1。カスタムZFNのデザインプロセス<ol><li> ZFN設計プロセスを促進するために、研究者は提供する必要があります。 </li><ul><li>そのような遺伝子名、種、遺伝子アノテーション/識別番号などの標的遺伝子についての情報。 </li><li>実験の明記オーバーすべての目的（例えば、ノックアウトまたはノック） </li><li>非定型の遺伝子構造、遺伝子座に関与する特殊な生物学、または他のゲノム内の任意の相同性領域を含む遺伝子ターゲットの特定の要因。 </li><li>ジンクフィンガーのDNA配列の特定の範囲が対象とするヌクレアーゼ。 </li></ul><li>シグマバイオインフォマティクスチームは最初のジンクフィンガーターゲットサイトを開発するシリコZFNのデザインで実施しています。 </li><li>初期ZFNの標的部位は、ZFN科学技術コンサルタントに提供されます。もっと技術的に複雑なプロジェクトでは、このシグマの科学者は、プロジェクトの戦略を開発する研究者で動作します。 </li><lI&gt;シグマバイオインフォマティクスチームでは、シリコZFNのデザインに生成するためにZFNのアルゴリズムで解析を行っています。これにより、オフターゲットサイト、繰り返しマスキング、各潜在的なZFNターゲットサイトのSNP解析のための全ゲノム検索を含まれています。 </li><li>バイオインフォマティクスは、レビューのために調査官にトップZFNの標的部位を提供します。潜在的なZFNの標的部位の承認を得て、この情報はZFN製造プロセスを開始するZFN制作チームに提供されています。 </li></ol> 2。カスタムZFN生産<ol><li>ジンクフィンガーモジュールのシグマ·アーカイブが承認されたZFNのデザインを組み立てるために使用されます。 </li><li>各ZFNのデザインは組み立て順序は、ハイスループットクローニングプラットフォーム上で検証されます。 </li><li>一度すべてのZFN設計の生産は、検証に送信されるすべてのZFNを完了しています。 </li></ol> 3。カスタムZFNsの検証<ol><li> ZFNプロジェクトのヒト、マウス、ラットまたはCHO種それぞれの種に対して、十分に特徴付け細胞株で検証され、酵母ベースのアッセイは、他の生物や細胞の種類に使用されます。 </li><li> ZFNコンストラクトはヌクレオことによって、適切な細胞株に配信され、ZFNsが表現されています。 </li><li> DNAはZFNトランスフェクトした細胞のプールから収穫され、関心のある領域をPCR増幅されます。 </li><li> CEL-1アッセイは、その後のPCR産物で実施されています。ゲル電気泳動を検証ZFN活動にCEL-1アッセイ上で実行されます。 </li><li> CEL-1アッセイによって確認され、最高の活性ZFNのデザインは、顧客に提供されます。 ZFNsは、ポジティブコントロールとしてCEL-1アッセイとゲノムDNAのPCRプライマーと一緒にmRNAおよびプラスミドDNAで配信されます。 </li></ol> 4。ヌクレオによって検証ZFNsの配信<ol><li> 2×10 5細胞/ mlヌクレオ前日の密度で種の細胞を。 </li><li>ヌクレオの日に、セルラインのNucleofectorキットVを取り出し、室温にしましょう​​。 </li><li>製造元のプロトコールに従ってVヌクレオソリューションに補足を追加します。 </li><li>細胞をカウントします。細胞密度は2.5×10 5細胞/ mlの間でなければなりません。 </li><li>前のヌクレオに少なくとも20分間37℃CO 2インキュベーター内で各ウェルにあらかじめ暖かい媒体の2ミリリットルを6ウェルプレートを埋める。 </li><li> 5分間200xgでトランスフェクション当たり2×10 6個の細胞（8×6の合計）を遠心します。 </li><li>ハンクス平衡塩溶液（HBSS）20 mlで2回細胞を洗浄します。 </li><li>実験的なチューブを準備します（カスタムZFN技術情報で表を参照してください） </li><li>インキュベーターからのステップ（6.5）からメディアを含む6ウェルプレートを取り外します。 </li><li>ヌクレオソリューションの400μlの再懸濁し（100μL/反応）V. </li><li>一度反応は、それぞれのDNAまたはmRNAを含むチューブに細胞100μlを追加します。 TRANSFER適切なプログラムでのNucleofectorで2ミリメートルエレクトロポレーションキュベットとnucleofectの混合物。 </li><li>すぐに各サンプルのヌクレオした後、キュベットにステップで6ウェルプレート（6.9）から温め媒体の〜500μlを追加するには、ピペットを使用しています。その後、慎重に6ウェルプレート内の残りの温めておいた培地にキュベットから細胞を転送します。 </li><li>すべての反応を終了し、37℃CO 2インキュベーターに6ウェルプレートを返す</li></ol> 5。 ZFNsの配信後、ゲノムDNAを採取する<ol><li> 6ウェルプレート - プールされたすべてのセルを収穫しないでください。それはあなたがCEL-1消化製品を持っていることを確認した後単一細胞希釈クローンの細胞を持つために、文化を維持することが重要です。 1〜3日後のヌクレオGenElute哺乳類のゲノムDNAミニプレップキットを使用して染色体DNAを調製するために細胞を収集します。 </li></ol> 6。 CEL-1アッセイ</P&gt; <ol><li> PCRは、付属のプライマーを用いて、ZFNトランスフェクションサンプルとキットに付属の陽性対照ゲノムDNAからゲノムDNAを増幅する。 （カスタムZFN技術情報で表を参照）：PCR反応は以下の条件で設定されています。 </li><li> PCRのhomoduplexesからヘテロを生成するには、それぞれのZFN処理したサンプルに加え、コントロールからのPCR反応液10μlを取り、サーモサイクラー上で次のプログラムを使用します。 95°C、10分 95°C〜85°C、-2°C /秒 85°C〜25°C、-0.1°C /秒 4°C、無期限に</li><li> 42各反応とインキュベート°C 20〜40分のためにエンハンサー、1μlとヌクレアーゼS 1μlを（Transgenomicカタログ番号706025）を追加。 </li><li>そのようなDirectLoad WideRange DNAラダー（製品番号D7058）のような適切なマーカー（カスタムZFN技術的セキュリティ情報の結果を参照してください）​​、10％PAGE-TBEゲル上で消化を実行します。 </li><li>上のCE正の信号がCEL-IアッセイによりZFN処理集団で検出された、クローンの単離および特性評価に進みます。 </li></ol> 7。クローンの単離とキャラクタリゼーション<ol><li> FACSおよび希釈クローニングを含む標準的な方法により単一細胞クローンZFN処理したサンプル。 </li><li>クローンバンクの材料として残りをバック凍結、ゲノムDNAの収穫のための細胞のいくつかの割合を分割して、十分に拡張することができます。 </li><li> CEL-Iプライマーを用いたクローンからゲノムDNAを増幅し、CEL-Iアッセイ（にスパイクWT DNAの有無にかかわらず）によりアンプリコンを分析し、あるいは遺伝子型に直接進むために、このアンプリコンを使用しています。 </li><li>遺伝子候補クローンが好ましい方法で編集された対立遺伝子を有するものとして同定した。 </li></ol> 8。代表的な結果全体CompoZr ZFNワークフローの例を図2に示されています。 ZFNsが配信されます彼らは二本鎖切断（DSB）を作成し、適切なDNA配列に結合し、切断する細胞に。自然の修復プロセスは、非相同末端接合（NHEJ）、修理DSB。ヌクレオチドの欠失、挿入または置換のいくつかのインスタンスで異常なNHEJの結果。 PCR反応の変性/アニーリングステップの後に野生型と変更されたアンプリコンとの間のヘテロ二本鎖形成に収穫されたゲノムDNAの結果のPCR増幅。任意のヘテロ分子の開裂にCEL-1酵素の添加により。 CEL-1の結果は、ZFN切断を確認するためにPAGE分析によって解決されます。 図3は、CEL-1アッセイと期待される結果の概略を提供しています。 代表的なCEL-1の結果は、 図4および図5に含まれている図4は、K562細胞におけるZFNs（21％）の非常にアクティブなペアから結果が含まれています。 図5は、ZFNsの少ないアクティブペア（2.4％）からの結果が含まれていますK562細胞。 ZFN活性は、親のPCR断片を、以下の2つのPCR断片の存在によって、両方の数字で確認されています。 <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。バインドされたジンクフィンガーヌクレアーゼの表現。ZFNsはFokI制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインに融合ジンクフィンガーDNA結合ドメインから成る組み換えタンパク質である。ヘテロ二量体として結合すると、ZFNsは、ユーザーが指定したDNA配列において二本鎖ブレークを作成します。 <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。カスタムZFNサービスワークフローの概略図。CompoZrのZFNsを使用して、遺伝子組換え細胞株を生成するためのワークフローのグラフィック表現。 <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。 CEL-1アッセイと結果の概略）。ZFNプラスミドO<html> R mRNAは、細胞に送達されています。 B）ZFNsバインドを発現し、細胞の部分の二本鎖切断（DSB）を作成し、その標的配列を切断。 C）非相同によっていくつかのDSBの異常修復がヌクレオチド挿入または欠失で結果を結合し終了します。 D）ゲノムDNAは、細胞のトランスフェクトされたプールから収穫し、興味のある遺伝子座で増幅されています。 EF）PCR産物を変性し、野生型と変更されたアンプリコンとの間のヘテロ二本鎖形成を作成して再アニール。 G）ヘテロ分子の開裂にCEL-1の不一致エンドヌクレアーゼアッセイの結果。 H）CEL-1酵素のダイジェストは、PAGEによって解決されます。経口バンドの切断産物の観察率は、ImageJのソフトウェアによって決まり、ZFNsの端数カットと効率性を示しています。 <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。 21パーセントアクティブZFNsからCEL-1の結果 ImageJのソフトウェアは、で確認できます。_blank &quot;&gt; http://rsbweb.nih.gov/ij/。 <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig5.jpg" alt="図5" /> 図5。 2.4パーセントアクティブZFNsからCEL-1の結果 ImageJのソフトウェアは次のURLで入手できます。。 <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> 。

<ol>
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研究者は、標準の研究·ライセンス契約の下で共同研究にZFN改変細胞や動物を提供することができます。この状況でシグマは材料移転契約はシグマ、ZFNの顧客とその協力者との間の場所に置かれていることを要求します。 ：研究ライセンスはで見ることができます<a href="http://www.sigma.com/zfn" target="_blank">http://www.sigma.com/zfn</a> 。 ZFN改変細胞シグマを使って商用アプリケーションの可能性がある場合は、商用ライセンスが場所に置かれていることを要求します。 この記事への生産とフリーアクセスは、Sigma社が主催している

一度ZFN改変細胞は、彼らは永久的な持っているとDNA修飾を遺伝的に絶縁されています。研究を実施することが望ましい遺伝子改変で安定変更された細胞株または繁殖動物を生成することができ、この結果。 CompoZrカスタムZFNsは、ゲノムは、細胞の種類の多種多様な編集のための堅牢な方法を提供します。 ZFNsで編集成功したゲノムの出版物を作成する機能が含まれていますが、ヒト細胞株、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ、カエル、ブタおよびCHOの研究モデルに限定されません。3,4,5,6,7,8,9 ZFNsが適切に細胞内に配信されたときに、指定された細胞型の所望の標的部位における二本鎖ブレークが保証されています。それは、セル内に複数の遺伝子改変を持たせるために、セルに連続したジンクフィンガーの変更を実行することも可能です10特定の標的配列を選択して、それだけで特定の遺伝子座を変更する機能は、複数を作成する機能の主な原因です。 MODIFIカチオン。 CompoZrカスタムZFN分析証明書は、このようにキットのすべてのコンポーネントが完全に顧客の成功のために検証されていることを保証するキットで提供される非常に試薬を用いて生成されます。最初から最後までのワークフローの重要なステップを以下に示す： 細胞のクローニング与えられた細胞株を分離して展開する能力は、任意のZFN実験を開始する前にテストする必要があります。単一細胞を単離し、クローン由来の人口は可能であることを確認するために拡大すべきである。いくつかの細胞株は、この問題では難治であり、そのような培地で編集したクローンの濃縮や、文化としてのトリックはこれらの課題を克服するのに役立ちます。 配信の効率化配送効率の最適化はZFNsの配信前に必見です。多くの方法が脂質ベースのトランスフェクション、エレクトロポレーション、およびnucleofecti含めて使用することができで。理想的な配信方法は、配信効率と細胞生存の最適なブレンドが得られる1で構成されています。これらの効率を定量化する目視検査またはFACS 24-48時間後の配信により、GFPコントロールプラスミドと定量提供することによって推定することができる。 CEL-IアッセイそれはCEL-Iのアッセイは、PCR、消化、電気泳動のパラメータはZFN実験の解釈に干渉しないように、適切なコントロールを使用して並列に実行されることが不可欠です。各キットには分析証明書にCEL-Iイメージを作成するために使用されているコントロールゲノムDNAが含まれています。 CEL-Iのアッセイに続いて提供するプライマーとコントロールDNAからの増幅には、ユーザーが分析証明書（CofA）イメージで提供されると結果を比較することができ、実験のこの側面の任意の潜在的な非効率性を分離します。このようなモック、またはGFP処理した細胞などの適切なネガティブコントロールサンプルは、任意の非特異的切断産物の解明を可能にするために含まれるべきである。 単一細胞クローンの定量/定性分析 ZFN処理および単一細胞クローニング後、細胞の集団は、メソッドの番号によって、興味を持った遺伝子座で編集するためにスクリーニングすることができる。 CEL-Iのアッセイは、さらに遺伝子型の候補クローンを同定する目的のためにクローンからゲノムDNAで実施されることがあります。それはCEL-Iは、ホモ接合変異体クローンが均質分子を含むため、負のCEL-Iアッセイの結果を伝えるように消化を行う前に、1:1の比率でサンプルアンプリコンにスパイクWT PCRアンプリコンに重要です。これらの候補クローンをスクリーニングするための代替方法は、直接ZFNの標的部位に1つのPCRプライマーの着陸を設計することです。コントロールプライマーのいずれかと組み合わせて使用​​することで、負の測定結果は、WTシーケンスの損失を示しています。少なくとも一つのWT対立遺伝子を含むヘテロ接合のクローンは、Yうield PCRシグナルが、SYBR定量PCRのコンテキスト内でPCRを行うことにより完全にWTクローンから分離されることがあります。 候補クローンは、上記の方法により同定されたら、それらは標準のパイロシーケンシング、ディープシーケンシング、または他のシーケンシング法により遺伝子型を決定することができます。すべてのシーケンスメソッドでは、クローンのゲノムDNAから作成されたアンプリコンを生成する必要があります。従来のパイロシーケンシングの対立のためにTA-クローニングすることによって、PCR産物を分離し、個々のコロニーをシーケンシングすることができます。そのような深いは、この手順をシーケンシングなどの方法は必要ありません。 相同性監督修理（HDR） このプロトコルは、NHEJを経由してZFNを介した遺伝子ノックアウトの方法を提供する。導入遺伝子の統合も、その側面ZFNカットサイトを相同性ア ​​ームを持つドナープラスミドを導入することにより行うことができる。このシナリオでは、 図11に示すように 、ZFNは、二本鎖ブレークがHDRの代わりに、NHEJによって修復されて作成されます。 HDRは、iを監督導入遺伝子のntegrationは、このプロトコルを通じて提供される手順に類似の方法を用いて確認することができる。 トラブルシューティング ZFNsの配信 ZFNの配信と表現配信は、可視化、および/または定量するためのGFPま​​たは他のそのようなプラスミドの配信によってのために制御することができます。目的の細胞型とプロモーターの非互換性に起因する低発現は、mRNAの形式でZFNs​​の配信によって克服されることがあります。さらに、コールドショックメソッドは、さらに細胞内ZFNsの効力を高めるために利用することができる12 mRNAが使用されている場合は、それが細胞はすべての血清由来のRNaseが除去されていることを確認するために、配信する前に洗浄されることが肝要である。それは氷の上でmRNAを解凍し、劣化の任意のチャンスを最小限に抑えるために非常に最後の瞬間で細胞にそれを追加することも賢明である。 CEL-Iアッセイ CEL-I ASSAの基礎yは、興味のある遺伝子座の特定と十分な増幅です。非特異的増幅産物が認められた場合にはそのような鋳型量の最適化、プライマー濃度、サイクリングパラメータとして特異性を高めるために標準的なPCRのトラブルシューティング手順を使用しています。後者の方法は、十分な分解能と感度を提供していないように、標準アガロース電気泳動とは対照的に、PAGE分析を実行します。全く消化物や過度のにじみが観察されていない場合、CEL-Iダイジェスト条件も最適化することができる。 CEL-1の量の滴定ヌクレアーゼ及び/又は消化時間の長さは、これらの側面を改善するために滴定することができます。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼS（CEL-1酵素） </td><td> Transgenomic </td><td> 706025 </td></tr><tr><td>ハイフィデリティPCRシステムを展開</td><td>ロシュ社</td><td> 03 300 242 001 </td></tr><tr><td>セルラインのNucleofectorキットV </td><td>ロンザ</td><td> VCA-1003 </td></tr><tr><td> GenElute HPエンドトキシンフリー プラスミドMaxiprepキット</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

genome editing with compozr custom zinc finger nucleases (zfns)

ゲノム編集は、遺伝子機能や疾患の遺伝的基礎を解明するために使用することができる強力な手法です。そのようなDNA配列の化学ベースの変異誘発またはランダムな統合などのメソッドを編集して、従来の遺伝子が潜在的に生物学的研究を混乱させ、全体として非効率的な方法で無差別な遺伝的変化を与えると異常な培養条件の望ましくない合成配列、または使用の取り込みをする必要があります。これとは対照的に、細胞内の一過性ZFN式は、正確に容易にすることができる合成の導入遺伝子の化学物質や統合の管理のため必要とせず非常に効率的な方法で遺伝子編集を遺伝。 ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNs）が結合し、二本鎖DNA（dsDNA）の異なるシーケンスを切断する酵素である。機能的なCompoZr ZFNユニットは約15から18ヌクレオチドのDNA &quot;半サイト&quot;を結合する2つの個々の単量体タンパク質（ 図1を参照）で構成されています。と、2つのZFNモノマーのDNA切断ドメインは二量体化し、その隣接するターゲットサイトへの&quot;ホーム&quot;とDNAの二本鎖切断（DSB）を作成します。ゲノムのZFN媒介DSBの1はじめには、非常に効率的なゲノムを編集するための基盤を提供します。非相同末端接合（NHEJ）DNA修復経路を介して細胞内でDSBの不完全な修復は、小さな挿入及び欠失（indelsの）になる可能性があります。細胞の遺伝子コード配列内indelsのの作成 ​​には、フレームシフトと高効率で遺伝子座の後続の機能的なノックアウトになる可能性があります。2このプロトコルは、遺伝子ノックアウトを作成するZFNsの使用方法について説明しますが、導入遺伝子の統合も経由して行うことができるZFNの切断部位での相同性指向の修理。 CompoZrカスタムZFNサービスZFN技術と科学的なコミュニティのための標的遺伝子の編集に、体系的、包括的な、よく特徴付けられたアプローチを表しています。シグマの科学者は、1）研究者と密接にperfo仕事プロジェクトの目標に基づき、関連する遺伝子の構造、生物学、モデルシステムの分析、2を含むRMデューデリジェンス分析）音ターゲティング戦略、3を開発するためにこの知識を適用する）を構築し、設計し、機能的に関連の活動のためにZFNsを検証する細胞株。調査官は、陽性対照ゲノムDNAとプライマーを受信し、プラスミドDNAの両方に及びインビトロ転写されたmRNAの形式供給ZFN試薬をすぐに使用できる。これらの試薬は、その後研究者の細胞株または任意の細胞型の一過性発現のために配信されることがあります。次に、試料をPCR増幅、酵素消化、電気泳動などの標準的な分子生物学的手法によって関心の遺伝子座に遺伝子編集のためにテストされています。遺伝子編集のための肯定的な信号が初期集団で検出された後、細胞はクローン化された単一細胞と変異クローン/遺伝子の同定のための遺伝子型があります。

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Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

CompoZrカスタムジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）サービスは、ユーザーによって定義されている任意の遺伝子座でのあらゆる生物や細胞ラインの正確なゲノムの編集が可能になります。この資料では、CompoZrカスタムZFNサービスの設計、製造、検証、実装するプロセスについて説明します。

CompoZrカスタムジンクフィンガーヌクレアーゼによるゲノム編集（ZFNs）

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

25.3K ビュー.  Sigma Life Science. CompoZrカスタムジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）サービスは、ユーザーによって定義されている任意の遺伝子座でのあらゆる生物や細胞ラインの正確なゲノムの編集が可能になります。この資料では、CompoZrカスタムZFNサービスの設計、製造、検証、実装するプロセスについて説明します。

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Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

アダルトゼブラフィッシュの内耳感覚上皮のグロスとファイン解剖（ゼブラフィッシュ）

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

生物学

A Tactile Automated Passive-Finger Stimulator (TAPS)

Although tactile spatial acuity tests are used in both neuroscience research and clinical assessment, few automated devices exist for delivering controlled spatially structured stimuli to the skin. Consequently, investigators often apply tactile stimuli manually. Manual stimulus application is time consuming, requires great care and concentration on the part of the investigator, and leaves many stimulus parameters uncontrolled. We describe here a computer-controlled tactile stimulus system, the Tactile Automated Passive-finger Stimulator (TAPS), that applies spatially structured stimuli to the skin, controlling for onset velocity, contact force, and contact duration. TAPS is a versatile, programmable system, capable of efficiently conducting a variety of psychophysical procedures. We describe the components of TAPS, and show how TAPS is used to administer a two-interval forced-choice tactile grating orientation test.
Corresponding Author: Daniel Goldreich

A Tactile Automated Passive-Finger Stimulator TAPS

We describe a computer-controlled device for investigating the sense of touch: the Tactile Automated Passive-finger Stimulator (TAPS). We describe the components of TAPS, and show how TAPS is used to administer a two-interval forced-choice tactile grating orientation test.

触覚自動パッシブフィンガースティミュレーター（TAPS）

Although tactile spatial acuity tests are used in both neuroscience research and clinical assessment, few automated devices exist for delivering ...

Measurement Of Neuromagnetic Brain Function In Pre-school Children With Custom Sized MEG

Magnetoencephalography is a technique that detects magnetic fields associated with cortical activity [1]. The electrophysiological activity of the brain generates electric fields  - that can be recorded using electroencephalography (EEG)- and their concomitant magnetic fields  - detected by MEG. MEG signals are detected by specialized sensors known as superconducting quantum interference devices (SQUIDs). Superconducting sensors require cooling with liquid helium at -270 &deg;C. They are contained inside a vacumm-insulated helmet called a dewar, which is filled with liquid. SQUIDS are placed in fixed positions inside the helmet dewar in the helium coolant, and a subject's head is placed inside the helmet dewar for MEG measurements. The helmet dewar must be sized to satisfy opposing constraints. Clearly, it must be large enough to fit most or all of the heads in the population that will be studied. However, the helmet must also be small enough to keep most of the SQUID sensors within range of the tiny cerebral fields that they are to measure. Conventional whole-head MEG systems are designed to accommodate more than 90% of adult heads. However adult systems are not well suited for measuring brain function in pre-school chidren whose heads have a radius several cm smaller than adults. The KIT-Macquarie Brain Research Laboratory at Macquarie University uses a MEG system custom sized to fit the heads of pre-school children. This child system has 64 first-order axial gradiometers with a 50 mm baseline[2] and is contained inside a magnetically-shielded room (MSR) together with a conventional adult-sized MEG system [3,4]. There are three main advantages of the customized helmet dewar for studying children. First, the smaller radius of the sensor configuration brings the SQUID sensors into range of the neuromagnetic signals of children's heads. Second, the smaller helmet allows full insertion of a child's head into the dewar. Full insertion is prevented in adult dewar helmets because of the smaller crown to shoulder distance in children. These two factors are fundamental in recording brain activity using MEG because neuromagnetic signals attenuate rapidly with distance. Third, the customized child helmet aids in the symmetric positioning of the head and limits the freedom of movement of the child's head within the dewar. When used with a protocol that aligns the requirements of data collection with the motivational and behavioral capacities of children, these features significantly facilitate setup, positioning, and measurement of MEG signals.

The advent of MEG systems sized for young children opens important new opportunities to study brain development. The new system, together with a protocol that aligns experimental requirements with the capacities of children, can be used to study cognitive and language processes in healthy, awake children aged three to six.

カスタムサイズのMEGと就学前のお子様でNeuromagnetic脳機能の計測

Magnetoencephalography is a technique that detects magnetic fields associated with cortical activity [1]. The electrophysiological activity of the brain ...

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional regulation1. Therefore, an essential step towards understanding transcript regulation at the molecular level is to gain positional information on the binding sites of RBPs2.
Protein-RNA interactions can be studied using biochemical methods, but these approaches do not address RNA binding in its native cellular context. Initial attempts to study protein-RNA complexes in their cellular environment employed affinity purification or immunoprecipitation combined with differential display or microarray analysis (RIP-CHIP)3-5. These approaches were prone to identifying indirect or non-physiological interactions6. In order to increase the specificity and positional resolution, a strategy referred to as CLIP (UV cross-linking and immunoprecipitation) was introduced7,8. CLIP combines UV cross-linking of proteins and RNA molecules with rigorous purification schemes including denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. In combination with high-throughput sequencing technologies, CLIP has proven as a powerful tool to study protein-RNA interactions on a genome-wide scale (referred to as HITS-CLIP or CLIP-seq)9,10. Recently, PAR-CLIP was introduced that uses photoreactive ribonucleoside analogs for cross-linking11,12.
Despite the high specificity of the obtained data, CLIP experiments often generate cDNA libraries of limited sequence complexity. This is partly due to the restricted amount of co-purified RNA and the two inefficient RNA ligation reactions required for library preparation. In addition, primer extension assays indicated that many cDNAs truncate prematurely at the crosslinked nucleotide13. Such truncated cDNAs are lost during the standard CLIP library preparation protocol. We recently developed iCLIP (individual-nucleotide resolution CLIP), which captures the truncated cDNAs by replacing one of the inefficient intermolecular RNA ligation steps with a more efficient intramolecular cDNA circularization (Figure 1)14. Importantly, sequencing the truncated cDNAs provides insights into the position of the cross-link site at nucleotide resolution. We successfully applied iCLIP to study hnRNP C particle organization on a genome-wide scale and assess its role in splicing regulation14.

The spatial arrangement of RNA-binding proteins on a transcript is a key determinant of post-transcriptional regulation. Therefore, we developed individual-nucleotide resolution UV crosslinking and immunoprecipitation (iCLIP) that allows precise genome-wide mapping of the binding sites of an RNA-binding protein.

iCLIP - トランスクリプトーム全体の個々のヌクレオチド分解能タンパク質- RNA相互作用のマッピング

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1. Complex genomes encode at least hundreds of miRNAs, which primarily inhibit the expression of a vast number of target genes post-transcriptionally 2, 3. miRNAs control a broad range of biological processes 1. In addition, altered miRNA expression has been associated with human diseases such as cancers, and miRNAs may serve as biomarkers for diseases and prognosis 4, 5. It is important, therefore, to understand the expression and functions of miRNAs under many different conditions.
Three major approaches have been employed to profile miRNA expression: real-time PCR, microarray, and deep sequencing. The technique of miRNA microarray has the advantage of being high-throughput, generally less expensive, and most of the experimental and analysis steps can be carried out in a molecular biology laboratory at most universities, medical schools and associated hospitals. Here, we describe a method for performing custom miRNA microarray experiments. A miRNA probe set will be printed on glass slides to produce miRNA microarrays. RNA is isolated using a method or reagent that preserves small RNA species, and then labeled with a fluorescence dye. As a control, reference DNA oligonucleotides corresponding to a subset of miRNAs are also labeled with a different fluorescence dye. The reference DNA will serve to demonstrate the quality of the slide and hybridization and will also be used for data normalization. The RNA and DNA are mixed and hybridized to a microarray slide containing probes for most of the miRNAs in the database. After washing, the slide is scanned to obtain images, and intensities of the individual spots quantified. These raw signals will be further processed and analyzed as the expression data of the corresponding miRNAs. Microarray slides can be stripped and regenerated to reduce the cost of microarrays and to enhance the consistency of microarray experiments. The same principles and procedures are applicable to other types of custom microarray experiments.

A simple procedure of performing custom microRNA microarray experiments is described. The steps include isolating RNA, labeling RNA and reference DNA, hybridizing the samples to microarrays, scanning the microarrays, quantifying and analyzing hybridization signals.

カスタムmicroRNAのマイクロアレイの実験を行う

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1.  Complex genomes encode ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well as for modeling human diseases and testing therapeutic strategies. Recent advances in the use of designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system for site-specific genome engineering open the possibility to perform rapid targeted genome modification in virtually any laboratory species without the need to rely on embryonic stem (ES) cell technology. A genome editing experiment typically starts with identification of designer nuclease target sites within a gene of interest followed by construction of custom DNA-binding domains to direct nuclease activity to the investigator-defined genomic locus. Designer nuclease plasmids are in vitro transcribed to generate mRNA for microinjection of fertilized mouse oocytes. Here, we provide a protocol for achieving targeted genome modification by direct injection of TALEN mRNA into fertilized mouse oocytes.

Designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) can be used to modify the genome of mouse preimplantation embryos by triggering both the nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) pathways. These advances enable the rapid generation of mice with precise genetic modifications.

デザイナーヌクレアーゼを用いてマウスゲノムエンジニアリング

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell populations.&#160;These cultures contain the cells of interest, but are also contaminated with undifferentiated ESCs, non-neural derivatives and other neuronal subtypes.&#160; This limits their use in in vitro and in vivo applications, such as in vitro modeling for drug discovery or cell replacement therapy. To help overcome this, reporter cell lines, which offer a means to visualize, track and isolate cells of interest, can be engineered.&#160;However, to achieve this in human embryonic stem cells via conventional homologous recombination is extremely inefficient.&#160;This protocol describes targeting of the Pituitary homeobox 3 (PITX3) locus in human embryonic stem cells using custom designed zinc-finger nucleases, which introduce site-specific double-strand DNA breaks, together with a PITX3-EGFP-specific DNA donor vector. Following the generation of the PITX3 reporter cell line, it can then be differentiated using published protocols for use in studies such as in vitro Parkinson&#8217;s disease modeling or cell replacement therapy.

Reporter cell lines offer a means to visualize, track and isolate cells of interest from heterogeneous populations.&#160;However, gene-targeting using conventional homologous recombination in human embryonic stem cells is extremely inefficient. Herein, we describe targeting CNS midbrain specific transcription factor PITX3 locus with EGFP using zinc-finger nuclease enhanced homologous recombination.

ヒト胚性幹細胞におけるターゲティングジンクフィンガーヌクレアーゼ遺伝子の強化

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

細胞透過性のCysを用いて哺乳動物細胞への直接タンパク質送達<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt;ジンクフィンガードメイン

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gene-targeting mutagenesis is now possible in a wide range of organisms using genome editing techniques. Here, we demonstrate a protocol for targeted gene mutagenesis using transcription activator like effector nucleases (TALENs) in Astyanax mexicanus, a species of fish that includes surface fish and cavefish.

ゲノム編集中<em&gt;アステュアナクスmexicanus</em&gt;使用して転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a systematic approach combining different methodologies to assess the availability of zinc (Zn) in Atlantic salmon (Salmo salar). Considering that several Zn chemical species can be present in an Atlantic salmon feed, it was hypothesised that Zn availability is influenced by the Zn chemical species present in the feed. Thus, in this study, the first protocol is about how to extract the different Zn chemical species from the feed and to analyze them by a size exclusion chromatography-inductively coupled plasma mass spectroscopy (SEC-ICP-MS) method. Subsequently, an in vitro method was developed to evaluate the solubility of dietary Zn in Atlantic salmon feeds. The third protocol describes the method to study the impact of changing Zn chemical species composition on the uptake of Zn in a fish intestinal epithelial model using a rainbow trout gut cell line (RTgutGC). Together, the findings from the in vitro methods were compared with an in vivo study examining the apparent availability of inorganic and organic sources of Zn supplemented to Atlantic salmon feeds. The results showed that several Zn chemical species can be found in feeds and the efficiency of an organic Zn source depends very much on the amino acid ligand used to chelate Zn. The findings of the in vitro methods had less correlation with that outcome of the in vivo study. Nevertheless, in vitro protocols described in this article provided crucial information regarding Zn availability and its assessment in fish feeds.

This article explains in detail a systematic approach to assess micro-mineral availability in Atlantic salmon. The methodology includes tools and models with increasing biological complexity: (1) chemical speciation analysis, (2) in vitro solubility, (3) uptake studies in cell lines, and (4) in vivo fish studies.&#160;

大西洋サケにおける亜鉛の例を用いた相補的方法を用いた魚飼料の鉱物供給率の評価

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

CompoZrカスタムジンクフィンガーヌクレアーゼによるゲノム編集（ZFNs）

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