加えて、我々は彼らの優れた技術サポートのために人間の心房組織とクラウディアLiebetrau、カトリンKupserとラモナナーゲルの提供のためにハイデルベルク大学で心臓外科医に感謝します。のCa 2 +トランジェント測定の確立中に彼の役立つ提案やアドバイスのためにもアンディ·W·トラフォードに感謝します。彼らは、細胞電気生理学と心筋細胞分離における基本的なテクニックやスキルを学ぶために私たちを提供する機会をドレスデン工科大学：著者は、薬理学および毒物学の部門（ウルスラレイブンズ頭）のメンバーに彼らの最も深い感謝の意を表したい。 著者の研究は、ドイツ研究財団（Do769/1-1-3）、心房細動コンピテンスネットワークを通じて教育研究のドイツ連邦環境省（01Gi0204）と循環器病研究のためのドイツ語センターを通じて欧州連合によってサポートされていますEuの心房細動におけるトランスレーショナルリサーチのためropeanネットワーク（EUTRAF、FP7-HEALTH-2010、大規模な統合プロジェクト、提案番号261057）および欧州·北米の心房細動·リサーチ·アライアンス（ENAFRA）財団Leducq（07CVD03）の付与。 ビデオファイルに示す概略図はセルヴィエ医療技術を用いて製造された。

実験プロトコルは、ローカル倫理委員会によって承認される必要があり、すべての患者は書面によるインフォームドコンセントを与える必要があります。我々の研究は、ハイデルベルク大学（＃2011-216N-MA）、医学部マンハイムの倫理委員会によって承認され、人類の福祉のためにすべての、制度的、国内および国際的なガイドラインに準拠して行った。すべての患者は書面によるインフォームドコンセントを与えた。 0。ヒト心房組織の取得心肺バイパス移植のための心臓切開手術を受ける患者におけるルーチンカニュレーション手順の間、右心耳の先端部は、通常、除去され、心房心筋細胞の単離に使用することができる。筋細胞Cを防止、BDM、収縮抑制剤、切除後の組織サンプルは、2,3 -ブタンジオンモノオキシムを（ 表I含む滅菌のCa 2 +を含まない輸送溶液を50ミリリットルファルコンチューブにすぐに転送されますontracture）。 30と45分の間の輸送時間で、我々は孤立した心房心筋細胞の数と質の両方に対する冷却または酸素化の明確な利点を認識しませんでした。研究室への一般的な輸送にはできるだけ迅速にする必要があります。長い輸送時間が避けられない場合は、酸素溶液中で4℃輸送℃で有利かもしれない。 1。 Prearrangements <ol><li>ジャケット付ビーカー（ 表II）の温度を制御thermocirculator、スイッチオン。ビーカー内の温度が37℃に等しいことを確認してください全体の分離プロセス全体ビーカー内の温度を一定に維持するために、ガラス蓋付きビーカーをカバーしています。 </li><li> 3ガラス製ビーカーにコラゲナーゼIおよびプロテアーゼXXIVを秤量し、室温で保管してください。酵素は、使用直前に希釈することができる。 </li><li>のCa 2 20mlのを保存+ 4でペトリ皿に自由溶液℃の</li><li>のCa 2ストア250ミリリットル37℃の水浴中で+自由溶液℃に</li></ol> 2。ティッシュの清掃<ol><li>ペトリ皿（〜直径10cm）に輸送ソリューションと一緒に組織サンプルを転送し、大体ハサミを使用して脂肪組織を削除します。 </li><li>組織試料を秤量する。 200〜600 mgの細胞単離のために使用される。残りの組織が保存生化学分析のために液体窒素中で凍結することができる。 </li><li> 20ミリリットルのCa 2 + 4で無料のソリューション°Cを含むペトリ皿に組織サンプルを転送し（ステップ1.3を参照）、約1mm 3サイズでの小さなチャンクに組織サンプルをチョップ。 </li><li>次の手順は、100％O 2、37℃で、連続処刑の下に実行されるべきである。ピペットチップは、強力な泡立ちを避けるために、連続した空気流を生成するために、酸素チューブに配置することができる。 </li><li>中のCa 2 +を含まない溶液と一緒にティッシュの塊を転送ジャケットビーカーへと磁気攪拌棒で約3分間注意深くかき混ぜる。 </li><li>攪拌を停止し、組織の塊は数秒のために落ち着くことができます。ナイロンメッシュ（200ミクロン、 表II）を通して上清を慎重にひずみ。メッシュから鉗子を使用してビーカーに拘束され、組織の塊を返します。 </li><li>リフィルのCa 2ビーカー+送料液及び洗浄工程を2.4と2.5を2回繰り返す。 </li></ol> 3。最初の酵素消化<ol><li>コラゲナーゼやプロテアーゼを含んだ20ミリリットル酵素溶液E1（ 表I）で組織の塊を再停止し、10分間注意深くかき混ぜる。 </li><li> 20μMのCa 2 +の最終濃度を得るために、10のCaCl 2溶液を40μLを加える。 </li><li> 35分後には、組織の塊のほとんどがビーカーに残るような方法でナイロンメッシュ（200ミクロン、 表II）を注意深く上清を負担。残りを返すメッシュからビーカーに組織塊を雨が降った。 </li></ol> 4。第二酵素消化<ol><li>私はわずか20ミリリットル酵素溶液E2含むコラゲナーゼ（ 表I）で再び組織の塊を再懸濁します。 20μMのCa 2 +の最終濃度を得るために、すぐに10のCaCl 2溶液を40μLを加える。 </li><li>第二消化中さらに時折組織血栓をチョップするはさみを使用しています。 </li><li> 5分後、細胞の解離をチェックするパスツールピペットを使用してサンプルを取る。棒状、横紋心筋が表示されるまで、この2〜3分ごとに繰り返します。 </li><li>攪拌を停止し、組織の塊が約20〜30秒間、落ち着くことができます。 </li><li> 50ミリリットルファルコンチューブ（チューブ）にナイロンメッシュ（200ミクロン、 表II）を注意深く上清を負担。メッシュからビーカーに拘束され、組織の塊を返します。 </li><li> 20ミリリットルストラでビーカー内の組織チャンクを再懸濁さらにGE溶液（ 表I）10とディスペンサーと20ミリリットル血清ピペットを用いて穏やかな機械的粉砕により細胞を解離する。気泡が細胞の生存と品質に有害であるので、気泡の形成を避けるようにしてください。 </li><li> 50ミリリットルファルコンチューブ（チューブB）にナイロンメッシュ（200ミクロン、 表II）を注意深く上清を負担。 </li></ol> 5。決勝のCa 2 +濃度の最終準備と調整<ol><li> 10分間、95×gでファルコンチューブAとB（ステップ4.5および4.7を参照）の両方を遠心します。 </li><li>吸引により慎重に両方のチューブから上清を取り除きます。ペレットを乱さないようにしてください。上清を捨てる。 </li><li> 1.5 mlのストレージソリューション（ 表I）各（室温）の両方でペレットを再懸濁する。 </li><li> 2回ずつファルコン〜10のCaCl 2溶液の7.5μLを加え、慎重にかき混ぜる。各ステップの後に10分間インキュベートする。 </li><li>0.2mMの最終のCa 2 +濃度を得るために10のCaCl 2溶液15μlのを追加します。 </li></ol> 6。蛍光灯のCa 2 +指示薬フルオ-3 AM（ 図1）と筋細胞のロード<ol><li> 2 mlのマイクロ遠心チューブ（エッペンドルフチュー​​ブ）内に細胞懸濁液1.5mlの（チューブおよび/またはチューブB）に移す。 </li><li>次の手順は、蛍光のCa 2 +インジケーターフルオ-3の光感度を考慮して実行する必要があります。 </li><li>プルロニックF-127（ 表III）原 ​​液（20％無水DMSO中w / v）で取得するための44μlのフルオ-3の膜透過性のアセトキシメチルエステル誘導体（フルオ-3 AM、 表III）50μgのを溶かす1mMのフルオ3、最大で1週間、-20℃で保存することができる原液、AM。 </li><li> 15μlのを追加フルオ-3は1.5の細胞懸濁液（ステップ6.1を参照）を振とうを含むマイクロチューブに原液AM慎重に。 </li><li>光学的に不透明なボックスで10分間細胞懸濁液をインキュベートする。 </li><li>簡単に言えば、約6,000 rpmで遠心。 </li><li>上清を捨て、1.5 mlの浴溶液（ 表IV）でペレットを再懸濁する。 </li><li>実験を開始する前に脱エステル化のために約30分間、細胞懸濁液にしておきます。 </li></ol> 7。同時パッチクランプと落射蛍光Ca 2 +の測定パッチクランプ測定は、この見直しの主要な話題ではないので、我々はこの技術の深さの説明に多くを提供する他の出版物への興味を持った読者を参照してください。11-14完全を期すために、我々は測定するためのプロトコルの簡単な要約を提供する活動電位またはL型Ca 2 +電流は、同時のCa 2 +過渡録音と一緒に両方。 実験中筋細胞を風呂solutiと37℃で灌流さ急速灌流システム（Octaflow IITM、ALA科学機器、NY）を用いて、（ 表IV）で。電圧クランプ実験のために、K +電流を浴溶液に4 -アミノピリジン（5ミリモル/ L）及び塩化バリウム（0.1ミリモル/ L）を添加することによってブロックされる。ホウケイ酸ガラス微小電極が使用され、ピペット溶液（ 表V）で満たされたときMΩ2-5の抵抗を傾けるしている必要があります。フルオ-3に加えて（ステップ6を参照）筋細胞のローディングAM、フルオ3はピペット溶液（ 表V）に含まれている。蛍光は488 nmで励起して放出された光は、（&lt;520 nm）での[Ca 2 +] iは仮定に変換されます<img alt="式（1）" fo:content-width="1.540in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1.jpg" /> ここで、k Dフルオ-3（864のn =解離定数M）、F =フルオ-3蛍光;各実験の終了時に得られたF = 最大のCa 2 + -飽和蛍光12の両方の電気信号及び落射蛍光のCa 2 +信号が同時に記録される。活動電位は1.2倍しきい値強度の1ミリ秒電流パルスを使用して、現在のクランプモードで0.5 Hzで刺激される。 L型Ca 2 +電流は、100ミリ秒に続いて、高速のNa +電流を不活性化するために-40 mVまで-80 mVの、100ミリ秒ランプパルスの保持電位を用いた電圧クランプモードで測定されている0.5 Hzで+10 mVのにテストパルス。

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	<li>Wakili, R., Voigt, N., Kaab, S., Dobrev, D., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+molecular+pathophysiology+of+atrial+fibrillation.">Recent advances in the molecular pathophysiology of atrial fibrillation.</a> J. Clin. Invest. 121, 2955-2968 (2011).</li><li>Margaret, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsation,+migration+and+division+in+dissociated+chick+embryo+heart+cells+in+vitro.">Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro.</a> Journal of Experimental Zoology. 128, 573-589 (1955).</li><li>Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. 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Res. 66, 1277-1286 (1990).</li><li>Hove-Madsen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrial+fibrillation+is+associated+with+increased+spontaneous+calcium+release+from+the+sarcoplasmic+reticulum+in+human+atrial+myocytes.">Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes.</a> Circulation. 110, 1358-1363 (2004).</li><li>Molina, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+adenosine+monophosphate+phosphodiesterase+type+4+protects+against+atrial+arrhythmias.">Cyclic adenosine monophosphate phosphodiesterase type 4 protects against atrial arrhythmias.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 59, 2182-2190 (2012).</li></ol>

ワージントン生化学社は、ビデオファイルの生産コストをカバーすることによって、この出版物を支持した。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公表することを決定、または原稿の準備で何の役割を持っていた。

ここでは、心臓切開手術を受けた患者から得られた右心房付属器からのヒト心房筋細胞の単離のための方法が記載されている。細胞質のCa 2の測定のために、これらの心筋細胞を使用するために、我々は+貯蔵溶液からEGTAを省略して、以前に記載された方法4-11に適合。 すでに1970年には筋細胞が+消化中のCa 2の存在下で解離しているが、それらのすべては、したがって拘縮および非生存。16,17にあったことが観察された、細胞単離のCa 2 +を含まない溶液中で行われる。しかし、のCa 2の生理的濃度の再導入は急速+ Ca 2 +の流入および細胞死をもたらした。これは、もともとはジマーマンとフルスマンによって灌流心の中で観察されたCa 2 +のパラドックス現象として記載されている。7.0のpHの低下、など、分離培地の18修正&lt;22のCa 2 +パラドックスを防止するために提案されているストレージを含む溶液EGTAで&gt; 19タウリン20又はCa 2 +少量の添加（ステップ3.2および4.1を参照のこと）、21ならびに単離された筋細胞の記憶（商標）17は、しかし、のCa 2 +が EGTAを介してバッファリングのCa 2 +過渡二相崩壊におけるL型Ca 2 +電流誘起のCa 2 +過渡振幅および結果の振幅を減少させることは周知である。23そこで、EGTAを省略典型的なプロパティと相性減衰でのCa 2 +トランジェントを得るために全体の分離プロセス全体。のCa 2から細胞を保護するために+パラドックス我々は、0.2 mMのまで段階的にストレージソリューションの最終のCa 2 +濃度を増加させた。 コラゲナーゼの選択は、おそらく成功した筋細胞分離のための最も重要なステップです。従来のコルagenasesはクロストリジウムヒストリチカムから得られた粗製の製剤であり、他のプロテイナーゼ、polysaccharidasesとリパーゼの数に加えて、コラゲナーゼを含んでいます。彼らの一般組成のコラゲナーゼに基づいて、異なるタイプに細分化されます24ワージントンコラゲナーゼ·タイプIとIIが正常に我々の現在記述されたプロトコルでは、人間の心房筋細胞を単離する。4-10,15,25-30ために使用されてきた私たちは、コラゲナーゼの使用をお勧めします我々はまた、コラゲナーゼタイプIIを使用して生細胞の許容量を得ることができたものの、Iを入力します。しかしながら、単一のコラゲナーゼタイプ内の酵素活動に関する重要なバッチ間変動がある。これらのバリエーションは、慎重なバッチの選択と分離手順を最適化するための様々なバッチのテストが必要。ワージントン生化学株式会社（からオンラインで利用可能なバッチ·選択ツール<a href="http://www.worthington-biochem.com/cls/match.php" target="_blank">http://www.worthington-bio</a>chem.com / CLS / match.php）は、ヒト心房筋細胞を単離するのに適していることが示された組成物で使用可能なバッチを見つけるために使用することができる。現在、我々は、コラゲナーゼは、250 U / mgのコラゲナーゼ活性を345 U / mgでcaseinase活動、2.16 U / mgのクロストリパイン活性および0.48 U / mgのトリプシン活性（ロット＃49H11338）Iを入力してください。 本稿に記載された手順を用いて得られた細胞をパッチクランプ研究のCa 2 +トランジェント測定およびまた両方図15の組合せに対して8時間以内に使用することができ、これらの細胞は電場刺激に応答して細胞の収縮の測定を可能パッチクランプピペットを（未発表の観察）を使用して、または電気刺激。

パッチクランプ法と細胞のCa 2探査による心臓イオンチャネルの電気生理学的特性を研究+異常が孤立した心筋細胞を必要とする処理。これらは通常、消化酵素に対する心臓組織サンプルのインビトロ曝露（コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ペプチダーゼ等）後に得られる。 1955 2で実行可能な心筋細胞の単離の最初の報告以降のプロトコルの多量は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、モルモットおよびヒトを含む様々な種から単心房および心室の心筋細胞を収穫するために開発されている。このレビューでは、人間の心房筋細胞の分離に焦点を当てています。我々はワージントン生化学社、USA（が提供する&quot;ワージントン組織解離ガイド&quot;を参照して他の種からの心筋細胞を単離するための手順について<a href="http://www.tissuedissociation.com" target="_blank">www.tissuedissociation.com</a> ）。 らによって記載されている方法から派生しています。3ここでは、するために以前に公表されたメソッドから構成されている技術は、のステップバイステップの説明を提供パッチクランプ実験のためだけでなく、同時に細胞内Ca 2 +測定のためだけでなく、適切な心房筋細胞を得る。4-11

<table><tbody><tr><td> </td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td>&lt;em&gt;Storage solution&lt;/em&gt;: 1%</td></tr><tr><td>BDM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31550</td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;: 30</td></tr><tr><td>DL-b-Hydroxy-butyric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6501</td><td>&lt;em&gt;Storage solution&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free solution&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Storage solution&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>L-Glutamic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1251</td><td>&lt;em&gt;Storage solution&lt;/em&gt;: 70</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free solution&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Storage solution&lt;/em&gt;: 20</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;: 1.2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free solution&lt;/em&gt;: 1.2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 1.2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Storage solution&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9397</td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free solution&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free solution&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;: 100&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free solution&lt;/em&gt;: 100&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 100</td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86330</td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free solution&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Storage solution&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td><a href="http://www.worthington-biochem.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Worthington</a></td><td>4196</td><td>&lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 286 U/ml</td></tr><tr><td>Protease XXIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8038</td><td>&lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 5 U/ml*</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;: 7.00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free solution&lt;/em&gt;: 7.00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 7.00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Storage solution&lt;/em&gt;: 7.40</td></tr><tr><td>adjusted with</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;: 1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free solution&lt;/em&gt;: 1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Storage solution&lt;/em&gt;: 1 M KOH</td></tr><tr><td colspan="4">Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Table I. Solutions.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nylon mesh (200 &amp;#956;m)</td><td>VWR-Germany</td><td>510-9527</td><td></td></tr><tr><td>Jacketed reaction beaker</td><td>VWR</td><td>KT317000-0050</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Table II. Specific equipment.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl-sulphoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3 AM (special packaging)</td><td>Invitrogen</td><td>F-1242</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-aminopyridine*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A78403</td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>BaCl2*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342920</td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 0.1</td></tr><tr><td>CaCl2 &amp;#215; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 2</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 4</td></tr><tr><td>MgCl &amp;#215; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 1</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 140</td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761</td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 2</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 7.35</td></tr><tr><td>adjusted with</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 1 M HCl</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Table IV. Bath solution for patch-clamp.&lt;/strong&gt; *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DL-aspartat K+-salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2025</td><td>&lt;em&gt;Pipette solution&lt;/em&gt;: 92</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>&lt;em&gt;Pipette solution&lt;/em&gt;: 0.02</td></tr><tr><td>GTP-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9002</td><td>&lt;em&gt;Pipette solution&lt;/em&gt;: 0.1</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td>&lt;em&gt;Pipette solution&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Pipette solution&lt;/em&gt;: 48</td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>&lt;em&gt;Pipette solution&lt;/em&gt;: 1</td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td>&lt;em&gt;Pipette solution&lt;/em&gt;: 4</td></tr><tr><td>Fluo-3**</td><td>Invitrogen</td><td>F3715</td><td>&lt;em&gt;Pipette solution&lt;/em&gt;: 0.1</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>7.20</td></tr><tr><td>adjusted with</td><td></td><td></td><td>1 M KOH</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Table V. Pipette solution for patch-clamp*. &lt;/strong&gt;*On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of ca2+ transients and membrane currents

パッチクランプ法と心臓細胞のCa 2 +の処理異常の探査と心臓イオンチャネルの電気生理学的特性の研究では、孤立した心筋細胞を必要とします。さらに、これらの技術を用いて患者から心筋細胞を調査する可能性は、例えば心房細動（AF）などの心臓疾患の分子基盤を解明する貴重な要件である。1は、ここでは両方に適しているヒト心房筋細胞の単離のための方法を記載パッチクランプ研究と細胞内Ca 2 +濃度の同時測定。まず、開胸手術を受けた患者から得られた右心耳は、小さな組織の塊（ &quot;チャンク法&quot;）に切断し、+を含まない溶液のCa 2で洗浄されています。その後、組織の塊を20μMのCa 2 +とソリューションを含むコラゲナーゼおよびプロテアーゼで消化されています。その後、隔離された筋細胞はハーヴです組織懸濁液の濾過と遠心分離によりSTED。最後に、セル記憶溶液中のCa 2 +濃度を0.2mMの段階的に調整される。我々は簡単に+とCa 2 +の分離の過程でバッファリングし、また活動電位と膜電流の代表的な録音を提供し、両方一緒に同時のCa 2 +トランジェント測定、これらの孤立した筋細胞で行わでのCa 2の意味を議論する。

図2Aは、単離されたヒト右心房筋細胞から3つの代表的な例を示しています。我々はCellFinder顕微鏡スライド（上の細胞懸濁液（ステップ5.5）10μlのピペットで細胞収率定量化する<a href="http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html" target="_blank">http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.htmlを</a> ）。 16.5±3.1 cells/10液（nは= 29）対5.1±2.3 cells/10μL： 図2Bにおいて平均細胞の収量は明らかに慢性AF（CAF）が低いセルの利回りの傾向患者サンプル（チューブがあることを示すそれぞれSRとCAFで（N = 10）、P &lt;0.05;チューブB：17.9±3.9 cells/10液（N = 29）対5.9±SRとCAFで2.0 cells/10液（N = 9）、それぞれに、p = 0.107）。 活動電位の測定および細胞質のCa 2 +過渡電流の同時録画の代表例を図3に示されている。調べた細胞、Tの約90％で彼はアクション電位トリガのCa 2 +放出が明確と通常細胞の収縮を引き起こす。既報の通り、細胞の整合性のために認められた指標である静止膜電位は、-73.9平均約±2.7 mVの（N = 10分の23筋/患者）及び-77.7±1.8 mVの（N = 8分の19筋/患者）SRとCAFであった（P&gt; 0.05）。15 図4は、電位依存性L型Ca 2 +電流と細胞質のCa 2 +トランジェントの代表、同時録画を示しています。非選択的β-アドレナリン受容体アゴニストイソプレナリン（1μM）の適用は、無傷のβ-アドレナリン作動性シグナル伝達カスケードを示唆し、私はCa、Lと細胞質のCa両方の振幅2 +トランジェントを向上させます。 <img alt="図1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1.jpg" /> Figure 1。筋のFluo-3のフローチャートは、（ステップ6.1から6.5を参照）プロトコルをロードしています。 M / V、質量/体積。 <img alt="図2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2.jpg" /> 図2。ストレージソリューションの1時間後、単離されたヒト右心房筋細胞。Bは、ストレージソリューションのセル10μlに数え細胞収率の±SEM（ステップ5.5を参照）を意味します。 nは、各グループ内製剤の数を指す。 *はp &lt;0.05。 <img alt="図3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3.jpg" /> アクション電位トリガのCa 2洞調律から心房筋細胞における+トランジェント（CAT）とCHRの図3。代表レコーディングプロピオン心房細動の患者。トップ：刺激（0.5ヘルツ）に使用注入電流膜（I M）。下：膜電位（V M）、およびトリガ猫（下）の同時記録。 （フォークトらの許可を得て再プロット。2012）15 <img alt="図4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4.jpg" /> L型Ca 2上イソプレナリン（1μM）の効果図4代表的録音+現在のトリガ型のCa 2洞調律、慢性心房細動の患者からの心房筋細胞における+トランジェント（CAT）。トップ：電圧クランププロトコル（0.5 Hz）です。下：現在の総純膜の同時記録（I M）、主にL型Ca 2 +電流（中央）とトリガ猫（下）を反映している。 （フォークトから許可を得て再プロット、ら2012年）15 <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table1.jpg" alt="表1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table1highres.jpg" /> 表Iソリューション。 <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table2.jpg" alt="表2" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table2highres.jpg"/> 表II。特定の機器。 <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table3.jpg" alt="表3" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table3highres.jpg"/> 表III。フルオ-3と筋細胞のローディングのための物質がAM。 <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table4.jpg" alt="表4" fo:conteNT-幅= &quot;2.5インチ&quot;のfo：SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50235/50235table4highres.jpg&quot; /&gt; 表IV。パッチクランプ用浴溶液。 <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table5.jpg" alt="表5" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table5highres.jpg"/> パッチクランプ*表V.ピペット溶液。

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Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

我々は、細胞内Caために使用することができ、ヒト心房筋細胞の単離を記載<sup&gt; 2 +</sup電気生理学的パッチクランプ研究との組み合わせで&gt;測定。

カルシウムの同時測定のための人間の心房筋細胞の分離<sup&gt; 2 +</sup&gt;過渡と膜電流

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

isolation-human-atrial-myocytes-for-simultaneous-measurements-ca2

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

20.3K ビュー.  University of Duisburg-Essen. 我々は、細胞内Caために使用することができ、ヒト心房筋細胞の単離を記載 2 +測定。

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Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

離と新鮮な外科的試料からのヒト心室の心筋細胞の機能解析

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

医学

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

マウス心房と心室の心筋細胞における分離とKvチャンネル録音

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

生物学

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

アイソレーション、文化、および成体マウスCardiomyoctyesの機能解析

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of metabolic syndrome (MetS)-related heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF). The prevalence of MetS-related HFpEF is rising, and atrial cardiomyopathies associated with atrial remodeling and atrial fibrillation are clinically highly relevant as atrial remodeling is an independent predictor of mortality. Studies with isolated single-cell cardiomyocytes are frequently used to corroborate and complement in vivo findings. Circulatory vessel rarefication and interstitial tissue fibrosis pose a potentially limiting factor for the successful single-cell isolation of ACMs from animal models of this disease.
We have addressed this issue by employing a device capable of manually regulating the intraluminal pressure of cardiac cavities during the isolation procedure, substantially increasing the yield of morphologically and functionally intact ACMs. The acquired cells can be used in a variety of different experiments, such as cell culture and functional Calcium imaging (i.e., excitation-contraction-coupling).
We provide the researcher with a step-by-step protocol, a list of optimized solutions, thorough instructions to prepare the necessary equipment, and a comprehensive troubleshooting guide. While the initial implementation of the procedure might be rather difficult, a successful adaptation will allow the reader to perform state-of-the-art ACM isolations in a rat model of MetS-related HFpEF for a broad spectrum of experiments.

Here, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes from a rat model of metabolic syndrome-related heart failure with preserved ejection fraction. A manual regulation of intraluminal pressure of cardiac cavities is implemented to yield functionally intact myocytes suitable for excitation-contraction-coupling studies.

保存された駆出率とメタボリック症候群関連心不全ラットモデルから心房の心筋細胞の単離

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents responsible for the action potential can cause pro-arrhythmic substrates that underlie arrhythmias, such as atrial fibrillation, which are highly prevalent in many conditions and disease states. Isolating adult mouse atrial cardiomyocytes for use in patch-clamp experiments has greatly advanced our knowledge and understanding of the cellular electrophysiology in the healthy atrial myocardium and in the setting of atrial pathophysiology. In addition, studies using genetic mouse models have elucidated the role of a vast array of proteins in regulating atrial electrophysiology. Here we provide a detailed protocol for the isolation of cardiomyocytes from the atrial appendages of adult mice using a combination of enzymatic digestion and mechanical dissociation of these tissues. This approach consistently and reliably yields isolated atrial cardiomyocytes that can then be used to characterize cellular electrophysiology by measuring action potentials and ionic currents in patch-clamp experiments under a number of experimental conditions.

This protocol is used to isolate single atrial cardiomyocytes from the adult mouse heart using a chunk digestion approach. This approach is used to isolate right or left atrial myocytes that can be used to characterize atrial myocyte electrophysiology in patch-clamp studies.

成体マウスからの心房筋細胞の単離

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

培養HL-1心房筋細胞単層の電圧とカルシウムデュアルチャネル光学マッピング

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction and electrical activity. Hence, isolating viable, high-quality cardiomyocytes from the heart is the initial and most crucial experimental step. Comparing the various protocols for isolating the cardiomyocytes of adult mice, the Langendorff retrograde perfusion is the most successful and reproducible method reported in the literature, especially for isolating ventricular myocytes. However, isolating quality atrial myocytes from the perfused heart remains challenging, and few successful isolation reports are available. Solving this complicated problem is extremely important because apart from ventricular disease, atrial disease accounts for a large part of heart diseases. Therefore, further investigations on the cellular level to reveal the mechanisms are warranted. In this paper, a protocol based on the Langendorff retrograde perfusion method is introduced and some modifications in the depth of aorta cannulation and the steps that may affect the digestion process to isolate atrial and ventricular myocytes were simultaneously made. Moreover, the isolated cardiomyocytes are confirmed to be amenable to patch clamp investigation.

This protocol describes modifications of the Langendorff method including the depth of aorta cannulation for simultaneous Isolation of atrial and ventricular myocytes from adult mice.

成体マウスからの心房と心室筋細胞の同時分離のためのランゲンドルフ法の改変

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction ...

Camera-based Measurements of Intracellular [Na+] in Murine Atrial Myocytes

Intracellular sodium concentration ([Na+]i) is an important regulator of intracellular Ca2+. Its study provides insight into the activation of the sarcolemmal Na+/Ca2+ exchanger, the behavior of voltage-gated Na+ channels and the Na+,K+-ATPase. Intracellular Ca2+ signaling is altered in atrial diseases such as atrial fibrillation. While many of the mechanisms underlying altered intracellular Ca2+ homeostasis are characterized, the role of [Na+]i and its dysregulation in atrial pathologies is poorly understood. [Na+]i in atrial myocytes increases in response to increasing stimulation rates. Responsiveness to external field stimulation is therefore crucial for [Na+]i measurements in these cells. In addition, the long preparation (dye-loading) and experiment duration (calibration) require an isolation protocol that yields atrial myocytes of exceptional quality. Due to the small size of mouse atria and the composition of the intercellular matrix, the isolation of high quality adult murine atrial myocytes is difficult. Here, we describe an optimized Langendorff-perfusion based isolation protocol that consistently delivers a high yield of high quality atrial murine myocytes.
Sodium-binding benzofuran isophthalate (SBFI) is the most commonly used fluorescent Na+ indicator. SBFI can be loaded into the cardiac myocyte either in its salt form through a glass pipette or as an acetoxymethyl (AM) ester that can penetrate the myocyte&#8217;s sarcolemmal membrane. Intracellularly, SBFI-AM is de-esterified by cytosolic esterases. Due to variabilities in membrane penetration and cytosolic de-esterification each cell has to be calibrated in situ. Typically, measurements of [Na+]i using SBFI whole-cell epifluorescence are performed using a photomultiplier tube (PMT). This experimental set-up allows for only one cell to be measured at one time. Due to the length of myocyte dye loading and the calibration following each experiment data yield is low. We therefore developed an EMCCD camera-based technique to measure [Na+]i. This approach permits simultaneous [Na+]i measurements in multiple myocytes thus significantly increasing experimental yield.

The intracellular Na+ concentration ([Na+]i) in cardiac myocytes is altered during cardiac diseases. [Na+]i is an important regulator of intracellular Ca2+. We introduce a novel approach to measure [Na+]i in freshly isolated murine atrial myocytes using an electron multiplying charged coupled device (EMCCD) camera and a rapid, controllable illuminator.

Intracellular sodium concentration ([Na+]i) is an important regulator of intracellular Ca2+. Its study provides insight into the activation of the ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly isolated by coronary perfusion with digestive enzymes. However, isolating human cardiomyocytes is challenging because human myocardial specimens usually do not allow for coronary perfusion, and alternative isolation protocols result in poor yields of viable cells. In addition, human myocardial specimens are rare and only regularly available at institutions with on-site cardiac surgery. This hampers the translation of findings from animal to human cardiomyocytes. Described here is a reliable protocol that enables efficient isolation of ventricular myocytes from human and animal myocardium. To increase the surface-to-volume ratio while minimizing cell damage, myocardial tissue slices 300 &#181;m thick are generated from myocardial specimens with a vibratome. Tissue slices are then digested with protease and collagenase. Rat myocardium was used to establish the protocol and quantify yields of viable, calcium-tolerant myocytes by flow-cytometric cell counting. Comparison with the commonly used tissue-chunk method showed significantly higher yields of rod-shaped cardiomyocytes (41.5 &#177; 11.9 vs. 7.89 &#177; 3.6%, p &#60; 0.05). The protocol was translated to failing and non-failing human myocardium, where yields were similar as in rat myocardium and, again, markedly higher than with the tissue-chunk method (45.0 &#177; 15.0 vs. 6.87 &#177; 5.23 cells/mg, p &#60; 0.05). Notably, with the protocol presented it is possible to isolate reasonable numbers of viable human cardiomyocytes (9&#8211;200 cells/mg) from minimal amounts of tissue (&#60;50 mg). Thus, the method is applicable to healthy and failing myocardium from both human and animal hearts. Furthermore, it is possible to isolate excitable and contractile myocytes from human tissue specimens stored for up to 36 h in cold cardioplegic solution, rendering the method particularly useful for laboratories at institutions without on-site cardiac surgery.

Presented is a protocol for the isolation of human and animal ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices. High yields of calcium-tolerant cells (up to 200 cells/mg) can be obtained from small amounts of tissue (&#60;50 mg). The protocol is applicable to myocardium exposed to cold ischemia for up to 36 h.

ビブラートムカット心筋切れ切り切れからヒト心室心筋細胞を分離

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

心房筋細胞、心室筋細胞、および非筋細胞の同時分離と培養

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...

カルシウムの同時測定のための人間の心房筋細胞の分離

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