この作品は、KSSのNSF賞＃0920274およびサウスカロライナ州試験場プロジェクト（SC - 1700340）によってサポートされていました。本論文では、クレムソン大学の試験場の技術的貢献番号5929です。

このプロトコルの全体的なスキームを図1に概説されている。 1。標準曲線とアッセイのためのソリューションの準備<ol><li>ヒドロキシルアミン塩酸の2モル/ Lの溶液100 mLを準備します。ヒドロキシルアミン塩酸塩の13.9グラム（MW 69.49グラム/モル）を秤量し、約50 mLの蒸留-脱イオン水（のddH 2 O）に溶解する。水酸化カリウムペレットまたは濃縮液を用いてpHを7.0に調整する。 100mLのへの最終的なボリュームをもたらす。ソリューションは、最大30日間や4℃で90日まで室温で保存することができます。 </li><li>塩化第二鉄/塩酸溶液100mLを準備する。 13.5グラム塩化第二鉄（MW 270.32グラム/モル）を秤量し、約50 mLののddH 2 Oに溶解41.3 mLの濃塩酸（12.1モル/ L）を追加し、100mLの最終容量にもたらす。塩化第二鉄の最終濃度は0.5モル/ Lと塩酸の終濃度が5モルとなるようになります/ L.溶液を室温で保存されます。 </li><li> trichoroacetic酸1.84モル/ Lの溶液100 mLを準備します。トリクロロ酢酸（MW 163.39グラム/モル）の30.0 gを秤量、のddH 2 Oに溶解し、100mLの最終容量をもたらす。溶液を室温で保存されます。 </li><li> 0.1モル/ Lアセチルリン酸溶液5 mLを準備します。 0.092グラムアセチルリン酸（MW 184.06グラム/モル）を秤量、のddH 2 Oに溶解し、5 mLの最終的なボリュームをもたらす。注しマイクロ遠心チューブ（管当たり0.25 ml）に解決策と、使用時まで-20℃で凍結。解凍した溶液を氷に配置する必要がありますし、約1時間使用することができます。融解されたアセチルリン酸溶液は、再凍結になると、再使用しないでください。 </li><li> ADPの0.1mol / Lの溶液5mlを準備します。 ADP物0.24g（MW 472.5グラム/モル）を秤量、のddH 2 Oに溶解し、5 mLの最終的なボリュームをもたらす。 -20分注しマイクロ遠心チューブ内の溶液（試験管当たり0.5mL）を、凍結° Cまでの使用してください。使用するまで氷上で解凍したソリューションを保管してください。 </li><li>トリスの1モル/ Lの溶液50mlを準備します。 6.06グラムトリス（MW 121.14グラム/モル）を秤量し、40mLののddH 2 Oに溶解塩酸を用いて7.0に溶液のpHを調整し、50 mLの最終的なボリュームをもたらす。室温で保管ソリューション。 </li><li> 1モル/ L塩化マグネシウム溶液10 mLを準備します。 2.03グラムの塩化マグネシウム（MW 203.31グラム/モル）を秤量、のddH 2 Oに溶解し、10 mLまで最終的なボリュームをもたらす。室温でソリューションを保存してください。 </li><li>塩化第二鉄/塩酸溶液及びトリクロロ酢酸溶液の等量を混合して25 mLの開発ソリューションを準備。開発ソリューションは、毎日新しく調製し、室温で保存してください。 </li></ol> 2。アセチルリン酸の標準曲線の作成<ol><li>アセチルリン酸の標準曲線は、アセチルリン酸の既知量を使用して生成されます。 eighに6つの標準曲線tの点が適しています。規格は、0.1〜3ミリモル/ Lの最終濃度に相関する、0.03μモル〜300μLあたり0.9μモルまでの範囲とする300μLの最終容量で100mMトリス溶液中での適切な濃度にアセチルリン酸ストック溶液を希釈する。アセチルリン酸を含まない対照サンプルも準備する必要があります。 </li><li> ℃のヒートブロックで1分間37℃でそれぞれ標準とコントロールをインキュベートする。 </li><li>各規格へのヒドロキシルアミン塩酸塩溶液を3回振って、コントロールとミックス50μLを加える。 60℃のヒートブロックに標準を置き、5分間インキュベートする。 </li><li> 、規格及び制御するための開発溶液100μLを追加して三回振って混合し、色は、室温で少なくとも1分間のために開発することができます。 </li><li> 1分間18,000 × gで遠心機ですべての基準やコントロールを遠心分離します。 </li><li>分光光度計でサンプルを測定分光光度計用のブランクのようなコントロールを使用して、1mLのプラスチックキュベットを用いたT 540nmの。 </li><li>適切なデータ分析とグラフ作成ソフト（例：カレイダ、シナジーソフトウェア）を使用して標準曲線を生成します。 0.99以上のR 2値が望ましいです。データは、アセチルリン酸の存在のμモルに対し、540nmの吸光度としてプロットされます。 </li></ol> 3。酢酸キナーゼ活性のアッセイ<ol><li>説明するソリューションを使用して、0.1mol / Lのトリス緩衝液、10ミリモル/ L塩化マグネシウム、5ミリモル/ L ADP、および2ミリモル/ Lアセチルリン酸の最終濃度を含む反応ミックスを準備する。 10mLの反応混合物は8.2 mLののddH 2 O、1.0 mLのトリス溶液、0.1 mLの塩化マグネシウム溶液、0.5mLのADPのソリューション、および0.2 mLのアセチルリン酸溶液が必要になります。マイクロ遠心チューブに300μlのアリコートで反応ミックスを配布する。動力学的パラメーターと基質濃度の最適化の判定のために、一方の基板にすることができます変化や反応に一定の濃度で開催された他の。 </li><li> 37℃で1分間反応をプレインキュベート℃のヒートブロックインチ</li><li>反応する酵素の所望の量を加え、直ちに37℃のヒートブロックにチューブを返します。また、酵素なしが追加されていないため、コントロールの反応が含まれています。いくつかの反応が行われている場合、特定の時間間隔でチューブに酵素を加える。時間を追跡するようにしてください。 （注：使用する酵素の量は、アセチルリン酸またはADPの基板のすべてが枯渇されないことを保証するために最適化する必要があります - ディスカッションのセクションを参照してください） </li><li> 5分後、各反応と制御、ミックスにヒドロキシルアミン塩酸塩溶液の50μlずつを追加し、60℃のヒートブロックにチューブを置きます。いくつかの反応が実行されている場合、酵素が追加されたとして、これは同じ時間間隔で行われる必要があります。 </li><li> 60℃5分間反応とコントロールをインキュベート℃に</li><li> 100＆を追加します。ムー、各反応の開発ソリューションと制御、混合、およびラボのベンチ上にチューブのラック内の場所のL。色は、少なくとも1分間開発することができます。 </li><li> 1分間18,000 × gで遠心ですべてのチューブを遠心してください。 </li><li> 1mLのプラスチックキュベットを用いて540nmで分光光度計でサンプルを測定し、アセチルリン酸標準曲線と比較してアセチルリン酸の存在量を決定する。 </li><li>枯渇アセチルリン酸基質の量は、コントロールが欠け酵素に存在するアセチルリン酸の量から酵素反応後に残存するアセチルリン酸の量を差し引くことによって決定することができます。適切なデータとグラフ作成ソフト（例：カレイダ、シナジーソフトウェア）を使用してデータ分析を実行します。 0.97よりも大きいのR 2値が望ましいです。 </li></ol> 4。代表的な結果： この検定の目的は、直接的に酢酸キナーゼの活性を測定することです。酢酸の形成のイオン。酢酸の生産のための簡単​​な、直接的な測定法がないため、これは、アセチルリン酸基質の消費量を測定することによって行われます。酵素反応の間に所定の時間後に残っているアセチルリン酸はアセチルヒドロキへと続いて540nmで測定可能な赤みを帯びた色（図2）を持つ第二鉄ヒドロキコンプレックス、に変換されます。標準のμモルアセチルリン酸塩の存在対吸光度をプロットする標準曲線は、それぞれの反応に残っているアセチルリン酸の量を決定するために使用されます。標準曲線は、ゼロ点を通る直線になります。図3に示されている代表的な標準曲線は、データだけでなく、線形方程式をフィットを示し、モルアセチルリン酸の存在と0.99のR 2値あたり1.2332吸光度単位の傾きを持っています。検量線のデータに線形近似の式は、反応に残っているアセチルリン酸の量を計算するために使用されます。 μモル消費アセチルリン酸の酵素と酵素反応後に残存アセチルリン酸塩のμモルを欠く対照反応中に存在するアセチルリン酸塩のμモルの間の差として決定されます。 精製、組換えM.テルモの酢酸キナーゼは、記述されたプロトコルを用いて測定した。図4に示す実験では、ADPの濃度が5ミリモル/ Lで一定に保持し、反応のアセチルリン酸塩の濃度は、アセチルリン酸に対するK m を決定するために変化させた。予想通り、この実験では酵素は、それぞれの基質に対する標準的なミカエリス - メンテンのような動態を、次のとアセチルリン酸塩の濃度に対して活性をプロットするときに双曲線の飽和曲線を生成したことを示している。アセチルリン酸の見かけのK m値は0.27 ± 0.47の公開K m値に遜色0.01ミリモル/ L、±結合などを使用して0.01ミリモル/ Lであった13と言う。 直接アッセイはまた、標準的な結合アッセイを使用して不可能であるATP、以外の基質を利用する酢酸キナーゼの活性を測定するために使用することができます。組換え大腸菌を精製酢酸を形成する方向にI PPではなく、ATPを生成する赤痢アセテートキナーゼ16は 、ADPの代わりにリン酸ナトリウムを使用して、このアッセイに供した。反応でリン酸ナトリウムの濃度は0.2モル/ Lで一定に保持され、アセチルリン酸塩濃度を変化させた。 M.用としてテルモの酢酸キナーゼ、E.赤痢の酢酸キナーゼは、アセチルリン酸と双曲線の飽和曲線のミカエリス-メンテンのような動力学を追った（図5）が観察された。アセチルリン酸の見かけのK m値は0.50 ± 0.006ミリモル/ Lであった。リーブスとガスリー15はネイティブ酵素のアセチルリン酸0.06ミリモル/ LのK m値を決定し、どのように<html>これまで、それらの酵素は、部分的にしか精製され、それらのアッセイはまた、部分的にしか精製された4つのカップリング酵素を関与していた。したがって、これらの値を直接比較することは困難です。 プロトコルスキーム<ol><li>アセチルリン酸の標準曲線を生成する</li><li>所望の濃度に酵素を希釈する</li><li>マイクロ遠心チューブに反応混合物、アリコートを300μlを準備</li><li> 1分間で37 Preinc​​ubate反応が° C </li><li>特定の時間間隔で酵素を加えることによって反応を開始します。 </li><li>反応を停止し、60℃でインキュベートすることと同じ間隔でヒドロキシルアミンを追加℃で5分間</li><li>塩化第二鉄/カラーの開発のためのトリクロロ酢酸溶液を加える</li><li> 1分間18,000 × gでチューブを遠心</li><li> 540nmで吸光度を測定</li><li>標準曲線との比較で消費されるアセチルリン酸の量を決定する</li></ol>tp_upload/3474/3474fig1.jpg&quot;/&gt; 図1プロトコルスキーム <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig2.jpg" /> 図2。アセチルリン酸塩の規格 。アセチルリン酸塩濃度の増加は、ヒドロキシルアミンと色と反応させた説明したように開発されました。アセチルリン酸を欠くコントロールは明るい黄色で、アセチルリン酸の増加量を含有する反応物は色が連続的に暗いです。この色の変化は、540nmで測定されます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig3.jpg" /> 図3サンプルアセチルリン酸の標準曲線。アセチルリン酸の様々な量は、ヒドロキシルアミンと反応させると発色液と吸光度を540nmで測定した。 μモルアセチルリン酸に対する540nmでの吸光度をプロットし、データへの線形近似を適用した。&lt;/ P&gt; <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig4.jpg" /> 図4。ATP産M.のアセチルリン酸の活用テルモの酢酸キナーゼ 。酵素活性は、アセチルリン酸の様々な濃度の5ミリモル/ L ADP存在下での酢酸の形成の方向で決定されたものです。アセチルリン酸の消費量は、反応や酵素反応後に残存アセチルリン酸の量のアセチルリン酸の開始量との差として決定された。アッセイは、示されたエラーバー付きの三連で行った。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig5.jpg" /> 図5。PP I産E.によるアセチルリン酸の活用赤痢の酢酸キナーゼ 。酢酸の形成の方向で酵素活性が0の存在下で決定された。アセチルリン酸の濃度を変えると、2モル/ Lリン酸ナトリウム。アセチルリン酸の消費量は、反応や酵素反応後に残存アセチルリン酸の量のアセチルリン酸の開始量との差として決定された。アッセイは、示されたエラーバー付きの三連で行った。

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	<li>Bork, P., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ATPase+domain+common+to+prokaryotic+cell+cycle+proteins,+sugar+kinases,+actin,+and+hsp70+heat+shock+proteins.">An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-directed+mutational+analysis+of+active+site+residues+in+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Site-directed mutational analysis of active site residues in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 276, 45059-45064 (2001).</li><li>Miles, R. D., Gorrell, A., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+transition+state+analog,+MgADP-aluminum+fluoride-acetate,+in+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Evidence for a transition state analog, MgADP-aluminum fluoride-acetate, in acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 277, 22547-22552 (2002).</li><li>Ingram-Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+acetate+binding+pocket+in+the+Methanosarcina+thermophila+acetate+kinase.">Characterization of the acetate binding pocket in the Methanosarcina thermophila acetate kinase.</a> J. Bacteriol. 187, 2386-2394 (2005).</li><li>Gorrell, A., Lawrence, S. H., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+kinetic+analyses+of+arginine+residues+in+the+active+site+of+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Structural and kinetic analyses of arginine residues in the active site of the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 280, 10731-10742 (2005).</li><li>Gorrell, A., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+Methanosarcina+thermophila+acetate+kinase+mechanism+by+fluorescence+quenching.">Investigation of the Methanosarcina thermophila acetate kinase mechanism by fluorescence quenching.</a> Biochemistry. 46, 14170-14176 (2007).</li><li>Reeves, R. E., Guthrie, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetate+kinase+(pyrophosphate).+A+fourth+pyrophosphate-dependent+kinase+from+Entamoeba+histolytica.">Acetate kinase (pyrophosphate). A fourth pyrophosphate-dependent kinase from Entamoeba histolytica.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 66, 1389-1395 (1975).</li><li>Fowler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+and+structural+characterization+of+the+novel+PPi-dependent+acetate+kinase+from+the+parasite+Entamoeba+histolytica.">Kinetic and structural characterization of the novel PPi-dependent acetate kinase from the parasite Entamoeba histolytica.</a> , (2011).</li><li>Lipmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+synthesis+of+acetyl+phosphate.">Enzymatic synthesis of acetyl phosphate.</a> J. Biol. Chem. 155, 55-70 (1944).</li><li>Lipmann, F., Tuttle, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+micromethod+for+determination+of+acyl+phosphates.">A specific micromethod for determination of acyl phosphates.</a> J. Biol. 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利害の衝突は宣言されません。

このアッセイにおけるアセチルリン酸の検出は、ヒドロキシルアミン塩酸塩と塩化第二鉄溶液の濃度と酸性度の十分な濃度に依存している。アッセイ体積の変化は、これらのコンポーネントの両方の見直しが必要になります。酵素反応は、ここで説明し、37℃60℃実行ヒドロキシル終端を持つC℃で5分間で行った。これより高い温度は、アセチルヒドロキに残っているアセチルリン酸塩の迅速?...

<table border="1"><tr><td width="160"> 試薬の名前 </td><td width="108"> 会社 </td><td width="134"> カタログ番号 </td><td width="103"> コメント </td></tr><tr><td>アセチルリン酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 01409 </td><td>リチウム塩（97％） </td></tr><tr><td>ナトリウム一塩基性リン酸（脱水） </td><td> ThermoFisher </td><td> S381 </td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム二塩基性リン酸（無水） </td><td> ThermoFisher </td><td> S374 </td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム（六水和物） </td><td> ThermoFisher </td><td> M33 </td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td> ThermoFisher </td><td> B152 </td><td></td></tr><tr><td>塩化第二鉄（六水和物） </td><td> ThermoFisher </td><td> I88 </td><td></td></tr><tr><td>トリクロロ酢酸</td><td> ThermoFisher </td><td> A324 </td><td></td></tr><tr><td>ヒドロキシルアミン塩酸塩</td><td> ThermoFisher </td><td> H330 </td><td></td></tr><tr><td> 5&#39; -二リン酸アデノシンナトリウム塩</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A2754 </td><td></td></tr><tr><td> Biomate III分光光度計</td><td> ThermoFisher </td><td> 142982082 </td><td>標準的なUV /可視分光光度計</td></tr></table>

direct detection of the acetate-forming activity  of the enzyme acetate kinase

酢酸キナーゼ、酢酸、砂糖キナーゼ- Hsp70の-アクチン（ASKHA）酵素のスーパーファミリー1-5のメンバーは、基質としてATPを利用したアセチルリン酸への酢酸の可逆的リン酸化を担当しています。酢酸キナーゼは、 古細菌の一属で見つかった、 細菌のユビキタスであり、またEukarya 6の微生物中に存在する。最もよく特徴付け酢酸キナーゼは、メタンガスを作り出す細菌Methanosarcinaサーモ 7月14日からということです。唯一のリン酸塩形成アセチル方向にATPない私を PPに利用できますが、酢酸キナーゼは、 赤痢アメーバ 、アメーバ赤痢の病原体から分離されており、これまでこの属15,16でのみ発見されました。 アセチルリン酸形成の方向では、酢酸キナーゼ活性は、通常、最初リップマンによって記述された、ヒドロキアッセイを用いて測定され17-20、ADPへのATPの変換が酵素のピルビン酸キナーゼ、乳酸脱水素酵素21,22、またはアセチルリン酸塩の製品との反応後の無機リン酸の放出を測定するアッセイによりNAD +にNADHの酸化に結合される結合アッセイヒドロキシルアミン23と。反対の活動は、酢酸を形成する方向は、ADPからNADPの還元+酵素のヘキソキナーゼとグルコース-6 -リン酸脱水素酵素24によりNADPHにするためにATPの形成を結合することによって測定されます。 ここでは、カップリング酵素を必要としない酢酸の形成の方向に酢酸キナーゼ活性を検出するための方法を説明しますが、代わりにアセチルリン酸の消費量の直接測定に基づいています。酵素反応の後、残りのアセチルリン酸塩は、ヒドロキアッセイ用として、分光光度法で測定することができる第二鉄ヒドロキ複合体に変換されます。このように、STとは異なり、ADPからATPの生産に依存しているこの方向のandard結合アッセイは、この直接的なアッセイは、ATPまたはPP iを生成する酢酸キナーゼのために使用することができます。

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Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

酢酸キナーゼ活性の測定方法について説明する。このアッセイは異なるホスホリルアクセプターで、酢酸を形成する方向に酢酸キナーゼの酵素活性と反応速度を決定するための直接的な反応を利用している。さらに、この方法は、酵素を利用する他のアセチルリン酸塩またはアセチル- CoAを検定するために利用することができます。

酵素酢酸キナーゼのアセテート形成活性の直接検出

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

direct-detection-acetate-forming-activity-enzyme-acetate

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

23.0K ビュー.  Clemson University. 酢酸キナーゼ活性の測定方法について説明する。このアッセイは異なるホスホリルアクセプターで、酢酸を形成する方向に酢酸キナーゼの酵素活性と反応速度を決定するための直接的な反応を利用している。さらに、この方法は、酵素を利用する他のアセチルリン酸塩またはアセチル- CoAを検定するために利用することができます。

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Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical probe that targets the enzyme&#39;s active sites. A reporter tag introduced into the probe allows for the detection of the labeled enzyme by in-gel fluorescence scanning, protein blot, fluorescence microscopy, or liquid chromatography-mass spectrometry. Here, we describe the preparation and use of the compound ARN14686, a click chemistry activity-based probe (CC-ABP) that selectively recognizes the enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA). NAAA is a cysteine hydrolase that promotes inflammation by deactivating endogenous peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-alpha agonists such as palmitoylethanolamide (PEA) and oleoylethanolamide (OEA). NAAA is synthesized as an inactive full-length proenzyme, which is activated by autoproteolysis in the acidic pH of the lysosome. Localization studies have shown that NAAA is predominantly expressed in macrophages and other monocyte-derived cells, as well as in B-lymphocytes. We provide examples of how ARN14686 can be used to detect and quantify active NAAA ex vivo in rodent tissues by protein blot and fluorescence microscopy.

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Here, we describe the preparation and use of an activity-based probe (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oxoazetidin-3-yl]carbamate) that allows for the detection and quantification of the active form of the proinflammatory enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA), both in vitro and ex vivo.

調製と<em&gt;インビボ</em&gt;アクティビティベースのプローブの使用のために<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine酸アミダーゼ

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

生化学

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering allosteric details of their regulation. Kinases comprise signaling networks whose defects are often hallmarks of multiple forms of cancer and related diseases, making an assay platform amenable to manipulation of upstream regulatory factors and validation of reaction requirements critical in the search for improved therapeutics. Here, we describe a basic kinase assay that can be easily adapted to suit specific experimental questions including but not limited to testing the effects of biochemical and pharmacological agents, genetic manipulations such as mutation and deletion, as well as cell culture conditions and treatments to probe cell signaling mechanisms. This assay utilizes radiolabeled [&#947;-32P] ATP, which allows for quantitative comparisons and clear visualization of results, and can be modified for use with immunoprecipitated or recombinant kinase, specific or typified substrates, all over a wide range of reaction conditions.

Protein kinases are highly evolved signaling enzymes and scaffolds that are critical for inter- and intracellular signal transduction. We present a protocol for measuring kinase activity through the use of radiolabeled adenosine triphosphate ([&#947;-32P] ATP), a reliable method to aid in elucidation of cellular signaling regulation.

放射性標識ATPによるタンパク質キナーゼ活性のアッセイ

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

多彩な生化学的アプローチを用いた新規 CK2 キナーゼ基板の識別

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral membrane enzymes, resulting in triacylated proteins. The first step in the lipoprotein modification pathway involves the transfer of a diacylglyceryl group from phosphatidylglycerol onto the prolipoprotein, resulting in diacylglyceryl prolipoprotein. In the second step, the signal peptide of prolipoprotein is cleaved, forming an apolipoprotein, which in turn is modified by a third fatty acid derived from a phospholipid. This last step is catalyzed by apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). The lipoprotein modification pathway is essential in most &#947;-proteobacteria, making it a potential target for the development of novel antibacterial agents. Described here is a sensitive assay for Lnt that is compatible with high-throughput screening of small inhibitory molecules. The enzyme and substrates are membrane-embedded molecules; therefore, the development of an in vitro test is not straightforward. This includes the purification of the active enzyme in the presence of detergent, the availability of alkyne-phospholipids and diacylglyceryl peptide substrates, and the reaction conditions in mixed micelles. Furthermore, in order to use the activity test in a high-throughput screening (HTS) setup, direct readout of the reaction product is preferred over coupled enzymatic reactions. In this fluorometric enzyme assay, the alkyne-triacylated peptide product is rendered fluorescent through a click-chemistry reaction and detected in a multiwell plate format. This method is applicable to other acyltransferases that use fatty acid-containing substrates, including phospholipids and acyl-CoA.

Presented here is a sensitive fluorescence assay to monitor apolipoprotein N-acyltransferase activity using diacylglyceryl peptide and alkyne-phospholipids as substrates with click-chemistry.

酵素特性評価からハイスループットスクリーニングまでのアポリポタンパク質N-アシルトランスフェラーゼのクリックケミストリーベースの蛍光アッセイ(英語)

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

Ecotoxicological Methodologies to Evaluate Biomarkers at Different Scales in Neotropical Anurans

The new questions in ecotoxicology highlight the importance of applying a battery of biomarkers, as this results in ecotoxicological predictions that improve not only the interpretation of the effects of environmental stressors on organisms but also the determination of their possible impact. It is well known that the use of ecotoxicological biomarkers at different levels of organization allows for the prediction of the biological responses of organisms to environmental stressors, which is useful in environmental risk assessment. 
Nevertheless, it is necessary to consider the optimization of basic procedures, to generate historical data in control groups, and to employ specific bioassays to evaluate responses in organs and tissues in order to elucidate the nature and variation of the effects observed. Therefore, the present work aims to describe several ecotoxicological methodologies employed in all stages of neotropical anurans at different ecological levels and to validate them as useful biomarkers to be used both in wildlife and in laboratory conditions. In this work, these biomarkers were applied at the individual/organismic level (body condition index), histological/physiological level (histopathology, histometric, and pigmentary analyses), biochemical level (oxidative stress enzymes), and genetic level (direct and oxidative damage in DNA by comet assay). 
Although these methodologies have small variations or modifications depending on the species, these techniques provide effective biomarkers for evaluating the effect of xenobiotics on anurans, which possess certain characteristics that make them useful indicator species of aquatic and terrestrial ecosystems. In conclusion, the battery of biomarkers employed in the present study has proven to be adequate for estimating toxic responses in Neotropical anurans and can be further recommended as bioindicators for identifying the impact of pollutants on the aquatic ecosystems of the region. Finally, it is recommended to achieve the standardization of these important biomarkers for anurans in specific regions as well as to possibly include them in risk assessments and decision-making.

<meta charset="utf8"></head><body>新熱帯性無尿類におけるさまざまなスケールでのバイオマーカーを評価するための生態毒性学的方法論

In this paper, standardized ecotoxicological methods for the evaluation of biomarkers in neotropical anuran species are presented. Specifically, this paper details several methodologies at different scales of ecotoxicological evaluation, such as the genetic, cellular-histological, biochemical, morphological, and individual levels.

新熱帯性無尿類におけるさまざまなスケールでのバイオマーカーを評価するための生態毒性学的方法論

The new questions in ecotoxicology highlight the importance of applying a battery of biomarkers, as this results in ecotoxicological predictions that ...

環境学

HAT1酵素活性スクリーニングのためのクリックベースアッセイの開発

An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome assembly. It is required for tumor growth in various systems, making it a potential target for cancer treatment. To facilitate the identification of compounds that can inhibit HAT1 enzymatic activity, we have devised an acetyl-click assay for rapid screening. In this simple assay, we employ recombinant HAT1/Rbap46, which is purified from activated human cells. The method utilizes the acetyl-CoA analog 4-pentynoyl-CoA (4P) in a click-chemistry approach. This involves the enzymatic transfer of an alkyne handle through a HAT1-dependent acylation reaction to a biotinylated H4 N-terminal peptide. The captured peptide is then immobilized on neutravidin plates, followed by click-chemistry functionalization with biotin-azide. Subsequently, streptavidin-peroxidase recruitment is employed to oxidize amplex red, resulting in a quantitative fluorescent output. By introducing chemical inhibitors during the acylation reaction, we can quantify enzymatic inhibition based on a reduction of the fluorescence signal. Importantly, this reaction is scalable, allowing for high throughput screening of potential inhibitors for HAT1 enzymatic activity.

著者スポットライト:HAT1阻害剤スクリーニングのためのアセチルクリックアッセイの開発

Quick and accurate chemical assays to screen for specific inhibitors are an important tool in the drug development arsenal. Here, we present a scalable acetyl-click chemistry assay to measure the inhibition of HAT1 acetylation activity.

ヒストンアセチルトランスフェラーゼ1アセチル化を測定するためのアセチルクリックケミストリーアッセイ

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. Among them, reversible lysine acetylation is one of the most widely distributed in all domains of life. Although numerous mass spectrometry-based acetylome studies have been performed, further characterization of these putative acetylation targets has been limited. One possible reason is that it is difficult to generate purely acetylated proteins at desired positions by most classic biochemical approaches. To overcome this challenge, the genetic code expansion technique has been applied to use the pair of an engineered pyrrolysyl-tRNA synthetase variant, and its cognate tRNA from Methanosarcinaceae species, to direct the cotranslational incorporation of acetyllysine at the specific site in the protein of interest. After first application in the study of histone acetylation, this approach has facilitated acetylation studies on a variety of proteins. In this work, we demonstrated a facile protocol to produce site-specifically acetylated proteins by using the model bacterium Escherichia coli as the host. Malate dehydrogenase was used as a demonstration example in this work.

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Genetic code expansion serves as a powerful tool to study a wide range of biological processes, including protein acetylation. Here we demonstrate a facile protocol to exploit this technique for generating homogeneously acetylated proteins at specific sites in Escherichia coli cells.

大腸菌Site-Specifically アセチル化蛋白質を生成する安易なプロトコル

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

酵素酢酸キナーゼのアセテート形成活性の直接検出

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調製と

放射性標識ATPによるタンパク質キナーゼ活性のアッセイ

多彩な生化学的アプローチを用いた新規 CK2 キナーゼ基板の識別

酵素特性評価からハイスループットスクリーニングまでのアポリポタンパク質N-アシルトランスフェラーゼのクリックケミストリーベースの蛍光アッセイ(英語)

新熱帯性無尿類におけるさまざまなスケールでのバイオマーカーを評価するための生態毒性学的方法論

新熱帯性無尿類におけるさまざまなスケールでのバイオマーカーを評価するための生態毒性学的方法論

ヒストンアセチルトランスフェラーゼ1アセチル化を測定するためのアセチルクリックケミストリーアッセイ

ヒストンアセチルトランスフェラーゼ1アセチル化を測定するためのアセチルクリックケミストリーアッセイ

ヒストンアセチルトランスフェラーゼ1アセチル化を測定するためのアセチルクリックケミストリーアッセイ

大腸菌Site-Specifically アセチル化蛋白質を生成する安易なプロトコル