Name: assaying protein kinase activity with radiolabeled atp
Uploaded: 2017-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
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著者は貴重な作業と討論のためにCobb研究所のすべての現メンバーと元メンバー、そして管理援助のためのDionne Wareに感謝します。これらの研究は、国立保健研究所R37 DK34128およびウェルチ財団グラントI1243によってMHCに支持された

キナーゼ精製リソースおよび一般的な免疫沈降パイプライン注：このアッセイで使用するためのキナーゼは、培養細胞の免疫沈降物から、またはアフィニティータグ精製などの組換え手段によって供給され得る6 。以下は、関心対象のキナーゼに依存して修飾しなければならないかもしれないフラッグタグ免疫沈降のための一般的プロトコールである。可能な限りすべてを氷上に置いておくべきです。 <ol><li> 2μLの1mg / mL抗体を200μLの細胞ライセート（通常は1mg / mL総タンパク質濃度）に添加し、4℃で1時間インキュベートする。 </li><li> プロテインAセファロースビーズを、溶解バッファー（以下参照）で2〜3回、短時間4℃で5,000xgで30秒間〜1分間回転させ（「タッチスピン」）、ピペットで上清を除去し、緩衝液にビーズを再懸濁する。 <ol><li>溶解緩衝液を調製する：50mM HEPES pH7.7,150mM NaCl、1.5mM MgCl 2、1mM EGTA、10％グリセロール、0.2mMオルトバナジウム酸ナトリウム、100mMフッ化ナトリウム、50mMβ-グリセロリン酸、0.1％Triton X100または0.1％NP-40を含む。 </li></ol></li><li>ライセートに溶解緩衝液中のプロテインAセファロースビーズの50％スラリー30μLを加える;ロッキングしながら4℃で1時間インキュベートする。 </li><li> 4℃で回転させてビーズをペレット化し、上清を除去する。 </li><li> 1mLのビーズ洗浄バッファー（1M NaCl、20mMトリスpH7.4）で3回洗浄する。 </li><li> 1xキナーゼ反応緩衝液（10mM HEPES pH8.0,10mM MgCl 2 ）で1回洗浄する。ビーズを除去せずにできるだけ多くのバッファーを除去する。 </li></ol>キナーゼ反応の初期化注：IPキナーゼアッセイの場合、約15μLの懸濁していないビーズが典型的な開始サンプルです。組換えタンパク質キナーゼアッセイの場合、典型的な出発量は、25〜50μLの最終反応容積に対して0.1〜1.0μg/ l〜1/10の範囲である。組換えタンパク質サンプルの容量を調整するアッセイを初期化する前にそれらが保存されているバッファーと等しくなるようにします。大量のキナーゼを使用する場合は、アッセイ期間中のタンパク質安定性の維持を助けるために、BSAなどのキャリアタンパク質を含める。 <ol><li> 以下に示す5xキナーゼ反応バッファーを調製する： 50mM HEPES pH 8.0 50mM MgCl 2 50mMベンズアミジン（プロテアーゼ阻害剤） 50mMのDTT（還元剤） 250μMATP（非標識または「コールド」） </li><li> キナーゼサンプルを1.5 mLチューブに氷上で保存してください。以下の反応混合物を別々に冷却した1.5mLチューブで調製する： 21μLのH 2 O 6μL5xキナーゼ反応緩衝液 1μLの放射標識（「ホット」）ATP 基質2μL（約5mg / mL） 注：組換えキナーゼアッセイでは、精製タンパク質に対応するように容量を調整することができます。最終反応容積が30μLとなるように計算する。このレシピを使用してマスターを準備するミックス。標識されたATPを受領したら、反応混合物に加える前にH 2 O中のストックを0.01mCi /μLの比活性に希釈する。 </li><li>アッセイを初期化するために、反応混合物全体をキナーゼサンプルに添加し、アッセイされるキナーゼの活性に依存して、30℃で5分〜1時間インキュベートする。 注記：以前にアッセイされていないキナーゼを用いて作業する場合は、キナーゼ活性の経時変化を時間間隔で5分間隔で実行します。 </li></ol>反応停止およびSDS-PAGE <ol><li>氷上に置き、7.5μLの5倍Laemmliサンプルバッファー6を加えることにより反応を停止する。 </li><li>ヒートブロック中、100℃で30秒〜2分間加熱する。 </li><li> 10-15％SDS-PAGEゲル上でスピンをタッチし、ウェルあたり20μLを負荷する。キナーゼと基質を分離するのに十分な長さのゲルを流します（通常5Wの定電力で1時間）。ゲル装置をシールドして32 </sup&gt; Pである。 <ol><li>ここでは自家製ゲル装置を使用していますが、標準的な市販のミニゲルが完全に適しています。次のように寸法を使用します。 ゲル：幅8cm、長さ5.5cm（分解能）、厚さ1.5mm。 コムズ：15ウェル、1.5mm厚、2.9mm幅、16mm深さ</li></ol></li></ol> 4.ゲル染色および乾燥注意：すべてのステップで、放射性遮蔽を使用し、個人用保護具を着用して、 32 Pまでの人体への暴露を減らしてください。具体的な手順の詳細については、参考文献をいくつか記載しています。 <ol><li>ガラス/アルミナプレートからゲルを取り出し、50rpmに設定されたオービタルシェーカー上で50mLのクーマシー染色液（10％氷酢酸、50％メタノール、0.25％R-250色素）に1時間入れる。このステップでは、ゲル自体よりもわずかに大きい容器を使用してください。 8 </li><li>ゲルをステインから固定溶液（10％氷酢酸d、20％メタノール）を用いて脱色する。軌道シェーカー上で一晩、固定溶液600-700mL中でゲルを50rpmで揺する。クーマシー染料8,9を吸収するために、容器に泡や結び目のある実験用ワイプをゲルに入れます。 </li><li>固定溶液からゲルを取り出し、ゲルが乳白色に変わるまで静かに攪拌しながらメタノール200mLで1〜2分間浸します。これは、乾燥工程中の割れを防止するのに役立つ。 </li><li> 14cm×14cmの定性濾紙をメタノールで濡らし、スラブゲル真空乾燥機の上に置く。フィルターペーパーの前面を上にしてゲルを下にして置きます。 </li><li>しわや気泡を避けるために、プラスチックラップで慎重にゲルを覆う。乾燥機を80℃で1.5時間運転する。真空が達成された後、ふたを開け、必要に応じて柔らかいゴム製のブレイラで気泡をロールアウトします。 </li></ol> 5.オートラジオグラムおよびシンチレーションカウント<ol><li> driを削除ゲルの側面のろ紙にオートラッドマーカー、リン光ルーラーまたはドットを付けます。ドットを使用する場合は、それらが非対称パターンになっていることを確認してください。これは、露光および現像後にゲルをフィルムと整列させる。 </li><li> Geigerカウンタを使用して信号の強度を確認します。強度の高い画面で-70℃〜-80℃で弱い信号を照射すると、フィルムのバンド密度が増加します。 </li><li>暗室では、フィルムと増感スクリーンを備えたフィルムカセットに乾燥ゲルを、上から下の順番に、ゲル、フィルム、増感紙の順で入れます。 </li><li> 増感紙をカセットの蓋に取り付け、ゲルを適所にテープで貼り、このステップを簡単にします。増感スクリーンは、 32 Pからのベータ粒子によって照射されると光を発する。これらの光の放出は、ベータ粒子よりも効率的にフィルムに浸透する。 <ol><li>増感紙から放出される波長がフィルムが最も敏感である波長に池を維持する。 </li><li>ガイガーカウンターを使用して、曝露をどのくらいの期間放置するかを決定する：cpmカウントが〜100以下の場合は、-70℃で一晩お試しください。カウントが〜10,000の場合は、1時間の露出で開始し、そこから最適化します。 </li></ol></li><li>露光終了後、フィルムを取り出し、医療/ X線フィルムプロセッサーで現像する。暴露が-70〜-80℃で行われた場合は、カセットを室温まで温めて、結露が生じる前にフィルム上の結露を最小にしたり、フィルムを取り除いたりしてください。 </li><li>フィルムを乾燥したゲル/濾紙の上に置き、乾燥ゲル上のマーカー/ドットの画像をマーカー/ドットと整列させる。タンパク質標準に対応するバンドをフィルムに記入する。タンパク質標準にラベルを付け、将来の参照のために反応がどのレーンであるかを記録する。 </li><li>フィルム上の関心のあるバンドに対応するバンドをゲルから切り取って置きます7mLのシンチレーションバイアルに入れた。 4mLのシンチレーション液を加え、液体シンチレーションカウンターでカウントする。カウンタが32 Pの正しいエネルギースペクトルウィンドウを監視するように設定されていることを確認します。 注：基質に対応するバンドも、ノンキナーゼ対照レーンから切り出してください。これは、すべてのサンプルシンチレーションカウントから差し引かれるバックグラウンド放射線を計算するために使用されます。 </li></ol> 6.結果の分析注：オートラジオグラムは結果の定性的な視覚化を提供します。正確な定量のために、シンチレーションカウンターを用いて32 P取り込みを測定することができる。データは、通常、 図1Bに示すように、相対的な活動の観点から表現されます。全てのサンプルについて均一な条件が維持されている限り、比活性の相対的な測定は、処置を比較するのに十分である。 <ol><li>絶対的な特定の活動値を計算するときは、厳密に時間経過（ 例えば、 2×[キナーゼ] = 2×比活性）にわたる直線的な活性範囲を確保するために、キナーゼ、基質、および冷ATP濃度を含む、すべての反応条件の最適化。高い比活性を有するキナーゼについては、キナーゼ活性が基質の量によって制限される場合には、基質濃度を増加させてアッセイを行う。 </li><li> 関心のあるキナーゼの特異的活性を、1mg /キナーゼ当たりのナノモルリン酸塩単位の単位で計算する。 <ol><li>カウントされたバンドのcpmから空白を差し引く。 </li><li>熱いATPの減衰を計算する：[（1/2）^（t / t 1/2 ）] x 0.95ここで、 tは基準日からの日数であり、 t 1/2は32 Pの半減期は14.3日であり、0.95はシンチレーションカウンターの効率を反映する。例：28日目の高温ATPを使用する場合、減衰値は0.245でなければなりません。 </li><li> Calcアッセイの容量（μL）×[冷ATP]（μM）=全ATP（pmols）。アッセイ中の全ATPのピコモル（pmol）を測定します（通常、これは反応中の冷ATPの量に等しい）。例：30μL×50μM= 1500pmol </li><li> cpm / pmol ATPを計算する：冷ATPの[高温ATP x（2.2×10 7 ）×減衰係数] / pmolのμL。 注：2.2 x 10 7の値は、0.01 mCi /μLのATPをcpmに変換します。 </li><li>アッセイにおけるキナーゼの量をmgで計算する。組換えキナーゼおよび免疫沈降キナーゼの両方について、BCAアッセイのような標準的方法が出発濃度を決定するのに適している。例：50μLキナーゼ反応におけるwtERK20.0002μg/μLは0.01μg、または1×10 -5 mgです。 </li><li>アッセイで総cpmを計算する。 30μLの反応物を集め、ゲル上の各反応物から20μLを流す。計数されたcpm（ブランク減算後）に、総アッセイ容量/負荷された容量の係数を掛けます。上記を続けるたとえば、すべてのカウントに1.5、または30/20を掛けます。 </li><li>アッセイされたキナーゼの比活性を計算する： アッセイにおける全cpm）/（cpm / pmol ATP）/（アッセイ時間（分））/（キナーゼのmgでの量） 注：上記の値を1000で割ると、比活性はナノモル/分/ mg </li></ol></li><li> 分子量がわかっている限り、どれくらいのモルのリン酸が基質に取り込まれているかを計算する。これは、反応が完了すると、特定のタンパク質上のホスホサイトの数を決定するために使用されます。 アッセイにおける全cpm）/（cpm / pmol ATP）] /（pmol中の基質の量） </li></ol>

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	<li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs.">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li><li>Wellbrock, C., Arozarena, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complexity+of+the+ERK/MAP-Kinase+Pathway+and+the+Treatment+of+Melanoma+Skin+Cancer.">The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 4, 33 (2016).</li><li>Yang, T., Terman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+PKA-Mediated+Phosphorylation+of+Plexin+Using+Purified+Proteins.">Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins.</a> Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).</li><li>Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+method+for+the+assay+of+many+serine/threonine-specific+protein+kinases.">A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases.</a> Biochem J. 366 (Pt 3), 977-981 (2002).</li><li>Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-based+fluorescence+assay+for+serine/threonine+kinases+using+specific+chemical+reaction.">Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction.</a> Bioorg Med Chem. 16 (16), 7788-7794 (2008).</li><li>Dalby, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Phosphorylation:+Selected+Methods+in+Enzymology.">Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology.</a> J Am Chem Soc. 121 (51), 12215 (1999).</li><li>. Autoradiography Available from: <a target="_blank" href="https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography">https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography</a> (2011)</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Protein Protocols Handbook. , (2009).</li><li>Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WNK1,+a+novel+mammalian+serine/threonine+protein+kinase+lacking+the+catalytic+lysine+in+subdomain+II.">WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II.</a> J Biol Chem. 275 (22), 16795-16801 (2000).</li><li>McReynolds, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+or+Mutation+of+the+ERK2+Activation+Loop+Alters+Oligonucleotide+Binding.">Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding.</a> Biochemistry. 55 (12), 1909-1917 (2016).</li><li>Carlson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+discovery+of+ERK2+substrates+identifies+ERK-mediated+transcriptional+regulation+by+ETV3.">Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3.</a> Sci Signal. 4 (196), rs11 (2011).</li><li>Courcelles, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteome+dynamics+reveal+novel+ERK1/2+MAP+kinase+substrates+with+broad+spectrum+of+functions.">Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions.</a> Mol Syst Biol. 9, 669 (2013).</li><li>Myers, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Screening+and+Hit+Validation+of+Extracellular-Related+Kinase+5+(ERK5)+Inhibitors.">High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors.</a> ACS Comb Sci. 18 (8), 444-455 (2016).</li></ol>

著者は何も開示することはない。

キナーゼは、数多くの状況において広範な機能を発達させたタンパク質の多様なファミリーであり、キナーゼアッセイは、いくつかのシグナル伝達タンパク質の研究に非常に有用であり、細胞通信の現在の理解に大きく貢献しています。特に、同じ基本アッセイを、構造および活性の大きな違いにもかかわらず、2つの異種キナーゼの特徴付けに使用した。 WNK1キナーゼは、臨界リジンが独特?...

プロテインキナーゼは、細胞シグナルの適切な応答への伝達に不可欠な洗練された酵素である1 。ホメオスタシスの維持と病態2の予防または促進における役割を考えると、キナーゼ活性を評価するための生化学的方法は、真核生物のシグナル伝達の詳細を描写するための強力なツールであり続けている3 。リン酸化特異的抗体を用いる戦略は、細胞シグナル伝達状態4に対する異なる治療条件の影響を測定する点で非常に有益であるが、キナーゼアッセイは、異なるキナーゼのキナーゼの酵素活性に関して異なる治療条件の影響を直接測定することを可能にする。関心放射性物質5を使用しない類似のアッセイにはいくつかの選択肢がありますが、我々は結果の堅牢な定量化のためにこの方法に引き続き依存しています。そこ免疫沈降（IP）キナーゼアッセイ（ 図1 ）および組換えタンパク質キナーゼアッセイ（ 図2 ）の2つの典型的な用途である。 IPキナーゼアッセイは、特定のプロテインキナーゼを活性化することができる因子ならびにゲノム阻害性の治療条件を同定するために非常に有用である。簡潔には、目的のエピトープタグ化キナーゼを培養真核細胞にトランスフェクションし、種々の処理を施し、免疫沈降させ、放射性標識ホスフェートをモデル基質（ 例えば、ミエリン塩基性タンパク質（MBP））に取り込む能力についてアッセイする。 IPキナーゼアッセイはまた、内因性タンパク質の免疫沈降または任意の数のゲノム編集技術のいずれかによって、過剰発現に頼らずに行うことができる。治療は培養で行われるので、この方法は複数の上流因子を介して伝達される刺激を検出することができるまたはインビトロでの読取りによる並行経路である 。この方法の1つの大きな利点は、直接的な上流または下流の因子またはその中のリン酸化部位の事前知識を必要としないことである。さらに、興味のあるキナーゼの特異的基質が同定されると、同じキナーゼアッセイプロトコールを組換え成分とともに使用して、天然基質に対する比活性を測定し、質量分析と組み合わせた場合の特異的リン酸化部位を同定することができる。このようにして同定された部位は、基質変異体を利用するキナーゼアッセイによってさらに検証することができる。最後に、この方法は、自己リン酸化を検出および測定するためにも使用することができる。 本明細書で提供されるプロトコルは、最適化されたタンパク質精製スキームまたは培養細胞における目的の親和性タグキナーゼを発現するためのトランスフェクション方法のいずれかを前提とする。トランスフェクション、溶解、免疫沈降、およびタンパク質精製のより詳細な解説については、Cold Spring Harbor Protocols 6を参照することをお勧めします。アッセイの開発および改変に関する詳細については、「タンパク質リン酸化：選択された方法in Enzymology」を参照してください。

<table><tbody><tr><td>Protein A Sepharose CL-4B</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0963-03</td><td></td></tr><tr><td>Radiolabeled [&amp;gamma;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P] ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG035C010MC</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610737</td><td></td></tr><tr><td>Radioactive shielding</td><td>Research Products International</td><td>BR-006</td><td></td></tr><tr><td>R-250 dye (Coomassie)</td><td>Thermo Fisher</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Grade 3 qualitative filter paper</td><td>Whatman</td><td>1003-917</td><td></td></tr><tr><td>Slab gel vacuum dryer</td><td>Bio-Rad</td><td>Model 583 Gel Dryer #1651745&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Autorad marker</td><td>Agilent Technologies</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorescent ruler</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8133</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorescent dots</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5149</td><td></td></tr><tr><td>Geiger counter</td><td>Ludlum</td><td>Model 3 with 44-9 detector</td><td></td></tr><tr><td>BioMax Cassette 8 x 10&quot;</td><td>Carestream Health</td><td>107 2263</td><td></td></tr><tr><td>BioMax MS Film 8&quot; x 10&quot;</td><td>Carestream Health</td><td>829 4985</td><td></td></tr><tr><td>BioMax MS Intensifying Screen 8&quot; x 10&quot;</td><td>Carestream Health</td><td>851 8706</td><td></td></tr><tr><td>Medical/X-ray film processor</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td></td></tr><tr><td>Scintillation vials</td><td>Research Products International</td><td>125500</td><td></td></tr><tr><td>Scintillation fluid</td><td>MP Biomedicals</td><td>188245305</td><td></td></tr><tr><td>Beckman LS 6500 Scintillation counter</td><td>Beckman</td><td>LS 6500</td><td></td></tr></tbody></table>

assaying protein kinase activity with radiolabeled atp

プロテインキナーゼは、複雑な刺激配列に応答して大規模な細胞の変化を制御することができ、その調節のアロステリックな詳細を明らかにするために多くの努力が向けられている。キナーゼは、欠陥がしばしば複数の形態の癌および関連疾患の特徴であり、上流の調節因子の操作および改善された治療法の探索において重要な反応要求の検証に適したアッセイプラットフォームを形成するシグナルネットワークを含む。ここでは、生化学的および薬理学的作用物質の試験、突然変異および欠失などの遺伝子操作、ならびに細胞培養条件およびプローブに対する処理を含むが、これに限定されない特定の実験的問題に適合するように容易に適合させることができる基本キナーゼアッセイを記載する細胞シグナル伝達機構。このアッセイは、定量的な比較および結果の明確な視覚化を可能にする放射性標識[γ- 32 P] ATPを利用し、そしてmod広範囲の反応条件にわたって、免疫沈降または組換えキナーゼ、特異的または典型的な基質と共に使用することができます。

WNK1 IPキナーゼアッセイ Myc標識WNK1をHEK293細胞にトランスフェクトし、抗Myc抗体11で免疫沈降した。免疫沈降物は、モデル基質MBPに向かって、そしてそれ自体に向かってキナーゼ活性を示した（ 図1A ）。 WNK1突然変異体を、同様の方法でMBPに対するキナーゼ活性について試験したが、今回はGSTタ?...

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Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

プロテインキナーゼは高度に進化したシグナリング酵素であり、細胞間および細胞内シグナル伝達にとって重要な足場である。本発明者らは、細胞シグナル伝達調節の解明を助ける信頼できる方法である放射性標識アデノシン三リン酸（[γ- 32 P] ATP）の使用によるキナーゼ活性を測定するためのプロトコールを提示する。

放射性標識ATPによるタンパク質キナーゼ活性のアッセイ

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

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18.3K ビュー.  University of Texas Southwestern Medical Center. プロテインキナーゼは高度に進化したシグナリング酵素であり、細胞間および細胞内シグナル伝達にとって重要な足場である。本発明者らは、細胞シグナル伝達調節の解明を助ける信頼できる方法である放射性標識アデノシン三リン酸（[γ- 32 P] ATP）の使用によるキナーゼ活性を測定するためのプロトコールを提示する。 

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Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.

We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

ニトロセルロース結合アッセイを用いて細菌ヒスチジンキナーゼ自己リン酸化の定量化

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

生化学

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects biological functions and characteristics of the cell. Currently, the most common method for discovering phosphorylation sites is by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) analysis, a rapid and sensitive method. However, relatively labile phosphate moieties are often released from phosphopeptides during the fragmentation step, which often yields false-negative signals. In such cases, a traditional in vitro kinase assay using site-directed mutants would be more accurate, but this method is laborious and time-consuming. Therefore, an alternative method using peptide competition may be advantageous. The consensus recognition motif of 5&#39; adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) has been established1 and was validated using a positional scanning peptide library assay2. Thus, AMPK phosphorylation sites for a novel substrate could be predicted and confirmed by the peptide competition assays. In this report, we describe the detailed steps and procedures for the in vitro oligopeptide-competing kinase assay by illustrating AMPK-mediated nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) phosphorylation. To authenticate the phosphorylation site, we carried out a sequential in vitro kinase assay using a site-specific mutant. Overall, the peptide competition assay provides a method to screen multiple potential phosphorylation sites and to identify sites for validation by the phosphorylation site mutants.

Peptide competition assays are widely used in a variety of molecular and immunological experiments. This paper describes a detailed method for an in vitro oligopeptide-competing kinase assay and the associated validation procedures, which may be useful to find specific phosphorylation sites.

リン酸化部位決定のためのオリゴペプチド競合アッセイ

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

新しいキナーゼタンパク質の堅牢な生化学的アプローチを用いて分子レベルでの特性解析

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Non-Radioactive In Vitro Cardiac Myosin Light Chain Kinase Assays

Cardiac-specific myosin regulatory light chain kinase (cMLCK) regulates cardiac sarcomere structure and contractility by phosphorylating the ventricular isoform of the myosin regulatory light chain (MLC2v). MLC2v phosphorylation levels are significantly reduced in failing hearts, indicating the clinical importance of assessing the activity of cMLCK and the phosphorylation level of MLC2v to elucidate the pathogenesis of heart failure. This paper describes nonradioactive methods to assess both the activity of cMLCK and MLC2v phosphorylation levels. In vitro kinase reactions are performed using recombinant cMLCK with recombinant calmodulin and MLC2v in the presence of ATP and calcium at 25 &#176;C, which are followed by either a bioluminescent ADP detection assay or a phosphate-affinity SDS-PAGE. In the representative study, the bioluminescent ADP detection assay showed a strict linear increase of the signal at cMLCK concentrations between 1.25 nM to 25 nM. Phosphate-affinity SDS-PAGE also showed a linear increase of phosphorylated MLC2v in the same cMLCK concentration range. Next, the time-dependency of the reactions was examined at the concentration of 5 nM cMLCK. A bioluminescent ADP detection assay showed a linear increase in the signal during 90 min of the reaction. Similarly, phosphate-affinity SDS-PAGE showed a time-dependent increase of phosphorylated MLC2v. The biochemical parameters of cMLCK for MLC2v were determined by a Michaelis-Menten plot using the bioluminescent ADP detection assay. The Vmax was 1.65 &#177; 0.10 mol/min/mol kinase and the average Km was around 0.5 USA &#181;M at 25 &#176;C. Next, the activity of wild type and the dilated cardiomyopathy-associated p.Pro639Valfs*15 mutant cMLCK were measured. The bioluminescent ADP detection assay and phosphate-affinity SDS-PAGE correctly detected defects in cMLCK activity and MLC2v phosphorylation, respectively. In conclusion, a combination of the bioluminescent ADP detection assay and the phosphate-affinity SDS-PAGE is a simple, accurate, safe, low-cost, and flexible method to measure cMLCK activity and the phosphorylation level of MLC2v.

This study describes protocols for nonradiometric methods, a bioluminescent ADP detection assay and a phosphate-affinity SDS-PAGE, to determine the kinase activity of cardiac myosin light chain kinase (cMLCK) and the phosphorylation level of its substrate, myosin regulatory light chain (MLC2v).

Cardiac-specific myosin regulatory light chain kinase (cMLCK) regulates cardiac sarcomere structure and contractility by phosphorylating the ventricular ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

小ヌクレオチド基質のポリヌクレオチドリン酸化を測定する非放射性アッセイ

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

LRRK2のキナーゼ活性を測定する in vitroで</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

生物学

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC regulates mitochondrial function and cellular energy status. Numerous reports demonstrated that the activation of PKC-a and PKC-&epsilon; improves mitochondrial function in the ischemic heart and mediates cardioprotection. In contrast, we have demonstrated that PKC-&alpha; and PKC-&epsilon; are involved in nephrotoxicant-induced mitochondrial dysfunction and cell death in kidney cells. Therefore, the goal of this study was to develop an in vitro model of renal cells maintaining active mitochondrial functions in which PKC isozymes could be selectively activated or inhibited to determine their role in regulation of oxidative phosphorylation and cell survival. Primary cultures of renal proximal tubular cells (RPTC) were cultured in improved conditions resulting in mitochondrial respiration and activity of mitochondrial enzymes similar to those in RPTC in vivo. Because traditional transfection techniques (Lipofectamine, electroporation) are inefficient in primary cultures and have adverse effects on mitochondrial function, PKC-&epsilon; mutant cDNAs were delivered to RPTC through adenoviral vectors. This approach results in transfection of over 90% cultured RPTC.
Here, we present methods for assessing the role of PKC-&epsilon; in: 1. regulation of mitochondrial morphology and functions associated with ATP synthesis, and 2. survival of RPTC in primary culture. PKC-&epsilon; is activated by overexpressing the constitutively active PKC-&epsilon; mutant. PKC-&epsilon; is inhibited by overexpressing the inactive mutant of PKC-&epsilon;. Mitochondrial function is assessed by examining respiration, integrity of the respiratory chain, activities of respiratory complexes and F0F1-ATPase, ATP production rate, and ATP content. Respiration is assessed in digitonin-permeabilized RPTC as state 3 (maximum respiration in the presence of excess substrates and ADP) and uncoupled respirations. Integrity of the respiratory chain is assessed by measuring activities of all four complexes of the respiratory chain in isolated mitochondria. Capacity of oxidative phosphorylation is evaluated by measuring the mitochondrial membrane potential, ATP production rate, and activity of F0F1-ATPase. Energy status of RPTC is assessed by determining the intracellular ATP content. Mitochondrial morphology in live cells is visualized using MitoTracker Red 580, a fluorescent dye that specifically accumulates in mitochondria, and live monolayers are examined under a fluorescent microscope. RPTC viability is assessed using annexin V/propidium iodide staining followed by flow cytometry to determine apoptosis and oncosis.
These methods allow for a selective activation/inhibition of individual PKC isozymes to assess their role in cellular functions in a variety of physiological and pathological conditions that can be reproduced in in vitro.

The effects of activation of protein kinase C (PKC) isozymes on mitochondrial functions associated with respiration and oxidative phosphorylation and on cell viability are described. The approach adapts adenoviral technique to selectively overexpress PKC isozymes in primary cell culture and a variety of assays to determine mitochondrial functions and energy status of the cell.

腎細胞内のミトコンドリアの機能と細胞生存率の評価を過剰発現するプロテインキナーゼCアイソザイム

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, a Ras of complex proteins domain (ROC), a C-terminal of ROC domain (COR), and leucine-rich and ankyrin-like repeats at the N-terminus. The precise cellular roles of LRRK1 and LRRK2 have yet to be elucidated, however LRRK1 has been implicated in tyrosine kinase receptor signaling1,2, while LRRK2 is implicated in the pathogenesis of Parkinson's disease3,4. In this report, we present a protocol to label the LRRK1 and LRRK2 proteins in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure the overall phosphorylation levels of these 2 proteins in cells. In brief, affinity tagged LRRK proteins are expressed in HEK293T cells which are exposed to medium containing 32P-orthophosphate. The 32P-orthophosphate is assimilated by the cells after only a few hours of incubation and all molecules in the cell containing phosphates are thereby radioactively labeled. Via the affinity tag (3xflag) the LRRK proteins are isolated from other cellular components by immunoprecipitation. Immunoprecipitates are then separated via SDS-PAGE, blotted to PVDF membranes and analysis of the incorporated phosphates is performed by autoradiography (32P signal) and western detection (protein signal) of the proteins on the blots. The protocol can readily be adapted to monitor phosphorylation of any other protein that can be expressed in cells and isolated by immunoprecipitation.

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are multidomain proteins which encode both GTPase and kinase domains and which are phosphorylated in cells. Here, we present a protocol to label LRRK1 and LRRK2 in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure their overall cellular phophorylation levels.

ロイシンリッチの代謝標識は、放射性リン酸キナーゼ1および2を繰り返します

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

ATP依存性クロマチンリモデリング酵素の活性を分析するための生化学的アッセイ

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate energy for mechanical work, such as protein trafficking and degradation, solute transport, and cellular movements. The protocol described here is a basic assay for measuring the in vitro activity of purified ATPases for functional characterization. Proteins hydrolyze ATP in a reaction that results in inorganic phosphate release, and the amount of phosphate liberated is then quantitated using a colorimetric assay. This highly adaptable protocol can be adjusted to measure ATPase activity in kinetic or endpoint assays. A representative protocol is provided here based on the activity and requirements of EpsE, the AAA+ ATPase involved in Type II Secretion in the bacterium Vibrio cholerae. The amount of purified protein needed to measure activity, length of the assay and the timing and number of sampling intervals, buffer and salt composition, temperature, co-factors, stimulants (if any), etc. may vary from those described here, and thus some optimization may be necessary. This protocol provides a basic framework for characterizing ATPases and can be performed quickly and easily adjusted as necessary.

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

We describe a basic protocol for quantitating in vitro ATPase activity. This protocol can be optimized based on the level of activity and requirements for a given purified ATPase.

計測<em&gt;インビトロ</em酵素特性評価のための&gt; ATPase活性

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...