その中の複雑な微生物群集での微生物の隣人の細胞生理を調節することができるため、これらの代謝物の一部を生産する能力を保っていると仮定した。 枯草菌細胞型私たちは、Bacilを伴う化学的に媒介微生物の相互作用に関する我々の研究を集中してきたLUは枯草菌。これは、グラム陽性モデル細菌とその操作のために利用可能な結果の遺伝的なツールとしての地位を、だけでなく、ために特性の細胞種に分化する能力があるだけではありません。環境からDNAを取り込むことのできる、、堅牢なバイオフィルムの形成のために必要とされる細胞外マトリックスを産生する、水泳、その他2の中で、胞子形成：例としては、細胞が含まれる。これらの細胞型の各々は、それらの生理学的および/または物理的に別個のそれらの遺伝的に同一の兄弟からなる特徴的な転写レギュロンを発現する。多くの増殖条件下で、複数の細胞型は、B.の単一コロニー内のような種々の亜集団を共存枯草菌細胞 3。細菌の多くの種は、類似の細胞型の不均一性を示すことができるが、この現象は、特によくB.研究されている枯草菌 。 UPRであり、特に、遺伝子これらの特定のBの各々の中egulated 枯草菌細胞型が同定されている。興味のあるこれらの微生物の表現型の多くは、直接観察することが困難または不可能であるため、このようなアップレギュレートされた遺伝子を同定すること、ここで説明する研究に不可欠である。例えば、我々は、視覚的に、このような固体（1.5％）寒天プレート上で水泳など形質を検出できなくてもBの亜集団枯草菌細胞は、それらの条件の下で3鞭毛を生産する。別の例としては、バイオフィルムマトリックス生産です。行列の生産は（それが巨視的にしわコロニーになるように）コロニー形態により可視化だけ特定の増殖培地上、唯一の成長4の倍数日後にすることができます。しかし、分化の間にアップレギュレートされる遺伝子を知ることによって、私たちは、これらの細胞型への細胞分化のマーカーとして機能するの転写レポーターを構築することができます。 レポーター構築これらの蛍光トンranscriptionalレポーターは、細胞型特異的遺伝子は、蛍光タンパク質、例えば、レポーター遺伝子の産生を駆動するためのプロモーターから成る。例としては、P HAG-YFP（水泳細胞）、P TAPA-YFP（バイオフィルムマトリックス産生細胞用）、およびP xは遺伝子xのプロモーター領域を示すP SSPB-YFP（細胞を胞子形成のための）が含まれる。表現型のネイティブ調節がそのまま残されているように、これらのレポーター構築物は、染色体上の中立座位（ 図1及び下記参照）に統合されています。細胞はこの表現型を発現しかし、今、それはまた、蛍光タンパク質を発現する。これは、私たちは、この生理学的応答を活性化する微生物をスクリーニングすることができ、特定の表現型の行動の活性化の容易に可視化読み出しを提供しています。このような記者は、一般的に微生物学で使用されているが、これらは広くidentifするスクリーニングに適用されていないこのメソッドの前に微生物間のY代謝相互作用は5を説明した。 細胞型特異的レポーター株の設計と建設における重要な考慮事項がいくつかあります。構築物の他の種類は確かに可能であるが、我々は、排他的に転写蛍光レポーターを利用している。我々は2つ​​の理由のために、しかし、私たちの画面での細胞種分化のマーカーとして翻訳融合の使用を思いとどまら：非摂動天然の細胞型特異的タンパク質を残す1）意欲、および2）の認識、その拡散し、細胞広い蛍光は（翻訳融合と共通）、細胞内に局在涙点よりも検出が容易になります。 レポーター遺伝子の選択 読み出しなどの転写を使用することを決定した後、レポーター遺伝子（ 例えば LacZを、蛍光、またはルシフェラーゼ）を選択する必要があります。 lacZを少なくとも特別なを必要とするという利点がある検出するための設備を化されたが、環境微生物の中で偽陽性の非常に高い可能性がある。私たちの手では、土壌の微生物の中でラック+生物のバックグラウンドレベルは、（;データは示していない&gt;&gt;土壌微生物の10％が、X-galプレート上で）ラック+（青だった）法外に高かった。我々はこれをしようとしなかったが、それは、媒体中のX-galの濃度を滴定することによって、これはX-galをレポーターの使用を可能にするように最適化され得ることが可能である。ルシフェラーゼは、高い検出感度を提供し、最も直交レポーターである：環境微生物は、本質的に発光であることのほとんどない可能性があります。しかし、我々はそれが困難で大部分がマルチウェルプレートでのみ局所的な領域をスキャンするように設計されたように、全体のペトリプレートを横切って発光検出を可能にした我々の施設での器具類を同定することが見出さ。また、また、同時に、物理が許可された方法で、発光コロニーを可視化する合併症があるかもしれない誘導生物のオレーション。受託者を使用すると、これを可能にしたかもしれないが、我々は代わりにBで動作するように証明された蛍光の転写レポーターを使用することを選択枯草菌は 、検出と土壌生物の中で低い偽陽性率の十分な感度を提供し、可視化し、単離方法の両方で簡単に利用可能な機器の使用を許可。 蛍光団の選択 選択された特定のフルオロフォアは、あなたの細菌種は、使用している寒天増殖培地、および、利用可能な特定の蛍光フィルターセットに依存します。当社の計測機器では、我々が発見したBの両方枯草菌は自身とYFP（黄色蛍光タンパク質）フィルタが使用されたときには私たちの手の中にGFP（緑色蛍光タンパク質）へのレポーターは、優れた作り、展示少ないバックグラウンド蛍光上で増殖させた寒天コロニー。蛍光タンパク質のコドン使用頻度である頻繁にどちらかあなたの細菌種で機能するように、または構成的プロモーターを使用して明示的にテストするために文献から知られている蛍光体を選択することが重要に作り、真核生物のために最適化された。進化し続ける蛍光タンパク質変異体の大きな数は6、現在利用可能であり、明示的に実験9の適切な蛍光タンパク質を選択するためのガイダンスを提供し、そのうちのいくつかのソース7,8の数、で検討されている。 プロモーターの選択 プロモーターの選択は、主に携帯型または関心対象の表現型に依存するであろう。このようなBと生物の枯草菌 、いくつかの細胞型特異的レポーター遺伝子は、文献において確立されている。他の細菌株については、マイクロアレイまたは転写データを調べることは、関心iの携帯型遺伝子は高度な条件下でアップレギュレートされているかについての情報を提供することが必要であるSは明らか。最近の研究では、Bの転写をカタログ化タイリングマイクロアレイ10を使用して、104の異なる増殖条件下ズブチリス 。本論文では、遺伝子は、高度にあまりよく特徴付けられた表現型のための非常に貴重である、異なる条件下でアップレギュレートされているかについての包括的な情報を提供します。 むしろ関心のある全ての遺伝子のための正確なプロモーター領域をマッピングするよりも、我々は一般的に、単純に、プロモーターとしての遺伝子の上流配列200〜500塩基対を使用しています。正確な配列の長さは、ゲノムの文脈に依存する：必要なオープンリーディングフレームの上流に隣接するコード領域を含む回避するときに短い領域が使用される。 中立座と統合 どのような細菌株においてレポーター構築物を維持するために蛍光転写レポーター株を設計する際の最後の質問になります。細菌では、関心対象の遺伝子が頻繁に維持される抗生物質の選択を使用してプラスミド上。しかしながら、環境微生物を殺すことなく共存時に抗生物質を使用できないことがあり得る。プラスミドを安定的にお使いの細菌種で維持している場合は、スクリーニングのために、あなたのレポーターを準備するための抗生物質の存在下でプラスミド由来のレポーターを含むあなたの細菌を成長した後、プラスミドは思いますが、共培養自体の間に、抗生物質を排除することが可能である十分な蛍光を可能にするために維持される。プラスミドは簡単に細菌中で失われているか、ストレス条件下で失われた場合は、これは実行可能な選択肢ではありません。多くの場合、最善の解決策であっても、選択の非存在下でのレポーターの安定な維持を可能にする細菌染色体上にレポーター構築物を統合することであろう。目的の遺伝子の正常な発現や規制を混乱しないようにする統合のためには、我々はカリフォルニア染色体上の異所性部位の中に統合することをお勧めしますNとして機能する「中立座。 &quot; Bの枯草菌 、これらの組み込み部位が遺伝子であることを-変異したとき- （組込み体が抗生物質選択することなしに同定することができるように）特定の最小培地での表現型を伝え、まだリッチメディアの成長や胞子形成率を変更しない、とのamyE、LACAなどの遺伝子が含まれる、 thrC遺伝子、pyrD、gltA遺伝子、およびSACA（デンプンを利用する能力を搬送する、β-ガラクトシド、トレオニン、ウラシル、グルタミン酸塩、及びスクロース、それぞれ）11-13。 これらの遺伝子における統合はB.に長年にわたって確実に使用されてきたが枯草菌 （特にのamyEとLACA時）、同じような知識は、他の多くの細菌種の遺伝子のために利用できない場合があります。ファージ結合部位の使用は、中立的な染色体組み込み部位に最適の選択肢である：多くの種特異的14〜16、ならびにそのようなのTn7接着部位などの一般的な組み込み部位（ATTの Tn7転移）が持っている多くの細菌種17,18で同定した遺伝子の挿入のために利用されて。 環境微生物私達は私達の共培養画面の環境微生物の直接のソースとして土を使用しています。土壌微生物の高い多様性を含有し、これらの生物の多くは、天然物の豊富な供給源である。 （土壌からの細菌の事前の単離することなく）私たちの蛍光転写レポーター株にプレート上に直接置かれた土壌の液体懸濁液を使用することにより、我々は非常に実験的なアプローチを簡素化します。土壌は、収穫後直ちに使用することができる、又は将来の使用のために-80℃で凍結する。即時の使用は、微生物の大きな多様性は、潜在的にうまく凍結生存しないであろうものを含めて、成長させることができるという利点を有する。これは、使用しなければならないスクリーン板の数を増加させる、これらのサンプルから培養可能な土壌生物の濃度が不明であるという欠点を有する。デルayed使用が最適化されたコロニーの数は、各スクリーン版上に成長させることができるように、各土壌のソースcfu / mlでは、事前に決定することができるという利点を有する。しかし、土壌生物が凍結を存続できることが必要です。 デューサプールの多様化が検討されていることに注意してください（ すなわち土壌源）は、同じ土壌に関する詳細なスクリーニングよりも新しい種間相互作用を同定するのにより効果的であるように思われる。大きな系統発生多様性としてのマトリックスの誘導画面で同定されたヒットで観察された追加の土壌のソースは、（EAシャンクとR. Kolter、ハーバード大学医学部、未発表の結果）を調べたのではなく、より徹底的に、同じ土壌のソースをスクリーニングされた。 概要我々はここで説明するアプローチは、その技術的要件の面で簡単です。それが含まれます。1）Bの蛍光転写レポーターを構築する枯草菌や関心のある他の細菌種、2）4）、これらを混合、）我々の場合の土壌中の（3）スクリーニングされるこのレポーター株と生物のアリコートを調製し、この記者が活性化されていない条件を特定したが、他のソースではなく、利用することができる固体培地上の微生物の二組、5）を同定および単離推定上の生物を誘導する、および6）これらの生物が実際に二次スクリーニングにおいて、この表現型を活性化しないことを確認した。一旦同定、これらの生物とその代謝物は、細菌の挙動を調節するために、細菌の生理学および微生物の相互作用を研究するために、潜在的に将来の治療用化合物のための新規な足場として作用する化学物質のツールを提供してくれる。

<table><tbody><tr><td>Spectrophotometer</td><td></td><td></td><td>Any spectrophotomer capable of measuing OD&lt;sub&gt;600 &lt;/sub&gt;absorbance values.</td></tr><tr><td>Luria broth, Lennox</td><td>VWR</td><td>80017-484</td><td>Alternative media sources may be necessary.</td></tr><tr><td>Glass beads, 3 mm</td><td>VWR</td><td>26396-508</td><td></td></tr><tr><td>Gel loading tips, round</td><td>VWR</td><td>29442-666</td><td></td></tr><tr><td>Glass rods</td><td>VWR</td><td>59060-069</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence dissecting stereoscope</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary.</td></tr></tbody></table>

using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions

自然界では、細菌はほとんど単独で存在していない、彼らは代わりに代謝物を分泌することにより、ローカル環境を変更他の微生物の多様な囲まれています。これらの代謝産物は、その微生物の隣人の生理学および分化を調節する可能性があると思わ複雑な微生物群集の確立と維持に重要な要素である。我々はそのような化学的媒介微生物の相互作用を同定するために蛍光ベースの共培養画面を開発しました。画面には、固形培地上での環境微生物に蛍光転写レポーター株を組み合わせて、コロニーが共培養で増殖させることが含まれます。それは、目的の特定の表現型発現されたときに選択された細菌株が蛍光を発するように蛍光体転写レポーターに設計され（ すなわち、バイオフィルム形成、胞子形成、毒性因子の産生、等 。）スクリーニングは成長条件の下で行われるWHEこの表現型を再発現（したがって、レポーター株は、典型的には非蛍光性である）されない 。環境微生物がこの表現型を活性化する代謝産物を分泌する場合には、寒天を通って拡散し、蛍光レポーター構築物を活性化する。これは誘導代謝産物を産生する微生物を検出することができます：彼らは蛍光コロニーに最も近い非蛍光コロニーである。このように、この画面には、レポーター株の特定の生理的応答を活性化拡散性代謝​​物を生産する環境微生物の同定を可能にする。 a）に示すように、適切な共培養スクリーニング条件を選択B）スクリーニングのためのレポーターや環境微生物を準備し、c）の共培養画面を行い、D）推定誘導する生物を分離し、そしてe）二次スクリーニングにおいてその活性を確認する：この資料には、どのように説明します。私たちは、 枯草菌におけるバイオフィルムマトリックスの生産を活性化する土壌生物をスクリーニングするためにこの方法を開発した</EM&gt;が、我々はまた、他の遺伝的に扱いやすい細菌にこの手法を適用するための考慮事項について説明します。

この画面は、B.の生理機能を変化させる化合物を分泌する土壌生物を同定するために使用した枯草菌 。ここに記載の結果は、B.のマトリックス産生細胞型に焦点を当てるこの細菌における強固なバイオフィルムの形成のために必要とされるタンパク質とエキソポリサッカライドを生産菌 、。私たちは、蛍光レポーター構築物（P TAPA-YFP）のためTAPA-s...

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Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

細菌は、その微生物の隣人の生理機能に影響を及ぼす可能性があり、分泌された化合物を製造する。ここでは、固体培地上で枯草菌の蛍光転写レポーター株と土壌微生物を混合することにより、このような化学的に仲介される種間の相互作用の検出を可能にする共培養画面について説明します。

化学的に媒介種間相互作用を検出するための共培養を使用して

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

using-coculture-to-detect-chemically-mediated-interspecies

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

13.5K ビュー.  University of North Carolina at Chapel Hill. 細菌は、その微生物の隣人の生理機能に影響を及ぼす可能性があり、分泌された化合物を製造する。ここでは、固体培地上で枯草菌の蛍光転写レポーター株と土壌微生物を混合することにより、このような化学的に仲介される種間の相互作用の検出を可能にする共培養画面について説明します。 

ビデオ: Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with the goal of examining the ecological functions of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. The result has been a progression of protocols that have increasingly refined the ecological relevance of the experimental approach. Here we present the most up-to-date version of a fish-feeding laboratory bioassay that enables investigators to assess the antipredatory activity of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. Organic metabolites of all polarities are exhaustively extracted from the tissue of the target organism and reconstituted at natural concentrations in a nutritionally appropriate food matrix. Experimental food pellets are presented to a generalist predator in laboratory feeding assays to assess the antipredatory activity of the extract. The procedure described herein uses the bluehead, Thalassoma bifasciatum, to test the palatability of Caribbean marine invertebrates; however, the design may be readily adapted to other systems. Results obtained using this laboratory assay are an important prelude to field experiments that rely on the feeding responses of a full complement of potential predators. Additionally, this bioassay can be used to direct the isolation of feeding-deterrent metabolites through bioassay-guided fractionation. This feeding bioassay has advanced our understanding of the factors that control the distribution and abundance of marine invertebrates on Caribbean coral reefs and may inform investigations in diverse fields of inquiry, including pharmacology, biotechnology, and evolutionary ecology.

This bioassay employs a model predatory fish to assess the presence of feeding-deterrent metabolites from organic extracts of the tissues of marine organisms at natural concentrations using a nutritionally comparable food matrix.

海洋生物の組織からの二次代謝産物のAntipredatory活性を評価するために魚の供給研究所バイオアッセイ

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with ...

環境学

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our entire society's ability to treat systemic infections. In the United States alone, antibiotic-resistant infections kill approximately 23,000 people a year and cost around 20 billion USD in additional healthcare. One approach to combat antimicrobial resistance is combination therapy, which is particularly useful in the critical early stage of infection, before the infecting organism and its drug resistance profile have been identified. Many antimicrobial treatments use combination therapies. However, most of these combinations are additive, meaning that the combined efficacy is the same as the sum of the individual antibiotic efficacy. Some combination therapies are synergistic: the combined efficacy is much greater than additive. Synergistic combinations are particularly useful because they can inhibit the growth of antimicrobial drug resistant strains. However, these combinations are rare and difficult to identify. This is due to the sheer number of molecules needed to be tested in a pairwise manner: a library of 1,000 molecules has 1 million potential combinations. Thus, efforts have been made to predict molecules for synergy. This article describes our high-throughput method for predicting synergistic small molecule pairs known as the Overlap2 Method (O2M). O2M uses patterns from chemical-genetic datasets to identify mutants that are hypersensitive to each molecule in a synergistic pair but not to other molecules. The Brown lab exploits this growth difference by performing a high-throughput screen for molecules that inhibit the growth of mutant but not wild-type cells. The lab's work previously identified molecules that synergize with the antibiotic trimethoprim and the antifungal drug fluconazole using this strategy. Here, the authors present a method to screen for novel synergistic combinations, which can be altered for multiple microorganisms.

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Synergistic drug combinations are difficult and time-consuming to identify empirically. Here, we describe a method for identifying and validating synergistic small molecules.

重複2法による相乗効果の薬剤の組合せの高スループット識別

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

遺伝学

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has relevant health and economic consequences. Many cyanobacterial strains are toxin producers, and only a few cells are necessary to induce irreparable damage to the environment. Therefore, water-body authorities and administrations require rapid and efficient early-warning systems providing reliable data to support their preventive or curative decisions. This manuscript reports an experimental protocol for the in-field detection of toxin-producing cyanobacterial strains by using an antibody microarray chip with 17 antibodies (Abs) with taxonomic resolution (CYANOCHIP). Here, a multiplex fluorescent sandwich microarray immunoassay (FSMI) for the simultaneous monitoring of 17 cyanobacterial strains frequently found blooming in freshwater ecosystems, some of them toxin producers, is described. A microarray with multiple identical replicates (up to 24) of the CYANOCHIP was printed onto a single microscope slide to simultaneously test a similar number of samples. Liquid samples can be tested either by direct incubation with the antibodies (Abs) or after cell concentration by filtration through a 1- to 3-&#956;m filter. Solid samples, such as sediments and ground rocks, are first homogenized and dispersed by a hand-held ultrasonicator in an incubation buffer. They are then filtered (5 - 20 &#956;m) to remove the coarse material, and the filtrate is incubated with Abs. Immunoreactions are revealed by a final incubation with a mixture of the 17 fluorescence-labeled Abs and are read by a portable fluorescence detector. The whole process takes around 3 h, most of it corresponding to two 1-h periods of incubation. The output is an image, where bright spots correspond to the positive detection of cyanobacterial markers.

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.

検出するための実験プロトコール<em&gt;シアノバクテリア</em&gt;抗体マイクロアレイチップと液体と固体試料中の

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has ...

In Situ Chemotaxis Assay to Examine Microbial Behavior in Aquatic Ecosystems

Microbial behaviors, such as motility and chemotaxis (the ability of a cell to alter its movement in response to a chemical gradient), are widespread across the bacterial and archaeal domains. Chemotaxis can result in substantial resource acquisition advantages in heterogeneous environments. It also plays a crucial role in symbiotic interactions, disease, and global processes, such as biogeochemical cycling. However, current techniques restrict chemotaxis research to the laboratory and are not easily applicable in the field. Presented here is a step-by-step protocol for the deployment of the in situ chemotaxis assay (ISCA), a device that enables robust interrogation of microbial chemotaxis directly in the natural environment. The ISCA is a microfluidic device consisting of a 20 well array, in which chemicals of interest can be loaded. Once deployed in aqueous environments, chemicals diffuse out of the wells, creating concentration gradients that microbes sense and respond to by swimming into the wells via chemotaxis. The well contents can then be sampled and used to (1) quantify strength of the chemotactic responses to specific compounds through flow cytometry, (2) isolate and culture responsive microorganisms, and (3) characterize the identity and genomic potential of the responding populations through molecular techniques. The ISCA is a flexible platform that can be deployed in any system with an aqueous phase, including marine, freshwater, and soil environments.

Presented here is the protocol for an in situ chemotaxis assay, a recently developed microfluidic device that enables studies of microbial behavior directly in the environment.

水生生態系における微生物行動を調べるSitu chemotaxisアッセイで

Microbial behaviors, such as motility and chemotaxis (the ability of a cell to alter its movement in response to a chemical gradient), are widespread ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

低親和性細胞外受容体 - リガンド相互作用の検出のためのスケーラブルな親和性ベースの細胞外相互作用のスクリーニング（AVEXIS）

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

生物学

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. This method employs stable plasmids that allow each population to be differentially tagged with distinct antibiotic resistance capabilities and fluorescent proteins for selection and visual discrimination of each population, respectively. Here, we describe the preparation and coincubation of competing Vibrio fischeri strains, fluorescence microscopy imaging, and quantitative data analysis. This approach is simple, yields quick results, and can be used to determine whether one population kills or inhibits the growth of another population, and whether competition is mediated through a diffusible molecule or requires direct cell-cell contact. Because each bacterial population expresses a different fluorescent protein, the assay permits the spatial discrimination of competing populations within a mixed colony. Although the described methods are performed with the symbiotic bacterium V. fischeri using conditions optimized for this species, the protocol can be adapted for most culturable bacterial isolates.

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

Bacteria encode diverse mechanisms for engaging in interbacterial competition. Here, we present a culture-based protocol for characterizing competitive interactions between bacterial isolates and how they impact the spatial structure of a mixed population.

ビブリオ・フィシェリ・アイシス間の競争的相互作用を定量化するためのコインキュベーション・アッセイ

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. ...

免疫・感染学

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.

微生物相互作用の調査のための高スループット共培養アッセイ

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many ...

Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method has been developed for observing interspecies interactions between two bacterial pathogens. The use of this method to interrogate interactions between a motile Gram-negative pathogen, Pseudomonas aeruginosa and a non-motile Gram-positive pathogen, Staphylococcus aureus is demonstrated here. This protocol consists of co-inoculating each species between a coverslip and an agarose pad, which maintains the cells in a single plane and allows for visualization of bacterial behaviors in both space and time.
Furthermore, the time-lapse microscopy demonstrated here is ideal for visualizing the early interactions that take place between two or more bacterial species, including changes in bacterial species motility in monoculture and in coculture with other species. Due to the nature of the limited sample space in the microscopy setup, this protocol is less applicable for studying later interactions between bacterial species once cell populations are too high. However, there are several different applications of the protocol which include the use of staining for imaging live and dead bacterial cells, quantification of gene or protein expression through fluorescent reporters, and tracking bacterial cell movement in both single species and multispecies experiments.

This live-bacterial cell imaging protocol allows for visualization of interactions between multiple bacterial species at the single-cell level over time. Time-lapse imaging allows for observation of each bacterial species in monoculture or coculture to interrogate interspecies interactions in multispecies bacterial communities, including individual cell motility and viability.

単細胞間細菌相互作用の運動的可視化

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method ...

<meta charset="utf8"></head><body>スクロース分泌シアノバクテリアと真菌パートナーとの共培養のためのプロトコール

Assembly and Quantification of Co-Cultures Combining Heterotrophic Yeast with Phototrophic Sugar-Secreting Cyanobacteria

With the increasing demand for sustainable biotechnologies, mixed consortia containing a phototrophic microbe and heterotrophic partner species are being explored as a method for solar-driven bioproduction. One approach involves the use of CO2-fixing cyanobacteria that secrete organic carbon to support the metabolism of a co-cultivated heterotroph, which in turn transforms the carbon into higher-value goods or services. In this protocol, a technical description to assist the experimentalist in the establishment of a co-culture combining a sucrose-secreting cyanobacterial strain with a fungal partner(s), as represented by model yeast species, is provided. The protocol describes the key prerequisites for co-culture establishment: Defining the media composition, monitoring the growth characteristics of individual partners, and the analysis of mixed cultures with multiple species combined in the same growth vessel. Basic laboratory techniques for co-culture monitoring, including microscopy, cell counter, and single-cell flow cytometry, are summarized, and examples of nonproprietary software to use for data analysis of raw flow cytometry standard (FCS) files in line with FAIR (Findable, Accessible, Interoperable, Reusable) principles are provided. Finally, commentary on the bottlenecks and pitfalls frequently encountered when attempting to establish a co-culture with sugar-secreting cyanobacteria and a novel heterotrophic partner is included. This protocol provides a resource for researchers attempting to establish a new pair of co-cultured microbes that includes a cyanobacterium and a heterotrophic microbe.

<meta charset="utf8"></head><body>従属栄養酵母と光合成糖分泌シアノバクテリアを組み合わせた共培養物の組み立てと定量化

This protocol provides a comprehensive guideline for the setup and quantitative monitoring of co-cultures, including photoautotrophic sugar-secreting cyanobacteria and heterotrophic yeasts.

従属栄養酵母と光合成糖分泌シアノバクテリアを組み合わせた共培養物の組み立てと定量化

With the increasing demand for sustainable biotechnologies, mixed consortia containing a phototrophic microbe and heterotrophic partner species are being ...

化学的に媒介種間相互作用を検出するための共培養を使用して

要約

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海洋生物の組織からの二次代謝産物のAntipredatory活性を評価するために魚の供給研究所バイオアッセイ

重複²法による相乗効果の薬剤の組合せの高スループット識別

検出するための実験プロトコール

水生生態系における微生物行動を調べるSitu chemotaxisアッセイで

低親和性細胞外受容体 - リガンド相互作用の検出のためのスケーラブルな親和性ベースの細胞外相互作用のスクリーニング（AVEXIS）

ビブリオ・フィシェリ・アイシス間の競争的相互作用を定量化するためのコインキュベーション・アッセイ

微生物相互作用の調査のための高スループット共培養アッセイ

単細胞間細菌相互作用の運動的可視化

従属栄養酵母と光合成糖分泌シアノバクテリアを組み合わせた共培養物の組み立てと定量化

従属栄養酵母と光合成糖分泌シアノバクテリアを組み合わせた共培養物の組み立てと定量化