L&#39;autore ringrazia Roberto Kolter (Harvard Medical School) per la sua preziosa consulenza e assistenza durante lo sviluppo di questa schermata co-coltura. Ha anche grazie Matthew Powers per leggere il manoscritto per chiarezza, e Chia-yi Cheng per l&#39;assistenza con l&#39;ottenimento di Figura 6.

<ol>
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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Uno dei limiti intrinseci di questo protocollo è che si basa sulla coltivabilità degli organismi microbici. Come è stato ben documentato 24, più la vita microbica del pianeta non può (ancora) essere coltivata nelle condizioni di coltura esplorati fino ad oggi. Così, un enorme numero di interazioni tra le specie microbiche che si stanno verificando in ambienti naturali passeranno inosservati utilizzando questo approccio. Tuttavia, poiché il nostro desiderio è quello di individuare non solo l&#39;esiste...

Siamo interessati a capire come i metaboliti che i batteri secernono influenzano la fisiologia e lo sviluppo di microbi vicini. Molti metaboliti sono stati caratterizzati per i loro effetti bioattivi su altri microbi. Due esempi ben descritti comprendono antibiotici, che inibiscono la crescita di altri microbi, e molecole quorum sensing, che alterano l&#39;espressione genica globale di altri microbi. Tuttavia, i batteri producono molti altri piccoli prodotti naturali molecola che non hanno conosciuto bioattività 1. Noi ipotizziamo che i batteri si sono evoluti e conservato la capacità di produrre alcuni di questi metaboliti perché consentono loro di modulare la fisiologia cellulare dei loro vicini microbica nelle comunità microbiche complesse all&#39;interno delle quali esistono maggior parte dei batteri. Tipi cellulari Bacillus subtilis Abbiamo concentrato i nostri studi sulle interazioni microbiche mediate chimicamente che coinvolgono Bacilsubtilis LU. Questo non solo a causa del suo status di modello batterio Gram-positivi e gli strumenti genetici risultanti disponibili per la sua manipolazione, ma anche per la sua capacità di differenziarsi in tipi cellulari caratterizzati. Esempi includono cellule che sono: nuoto, producono la matrice extracellulare che è necessario per la formazione di biofilm robusta; competenti ad assumere DNA dall&#39;ambiente e sporulanti, tra gli altri 2. Ognuno di questi tipi di cellule esprime una caratteristica regulon trascrizionale che li rende fisiologicamente e / o fisicamente distinti dai loro fratelli geneticamente identici. Sotto molte condizioni di crescita, più tipi di cellule coesistono varie sottopopolazioni all&#39;interno di una singola colonia di B. cellule subtilis 3. Sebbene molte specie di batteri possono presentare analogo tipo cellulare eterogeneità, questo fenomeno è stato particolarmente studiato in B. subtilis. In particolare, i geni che sono UPRegulated all&#39;interno di ciascuno di questi specifici B. Sono stati identificati tipi cellulari subtilis. Identificare tali geni upregulated è essenziale per il lavoro qui descritto perché molti di questi fenotipi microbici di interesse sono difficili o impossibili da osservare direttamente. Per esempio, non siamo in grado di rilevare visivamente un tratto come il nuoto su solide (1,5%) piastre di agar, anche se una sottopopolazione di B. cellule subtilis producono flagelli in queste condizioni 3. Un altro esempio è biofilm matrice-produzione. Produzione Matrix può essere visualizzato da morfologia delle colonie (come risulta nelle colonie macroscopicamente rugose), ma solo su determinati mezzo di crescita, e solo dopo diversi giorni di crescita 4. Tuttavia, conoscendo quali geni sono upregulated durante la differenziazione, possiamo costruire reporter trascrizionali che agiscono come marcatori di differenziazione cellulare in questi tipi cellulari. Costrutti reporter Queste t fluorescentereporter ranscriptional costituiti dai promotori per i geni specifici di tipo a cella guidare la produzione di un gene reporter, per esempio una proteina fluorescente. Gli esempi includono P HAG-YFP (per il nuoto celle), P Tapa-YFP (per le celle della matrice che producono biofilm), e P SSPB-YFP (per sporulanti celle), dove P x indica la regione del promotore per il gene x. Questi costrutti reporter sono integrati in un locus neutro sul cromosoma (Figura 1 e, vedi sotto) in modo che la regolazione nativo del fenotipo è lasciata intatta. Tuttavia, ora quando una cellula esprime questo fenotipo, esprime anche una proteina fluorescente. Ciò fornisce un read-out facilmente visualizzati dell&#39;attivazione del comportamento particolare fenotipica, che ci permette di screening per i microbi che attivano questa risposta fisiologica. Sebbene tali giornalisti sono comunemente utilizzati in microbiologia, non sono stati ampiamente applicati in schermi a identifinterazioni metaboliche y tra i microbi prima di questo metodo è stato descritto 5. Ci sono una serie di considerazioni importanti nella progettazione e costruzione di cellule-tipo-specifici ceppi Reporter. Abbiamo utilizzato reporter fluorescenti esclusivamente trascrizionali, sebbene altri tipi di costrutti sono certamente possibili. Noi scoraggiamo l&#39;uso di fusioni traslazionali come marcatori per tipo di cellula differenziazione nel nostro schermo, però, per due motivi: 1) il desiderio di lasciare la cella-specifico del tipo proteina nativa imperturbabile, e 2) il riconoscimento che una diffusa, cellula- ampia fluorescenza sarà più facile da rilevare rispetto puncta localizzata all&#39;interno delle cellule (comune con fusioni traslazionali). Selezione gene reporter Dopo aver deciso di utilizzare trascrizione come-out leggere, il gene reporter deve essere selezionata (ad esempio LacZ, fluorescenza, o luciferasi). LacZ ha il vantaggio di subire almeno specialezato apparecchiature per rilevare, ma vi è un rischio molto più elevato di falsi positivi tra microbi ambientali. Nelle nostre mani, il livello di Lac + organismi tra i microbi del suolo di sottofondo era proibitivo (&gt;&gt; 10% dei microbi del suolo erano blu (Lac +) su piastre X-gal, i dati non riportati). E &#39;possibile che titolando la concentrazione di X-gal in mezzo, questo potrebbe essere ottimizzata per consentire l&#39;uso di un reporter X-gal, anche se non abbiamo tentato questa. Luciferase fornisce elevata sensibilità di rilevazione ed è il giornalista più ortogonale: non c&#39;è quasi nessuna possibilità di microbi ambientali essendo luminescenti intrinsecamente. Tuttavia, abbiamo trovato difficile individuare la strumentazione presso il nostro istituto che ha permesso la rilevazione di luminescenza in intere lastre di Petri, come la maggior parte sono stati progettati per eseguire la scansione solo le regioni localizzate in piastre multi-pozzetto. Ci potrebbe anche essere complicazioni nella visualizzazione colonie luminescenti in un modo che ha permesso anche la fisica contemporanea èolation degli organismi inducono. Durante l&#39;utilizzo fiduciari può aver reso possibile tutto questo, abbiamo invece deciso di utilizzare giornalisti trascrizionali fluorescenti, che sono stati dimostrato di funzionare in B. subtilis, purché adeguata sensibilità di rilevazione e di bassi tassi di falsi positivi tra gli organismi del suolo, e ha permesso di utilizzare facilmente di strumentazione disponibile sia per la visualizzazione e procedure di isolamento. Selezione fluoroforo Il fluoroforo specifica scelta dipenderà dalla vostra specie batteriche, il mezzo di agar di crescita che si sta utilizzando, e la particolare filtro di fluorescenza imposta che avete a disposizione. Con la nostra strumentazione, abbiamo scoperto che sia la B. subtilis se stessi e l&#39;agar sono state coltivate su esposto sfondo meno fluorescenza quando sono stati usati filtri YFP (proteina fluorescente gialla), rendendo il giornalista superiore a GFP (green fluorescent protein) nelle nostre mani colonie. Il codon usage di proteine ​​fluorescenti sonofrequentemente ottimizzato per eucarioti, che rende importante scegliere un fluoroforo sia noto dalla letteratura per lavorare nei vostri specie batteriche, o per testare esplicitamente utilizzando un promotore costitutivo. Un gran numero di continua evoluzione varianti proteiche fluorescente sono attualmente disponibili 6, che sono stati esaminati in un certo numero di fonti di 7,8, alcune delle quali prevedono esplicitamente una guida su come scegliere una proteina fluorescente appropriato per l&#39;esperimento 9. Selezione Promoter La scelta di un promotore dipenderà in gran parte dal tipo di cellulare o fenotipo di interesse. Per organismi come B. subtilis, alcuni specifici geni reporter cellula-tipo sono state stabilite in letteratura. Per gli altri ceppi batterici, l&#39;esame microarray o dati trascrizionali sarà necessario fornire informazioni su quali geni sono altamente upregulated nelle condizioni in cui il tipo di cellule di interesse is manifesto. Uno studio recente catalogato la trascrizione di B. subtilis inferiore a 104 diverse condizioni di crescita utilizzando microarrays piastrellatura 10. Questo documento fornisce informazioni complete su quali geni sono altamente sovraregolati in condizioni differenti, che è prezioso per fenotipi meno ben caratterizzati. Invece di mappatura regioni promotrici precise per ogni gene di interesse, di solito è sufficiente utilizzare la sequenza di 200-500 bp a monte del gene come il promotore. La lunghezza esatta sequenza dipende dal contesto genomico: regioni corte vengono utilizzate quando necessario per evitare comprese le regioni codificanti monte dalla vicina open reading frame. Loci Neutro e l&#39;integrazione Come mantenere il costrutto giornalista nel vostro ceppo batterico diventa la domanda finale nella progettazione di una fluorescente ceppo trascrizionale giornalista. Nei batteri, i geni di interesse sono spesso mantenutesu plasmidi che utilizzano la selezione antibiotica. Tuttavia, potrebbe non essere possibile usare antibiotici durante coculture senza uccidere i microbi ambientali. Se plasmidi sono stabilmente mantenuti nelle specie batteriche, potrebbe essere possibile crescere i vostri batteri che contiene un plasmide reporter-borne in presenza di antibiotici per preparare il giornalista per lo screening, e quindi eliminare gli antibiotici durante la co-coltura stessa, nella speranza che il plasmide sarà essere mantenuto sufficientemente per consentire fluorescenza. Tuttavia, se i plasmidi possono essere facilmente perse nel batterio, o si perdono in condizioni di stress, questo non sarà una valida opzione. In molti casi, la soluzione migliore sarà l&#39;integrazione del costrutto giornalista sul cromosoma batterico, che permette il mantenimento stabile del reporter anche in assenza di selezione. Affinché l&#39;integrazione per non disturbare la normale espressione o il regolamento del gene di interesse, si consiglia di integrare in un sito ectopica sul cromosoma che can agire come un &quot;locus neutrale&quot;. In B. subtilis questi siti integrazione sono geni che - se mutati - trasmettere un fenotipo in alcuni media minima (permettendo integrants di identificare senza selezione antibiotico), ma non modificare i tassi di crescita o sporulazione in rich media, e includere tali geni come amyE, Laca, THRC, pyrD, gltA, e SACA (trasmettere la capacità di utilizzare l&#39;amido, β-galattosidi, treonina, uracile, glutammato, e saccarosio, rispettivamente) 11-13. Mentre l&#39;integrazione in questi geni sono stati utilizzati in modo affidabile per molti anni a B. subtilis (in particolare a amyE e Laca), la conoscenza simile potrebbe non essere disponibile per i geni in molte altre specie batteriche. L&#39;uso di siti di attaccamento fagi sono ottime alternative per siti di integrazione cromosomiche neutri: molte specie-specifico 14-16, così come i siti generali di integrazione, come il sito di attacco TN7 (att TN7) hannostate identificate e utilizzate per inserimenti gene in molte specie batteriche 17,18. Microbi ambientali Usiamo suolo come fonte diretta di microbi ambientali per il nostro schermo co-coltura. Il terreno contiene una grande diversità di microbi, e molti di questi organismi sono ricca fonte di prodotti naturali. Utilizzando sospensioni liquide di terreno collocati direttamente sulle piastre con il nostro fluorescente ceppo giornalista trascrizionale (senza isolare batteri dal suolo), si semplificare notevolmente l&#39;approccio sperimentale. Il terreno può essere utilizzata immediatamente dopo la raccolta, o essere congelato a -80 ° C per un uso futuro. Uso immediato ha il vantaggio che una maggiore diversità di microbi possono potenzialmente essere coltivate, compresi quelli che non sopravviverà congelamento bene. Esso ha lo svantaggio che la concentrazione degli organismi del terreno coltivabili da questi campioni è sconosciuto, aumentando il numero di piastre di schermo che deve essere utilizzato. Deluso ayed ha il vantaggio che i cfu / ml per ciascuna sorgente suolo possono essere determinati in anticipo, consentendo un numero ottimizzato di colonie di essere coltivate su ciascuna piastra schermo. Tuttavia, esso richiede che gli organismi del suolo siano in grado di sopravvivere congelamento. Si noti che la diversificazione della piscina induttore in fase di esame (cioè le fonti del suolo) sembra essere più efficace a individuare nuove interazioni interspecie dello screening approfondito sullo stesso terreno: maggiore diversità filogenetica è stato osservato nei risultati individuati nel nostro schermo a matrice induzione Fonti del suolo supplementari sono stati esaminati, piuttosto che di screening le stesse fonti suolo più a fondo (EA Tibia e R. Kolter, Harvard Medical School, risultati non pubblicati). Panoramica L&#39;approccio che descriviamo qui è semplice in termini di requisiti tecnici. Si tratta di: 1) costruire una trascrizionale reporter fluorescente in B. subtilis o unaltre specie batteriche di interesse, 2) le condizioni di questo giornalista non è attivato di identificazione, 3) preparazione di aliquote di questo ceppo giornalista e organismi che saranno proiettati (nel nostro caso del suolo, ma altre fonti potrebbero essere utilizzati al posto), 4) mescolando questi due gruppi di microbi su supporti solidi, 5) individuare e isolare putativo inducendo organismi e 6), a conferma che questi organismi effettivamente attivano questo fenotipo in uno schermo secondario. Una volta identificati, questi organismi e dei loro metaboliti ci forniscono gli strumenti chimici per modulare il comportamento dei batteri, per studiare la fisiologia dei batteri e delle interazioni microbiche, e di agire come potenzialmente nuovi ponteggi per i composti terapeutici futuri.

<table><tbody><tr><td>Spectrophotometer</td><td></td><td></td><td>Any spectrophotomer capable of measuing OD&lt;sub&gt;600 &lt;/sub&gt;absorbance values.</td></tr><tr><td>Luria broth, Lennox</td><td>VWR</td><td>80017-484</td><td>Alternative media sources may be necessary.</td></tr><tr><td>Glass beads, 3 mm</td><td>VWR</td><td>26396-508</td><td></td></tr><tr><td>Gel loading tips, round</td><td>VWR</td><td>29442-666</td><td></td></tr><tr><td>Glass rods</td><td>VWR</td><td>59060-069</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence dissecting stereoscope</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary.</td></tr></tbody></table>

using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions

In natura, i batteri esistono raramente in isolamento, sono invece circondati da una gamma diversificata di altri microrganismi che alterano l&#39;ambiente locale secernendo metaboliti. Questi metaboliti hanno il potenziale di modulare la fisiologia e la differenziazione dei loro vicini microbiche e sono probabilmente fattori importanti per la creazione e il mantenimento di comunità microbiche complesse. Abbiamo sviluppato uno schermo coculture basato sulla fluorescenza per identificare tali interazioni microbiche mediate chimicamente. La schermata richiede la combinazione di un trascrizionale ceppo reporter fluorescente con i microbi ambientali su supporti solidi e permettendo le colonie di crescere in co-coltura. Il reporter trascrizionale fluorescente è progettato in modo che il ceppo batterico scelta fluorescente quando si esprime un particolare fenotipo di interesse (cioè la formazione di biofilm, sporulazione, la produzione di fattore di virulenza, ecc.) Lo screening viene effettuata in condizioni di crescita where questo fenotipo non è espressa (e quindi il ceppo giornalista è tipicamente non fluorescente). Quando un microbo ambientale secerne un metabolita che attiva questo fenotipo, si diffonde attraverso la agar e attiva il costrutto reporter fluorescente. Questo permette al inducendo--metabolita produzione microbo da rilevare: sono le colonie non fluorescente più prossimali alle colonie fluorescenti. Così, questa schermata permette l&#39;identificazione di microbi ambientali che producono metaboliti diffusibili che attivano una particolare risposta fisiologica in un ceppo giornalista. Questa pubblicazione illustra come: a) selezionare adeguate condizioni di co-coltura di screening, b) preparare il giornalista e microbi ambientali per lo screening, c) eseguire lo schermo co-coltura, d) isolare putativo indurre gli organismi, ed e) confermano la loro attività in uno schermo secondario. Abbiamo sviluppato questo metodo per schermare per gli organismi del suolo che attivano biofilm matrice-produzione in Bacillus subtilis </em&gt;, ma abbiamo anche discutere le considerazioni per l&#39;applicazione di questo approccio ad altri batteri geneticamente trattabili.

Questo schermo è stato utilizzato per identificare organismi del suolo secernono sostanze che alterano la fisiologia di B. subtilis. I risultati qui descritti concentrano sul tipo di cellula matrice produttrici di B. subtilis, che produce la proteina e esopolisaccaride che sono necessari per la formazione di biofilm robusta in questo batterio. Abbiamo scelto il promotore dell&#39;operone Tapa-sipW-ATAS per il nostro costrutto reporter fluorescente (P tapa-YFP). Questo oper...

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Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

I batteri producono composti secreti che hanno il potenziale per influenzare la fisiologia dei loro vicini microbiche. Qui si descrive una schermata co-coltura che permette la rilevazione di tali interspecie interazioni mediate chimicamente mescolando microbi del suolo con fluorescenti ceppi giornalista trascrizionali di Bacillus subtilis su supporti solidi.

Utilizzo di co-coltura per rilevare chimicamente mediata interspecie Interazioni

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

using-coculture-to-detect-chemically-mediated-interspecies

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

13.5K Views.  University of North Carolina at Chapel Hill.  I batteri producono composti secreti che hanno il potenziale per influenzare la fisiologia dei loro vicini microbiche. Qui si descrive una schermata co-coltura che permette la rilevazione di tali interspecie interazioni mediate chimicamente mescolando microbi del suolo con fluorescenti ceppi giornalista trascrizionali di Bacillus subtilis su supporti solidi. 

Video: Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with the goal of examining the ecological functions of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. The result has been a progression of protocols that have increasingly refined the ecological relevance of the experimental approach. Here we present the most up-to-date version of a fish-feeding laboratory bioassay that enables investigators to assess the antipredatory activity of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. Organic metabolites of all polarities are exhaustively extracted from the tissue of the target organism and reconstituted at natural concentrations in a nutritionally appropriate food matrix. Experimental food pellets are presented to a generalist predator in laboratory feeding assays to assess the antipredatory activity of the extract. The procedure described herein uses the bluehead, Thalassoma bifasciatum, to test the palatability of Caribbean marine invertebrates; however, the design may be readily adapted to other systems. Results obtained using this laboratory assay are an important prelude to field experiments that rely on the feeding responses of a full complement of potential predators. Additionally, this bioassay can be used to direct the isolation of feeding-deterrent metabolites through bioassay-guided fractionation. This feeding bioassay has advanced our understanding of the factors that control the distribution and abundance of marine invertebrates on Caribbean coral reefs and may inform investigations in diverse fields of inquiry, including pharmacology, biotechnology, and evolutionary ecology.

This bioassay employs a model predatory fish to assess the presence of feeding-deterrent metabolites from organic extracts of the tissues of marine organisms at natural concentrations using a nutritionally comparable food matrix.

Un pesce-alimentare Laboratorio Bioassay per valutare l&#39;attività di antipredatory Secondary metaboliti dai tessuti di organismi marini

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with ...

Ricerca

Ambiente

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our entire society's ability to treat systemic infections. In the United States alone, antibiotic-resistant infections kill approximately 23,000 people a year and cost around 20 billion USD in additional healthcare. One approach to combat antimicrobial resistance is combination therapy, which is particularly useful in the critical early stage of infection, before the infecting organism and its drug resistance profile have been identified. Many antimicrobial treatments use combination therapies. However, most of these combinations are additive, meaning that the combined efficacy is the same as the sum of the individual antibiotic efficacy. Some combination therapies are synergistic: the combined efficacy is much greater than additive. Synergistic combinations are particularly useful because they can inhibit the growth of antimicrobial drug resistant strains. However, these combinations are rare and difficult to identify. This is due to the sheer number of molecules needed to be tested in a pairwise manner: a library of 1,000 molecules has 1 million potential combinations. Thus, efforts have been made to predict molecules for synergy. This article describes our high-throughput method for predicting synergistic small molecule pairs known as the Overlap2 Method (O2M). O2M uses patterns from chemical-genetic datasets to identify mutants that are hypersensitive to each molecule in a synergistic pair but not to other molecules. The Brown lab exploits this growth difference by performing a high-throughput screen for molecules that inhibit the growth of mutant but not wild-type cells. The lab's work previously identified molecules that synergize with the antibiotic trimethoprim and the antifungal drug fluconazole using this strategy. Here, the authors present a method to screen for novel synergistic combinations, which can be altered for multiple microorganisms.

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Synergistic drug combinations are difficult and time-consuming to identify empirically. Here, we describe a method for identifying and validating synergistic small molecules.

Identificazione di High-throughput di combinazioni di farmaci sinergici con il metodo2 di sovrapposizione

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

Genetica

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has relevant health and economic consequences. Many cyanobacterial strains are toxin producers, and only a few cells are necessary to induce irreparable damage to the environment. Therefore, water-body authorities and administrations require rapid and efficient early-warning systems providing reliable data to support their preventive or curative decisions. This manuscript reports an experimental protocol for the in-field detection of toxin-producing cyanobacterial strains by using an antibody microarray chip with 17 antibodies (Abs) with taxonomic resolution (CYANOCHIP). Here, a multiplex fluorescent sandwich microarray immunoassay (FSMI) for the simultaneous monitoring of 17 cyanobacterial strains frequently found blooming in freshwater ecosystems, some of them toxin producers, is described. A microarray with multiple identical replicates (up to 24) of the CYANOCHIP was printed onto a single microscope slide to simultaneously test a similar number of samples. Liquid samples can be tested either by direct incubation with the antibodies (Abs) or after cell concentration by filtration through a 1- to 3-&#956;m filter. Solid samples, such as sediments and ground rocks, are first homogenized and dispersed by a hand-held ultrasonicator in an incubation buffer. They are then filtered (5 - 20 &#956;m) to remove the coarse material, and the filtrate is incubated with Abs. Immunoreactions are revealed by a final incubation with a mixture of the 17 fluorescence-labeled Abs and are read by a portable fluorescence detector. The whole process takes around 3 h, most of it corresponding to two 1-h periods of incubation. The output is an image, where bright spots correspond to the positive detection of cyanobacterial markers.

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.

Protocollo sperimentale per il rilevamento<em&gt; cianobatteri</em&gt; In campioni liquidi e solidi con un anticorpo Microarray chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has ...

In Situ Chemotaxis Assay to Examine Microbial Behavior in Aquatic Ecosystems

Microbial behaviors, such as motility and chemotaxis (the ability of a cell to alter its movement in response to a chemical gradient), are widespread across the bacterial and archaeal domains. Chemotaxis can result in substantial resource acquisition advantages in heterogeneous environments. It also plays a crucial role in symbiotic interactions, disease, and global processes, such as biogeochemical cycling. However, current techniques restrict chemotaxis research to the laboratory and are not easily applicable in the field. Presented here is a step-by-step protocol for the deployment of the in situ chemotaxis assay (ISCA), a device that enables robust interrogation of microbial chemotaxis directly in the natural environment. The ISCA is a microfluidic device consisting of a 20 well array, in which chemicals of interest can be loaded. Once deployed in aqueous environments, chemicals diffuse out of the wells, creating concentration gradients that microbes sense and respond to by swimming into the wells via chemotaxis. The well contents can then be sampled and used to (1) quantify strength of the chemotactic responses to specific compounds through flow cytometry, (2) isolate and culture responsive microorganisms, and (3) characterize the identity and genomic potential of the responding populations through molecular techniques. The ISCA is a flexible platform that can be deployed in any system with an aqueous phase, including marine, freshwater, and soil environments.

Presented here is the protocol for an in situ chemotaxis assay, a recently developed microfluidic device that enables studies of microbial behavior directly in the environment.

In Situ Chemotaxis Assay per esaminare il comportamento microbico negli ecosistemi acquatici

Microbial behaviors, such as motility and chemotaxis (the ability of a cell to alter its movement in response to a chemical gradient), are widespread ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

Avidità-based Screening Interaction extracellulare (AVEXIS) per il rilevamento scalabile di bassa affinità extracellulare del recettore-ligando interazioni

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Biologia

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. This method employs stable plasmids that allow each population to be differentially tagged with distinct antibiotic resistance capabilities and fluorescent proteins for selection and visual discrimination of each population, respectively. Here, we describe the preparation and coincubation of competing Vibrio fischeri strains, fluorescence microscopy imaging, and quantitative data analysis. This approach is simple, yields quick results, and can be used to determine whether one population kills or inhibits the growth of another population, and whether competition is mediated through a diffusible molecule or requires direct cell-cell contact. Because each bacterial population expresses a different fluorescent protein, the assay permits the spatial discrimination of competing populations within a mixed colony. Although the described methods are performed with the symbiotic bacterium V. fischeri using conditions optimized for this species, the protocol can be adapted for most culturable bacterial isolates.

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

Bacteria encode diverse mechanisms for engaging in interbacterial competition. Here, we present a culture-based protocol for characterizing competitive interactions between bacterial isolates and how they impact the spatial structure of a mixed population.

Coincubation Valutazione per quantificare le interazioni competitive tra Vibrio fischeri Isolates

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. ...

Immunologia e infezioni

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.

Analisi di cocultura ad alta produttività per l'analisi delle interazioni microbiche

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many ...

Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method has been developed for observing interspecies interactions between two bacterial pathogens. The use of this method to interrogate interactions between a motile Gram-negative pathogen, Pseudomonas aeruginosa and a non-motile Gram-positive pathogen, Staphylococcus aureus is demonstrated here. This protocol consists of co-inoculating each species between a coverslip and an agarose pad, which maintains the cells in a single plane and allows for visualization of bacterial behaviors in both space and time.
Furthermore, the time-lapse microscopy demonstrated here is ideal for visualizing the early interactions that take place between two or more bacterial species, including changes in bacterial species motility in monoculture and in coculture with other species. Due to the nature of the limited sample space in the microscopy setup, this protocol is less applicable for studying later interactions between bacterial species once cell populations are too high. However, there are several different applications of the protocol which include the use of staining for imaging live and dead bacterial cells, quantification of gene or protein expression through fluorescent reporters, and tracking bacterial cell movement in both single species and multispecies experiments.

This live-bacterial cell imaging protocol allows for visualization of interactions between multiple bacterial species at the single-cell level over time. Time-lapse imaging allows for observation of each bacterial species in monoculture or coculture to interrogate interspecies interactions in multispecies bacterial communities, including individual cell motility and viability.

Visualizzazione cinetica delle interazioni batteriche interspecie a uni cell

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method ...

<meta charset="utf8"></head><body>Protocollo per la co-coltura di cianobatteri secernenti saccarosio con partner fungini

Assembly and Quantification of Co-Cultures Combining Heterotrophic Yeast with Phototrophic Sugar-Secreting Cyanobacteria

With the increasing demand for sustainable biotechnologies, mixed consortia containing a phototrophic microbe and heterotrophic partner species are being explored as a method for solar-driven bioproduction. One approach involves the use of CO2-fixing cyanobacteria that secrete organic carbon to support the metabolism of a co-cultivated heterotroph, which in turn transforms the carbon into higher-value goods or services. In this protocol, a technical description to assist the experimentalist in the establishment of a co-culture combining a sucrose-secreting cyanobacterial strain with a fungal partner(s), as represented by model yeast species, is provided. The protocol describes the key prerequisites for co-culture establishment: Defining the media composition, monitoring the growth characteristics of individual partners, and the analysis of mixed cultures with multiple species combined in the same growth vessel. Basic laboratory techniques for co-culture monitoring, including microscopy, cell counter, and single-cell flow cytometry, are summarized, and examples of nonproprietary software to use for data analysis of raw flow cytometry standard (FCS) files in line with FAIR (Findable, Accessible, Interoperable, Reusable) principles are provided. Finally, commentary on the bottlenecks and pitfalls frequently encountered when attempting to establish a co-culture with sugar-secreting cyanobacteria and a novel heterotrophic partner is included. This protocol provides a resource for researchers attempting to establish a new pair of co-cultured microbes that includes a cyanobacterium and a heterotrophic microbe.

<meta charset="utf8"></head><body>Assemblaggio e quantificazione di co-colture che combinano lieviti eterotrofi con cianobatteri fototrofi secernenti zucchero

This protocol provides a comprehensive guideline for the setup and quantitative monitoring of co-cultures, including photoautotrophic sugar-secreting cyanobacteria and heterotrophic yeasts.

Assemblaggio e quantificazione di co-colture che combinano lieviti eterotrofi con cianobatteri fototrofi secernenti zucchero

With the increasing demand for sustainable biotechnologies, mixed consortia containing a phototrophic microbe and heterotrophic partner species are being ...

Utilizzo di co-coltura per rilevare chimicamente mediata interspecie Interazioni

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Un pesce-alimentare Laboratorio Bioassay per valutare l'attività di antipredatory Secondary metaboliti dai tessuti di organismi marini

Identificazione di High-throughput di combinazioni di farmaci sinergici con il metodo² di sovrapposizione

Protocollo sperimentale per il rilevamento

In Situ Chemotaxis Assay per esaminare il comportamento microbico negli ecosistemi acquatici

Avidità-based Screening Interaction extracellulare (AVEXIS) per il rilevamento scalabile di bassa affinità extracellulare del recettore-ligando interazioni

Coincubation Valutazione per quantificare le interazioni competitive tra Vibrio fischeri Isolates

Analisi di cocultura ad alta produttività per l'analisi delle interazioni microbiche

Visualizzazione cinetica delle interazioni batteriche interspecie a uni cell

Assemblaggio e quantificazione di co-colture che combinano lieviti eterotrofi con cianobatteri fototrofi secernenti zucchero

Assemblaggio e quantificazione di co-colture che combinano lieviti eterotrofi con cianobatteri fototrofi secernenti zucchero