1. Benutzerdefinierte ZFN Design Process <ol><li> Um die ZFN Design Prozess zu beschleunigen, sollte ein Ermittler stellen: </li><ul><li> Informationen über das Ziel-Gen wie dem Gen-Namen, Arten und Gene Annotation / Identifikationsnummer. </li><li> Ein klar gesagt über-all Ziel des Experiments (zB Knockout oder Knockin) </li><li> Alle spezifischen Faktoren des Gens Ziel, das atypische Gen Aufbau, spezielle Biologie in der Genort verwickelt, oder keine homologen Regionen anderer Stelle im Genom enthalten. </li><li> Das spezifische DNA-Sequenz für die Zinkfinger-Nucleasen zum Ziel. </li></ul><li> Die Sigma Bioinformatik Team führt in silico Design zum ersten ZFN Zinkfinger Zielorten zu entwickeln. </li><li> Erste ZFN Zielorten an eine ZFN wissenschaftlichen technischer Berater zur Verfügung gestellt. Für weitere technisch komplexen Projekten arbeitet diese Sigma Wissenschaftler mit den Ermittlern, um das Projekt zu entwickeln. </li><li&gt; Das Sigma Bioinformatik Team führt eine Analyse mit ZFN Algorithmen, um in silico ZFN Designs generieren. Dazu gehört auch eine ganze Genom Suche nach Off-Target-Sites, wiederholen Sie die Maskierung und SNP-Analyse für jede potentielle ZFN Zielort. </li><li> Bioinformatik bietet die Top-ZFN Zielorten an die Ermittler für Kritik. Nach der Freigabe der potentielle ZFN Zielstellen, wird diese Information an die ZFN Produktionsteam vorgesehen, um die ZFN Herstellungsverfahren beginnen. </li></ol> 2. Benutzerdefinierte ZFN Produktion <ol><li> Die Sigma-Archiv von Zink-Finger-Module verwendet, die zugelassenen ZFN Designs montieren. </li><li> Jedes Design ZFN montiert und Sequenz auf einem hohen Durchsatz Klonen Plattform verifiziert. </li><li> Sobald die Produktion aller ZFN Designs abgeschlossen ist, wird jede ZFN wird zur Validierung geschickt. </li></ol> 3. Validierung von Custom ZFNs <ol><li> ZFN Projekte invon Mensch, Maus, Ratte oder CHO-Spezies in gut charakterisierten Zelllinien für jede Art validiert werden, wird ein Hefe-basierten Assays für andere Organismen oder Zelltypen verwendet. </li><li> ZFN Konstrukte werden in den entsprechenden Zelllinie durch Nukleofektion geliefert und die ZFNs ausgedrückt werden. </li><li> DNA wird aus dem Pool von ZFN transfizierten Zellen geerntet und die Region von Interesse PCR-amplifiziert. </li><li> Die Cel-1-Assay wird dann auf der PCR-Produkt durchgeführt. Die Gelelektrophorese basiert auf der Cel-1-Assay zu validieren ZFN Aktivität ausgeführt werden. </li><li> Die höchste Aktivität ZFN Design bestätigt durch die Cel-1-Assay wird dann an den Kunden. ZFNs sind in mRNA und Plasmid-DNA mit PCR-Primer für die Cel-1-Assay und genomische DNA als eine positive Kontrolle geliefert. </li></ol> 4. Lieferung von Validated ZFNs durch Nukleofektion <ol><li> Samen der Zellen bei einer Dichte von 2x10 5 Zellen / ml am Tag vor Nukleofektion. </li><li> Am Tag der Nukleofektion,nehmen Cell Line Nucleofector Kit V und lassen auf Raumtemperatur erwärmt. </li><li> Fügen Sie die Ergänzung des Nucleofection Lösung V nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Zählen Sie die Zellen. Die Zelldichte sollte zwischen 2,5-5x10 5 Zellen / ml liegen. </li><li> In eine Platte mit 6 Vertiefungen mit 2 ml des Mediums in jeder Vertiefung und Vorwärmen in einem CO 2-Inkubator bei 37 ° C für mindestens 20 Minuten vor Nukleofektion. </li><li> Zentrifuge 2x10 6 Zellen pro Transfektion (8x10 6 insgesamt) bei 200xg für 5 Minuten. </li><li> Waschen der Zellen zweimal mit 20 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS). </li><li> Bereiten experimentellen Röhren: (siehe Tabelle in Custom ZFN Technical Bulletin) </li><li> Entfernen Sie die 6-Well-Platte mit Medien aus Schritt (6,5) aus Inkubator. </li><li> Die Zellen in 400 ul (100 ul / Reaktion) von Nucleofection Lösung V. </li><li> Eine Reaktion zu einer Zeit, werden 100 ul Zellen zu jeder DNA oder mRNA-haltigen Rohr. Transfer das Gemisch auf eine 2 mm Elektroporationsküvette und nucleofect auf einem Nucleofector mit einem geeigneten Programm. </li><li> Unmittelbar nach Nukleofektion jeder Probe, Hilfe einer Pipette auf ~ 500 pl vorgewärmtem Medium aus der 6-Well-Platte in Schritt (6.9) hinzufügen, um die Küvette. Dann transferieren Sie Zellen aus der Küvette mit dem übrigen vorgewärmtem Medium in der 6-Well-Platte. </li><li> Beende alle Reaktionen und senden Sie das 6-Well-Platte auf die CO 2-Inkubator bei 37 ° C </li></ol> 5. Ernte genomische DNA nach Lieferung der ZFNs <ol><li> 6-Well-Platte - nicht ernten all der gepoolten Zellen. Es ist wichtig, um die Kultur zu erhalten, um Zellen zu einzelnen Zelle Verdünnung Klon haben, nachdem Sie, dass Sie Cel-1 Verdauung Produkte zu bestätigen. Ein bis drei Tage nach Nukleofektion Sammeln der Zellen chromosomale DNA herzustellen mit der GenElute Säuger genomische DNA-Miniprep-Kit. </li></ol> 6. Cel-1-Test </p&gt; <ol><li> PCR-Amplifikation der genomischen DNA aus den Proben ZFN transfizierten und der positiven Kontrolle genomischer DNA mit dem Kit mitgeliefert, mit den mitgelieferten Primer. (Siehe Tabelle in Custom ZFN Technical Bulletin): Die PCR-Reaktion wird mit den folgenden Bedingungen eingestellt. </li><li> Um Heteroduplexe aus den PCR-Homoduplexe generieren nehmen 10 ul PCR-Reaktion aus jeder ZFN behandelten Probe zuzüglich der Kontrolle und verwenden Sie das folgende Programm auf einem Thermocycler: 95 ° C, 10 Minuten 95 ° C bis 85 ° C, 2 ° C / Sekunde 85 ° C bis 25 ° C, -0,1 ° C / Sekunde 4 ° C, auf unbestimmte Zeit </li><li> Fügen Sie 1 ul-Enhancer und 1 ul Nuclease S (ab Transgenomic Katalognummer 706025) zu jeder Reaktion und inkubieren bei 42 ° C für 20-40 Minuten. </li><li> Führen Sie die Aufschlüsse auf einem 10% PAGE-TBE-Gel mit der richtigen Marker wie DirectLoad WideRange DNA-Leiter (Katalognummer D7058) (siehe Ergebnisse in Custom ZFN Technical Bulletin). </li><li> Aufce positives Signal in ZFN-behandelten Population wurde durch Cel-I-Test nachgewiesen, um klonale Isolierung und Charakterisierung fort. </li></ol> 7. Klonale Isolierung und Charakterisierung <ol><li> Einzel-Zell-Klon die ZFN-behandelten Proben mittels Standardverfahren einschließlich FACS und Verdünnungsklonierung. </li><li> Lassen Sie die Klone, um ausreichend zu erweitern, dann spalten gewissen Anteil an Zellen für genomische DNA Ernte, Einfrieren wieder den Rest als überhöhte Material. </li><li> Verstärken genomische DNA aus den Klonen unter Verwendung der Primer Cel-I und Analyse der Fragments durch Cel-I-Assay (mit und ohne WT DNA versetzt in), oder alternativ diese Amplikon, direkt zum Genotypisierung. </li><li> Genotyp Kandidaten-Klone als mit bearbeitet Allele durch das bevorzugte Verfahren identifiziert. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel des gesamten CompoZr ZFN Workflow ist in 2 dargestellt. ZFNs geliefertdie Zellen, wo sie binden und zu spalten die entsprechende DNA-Sequenz, die eine Doppel-(DSB) erstellt. Die natürliche Reparatur-Prozess, nicht-homologe Endverbindung (NHEJ), repariert die DSB. In einigen Fällen aberrante NHEJ kommt es zur Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden. PCR-Amplifikation von genomischer DNA geerntet Ergebnisse in Heteroduplex-Bildung zwischen Wildtyp und modifiziert Amplikons nach der Denaturierung / Annealing-Schritts der PCR-Reaktion. Die Zugabe der Cel-1-Enzym zur Spaltung keine Heteroduplexmoleküle. Cel-1 Ergebnisse werden durch PAGE-Analyse gelöst zu ZFN Spaltung zu bestätigen. Abbildung 3 zeigt eine schematische Darstellung des Cel-1-Test und der erwarteten Ergebnisse. Repräsentative Cel-1 Ergebnisse sind in den 4 und 5 enthalten Abbildung 4 enthält aus einer sehr aktiven Paar ZFNs (21%) in K562-Zellen;. Abbildung 5 enthält die Ergebnisse von einer weniger aktiven Paar (2,4%) der ZFNs inK562-Zellen. ZFN-Aktivität ist in beiden Figuren durch die Anwesenheit von zwei PCR-Fragmente unter der elterlichen PCR-Fragment bestätigt. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig1.jpg" alt="1" /> Abbildung 1. Darstellung der gebundenen Zink-Finger-Nukleasen. ZFNs sind Proteine ​​einer Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne, fusioniert an die Spaltdomäne des FokI-Restriktionsendonuklease umfasst entwickelt. Wenn als ein Heterodimer gebunden ist, zu schaffen ZFNs eine doppelsträngige Pause zu einer vom Benutzer angegebenen DNA-Sequenz. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig2.jpg" alt="2" /> Abbildung 2. Schematische Darstellung des benutzerdefinierten ZFN Service-Workflow. Grafische Darstellung der Workflow um einen gentechnisch veränderten Zelllinie unter Verwendung CompoZr ZFNs generieren. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Schematische Darstellung des Cel-1-Test und die Ergebnisse. A) ZFN Plasmid-o<html> r mRNA an Zellen geliefert. B) ausgedrückt ZFNs binden und schneiden sich Zielsequenz, eine doppelte (DSB) in einem Teil der Zellen. C) aberrante Reparatur von einigen DSBs durch nicht-homologe Endverknüpfung Ergebnisse in der Nucleotid-Insertion oder Deletion. D) Genomische DNA wird aus dem Pool von transfizierten Zellen geerntet und verstärkt an der Stelle von Interesse. EF) PCR-Produkt wird denaturiert und erneut geglüht schaffen Heteroduplexbildung zwischen Wildtyp und modifiziert Amplikons. G) Die Cel-1 Fehlpaarungsendonuclease Assay zur Spaltung von Heteroduplex-Moleküle. H) Cel-1-Enzym verdaut werden durch PAGE aufgelöst. Das beobachtete Verhältnis von Spaltprodukt auf eine parenterale Band, das von ImageJ Software bestimmt, zeigt die Fraktion Schnitt und die Effizienz der ZFNs. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Cel-1 ergibt sich aus 21% aktiven ZFNs ImageJ Software finden Sie unter.:_blank &quot;&gt; http://rsbweb.nih.gov/ij/. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Cel-1 ergibt sich aus 2,4% aktive ZFNs ImageJ Software ist verfügbar unter:. <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> .

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Forscher können ZFN veränderten Zellen oder Tiere zu Kollaborateuren unter dem Standard-Forschung Lizenzvertrag zu versehen. Unter diesen Umständen fragt, Sigma, dass ein Material Transfer Agreement an Ort und Stelle befindet sich zwischen Sigma, das ZFN Kunden und ihre Mitarbeiter setzen. : Die Forschungs-Lizenz kann eingesehen werden unter <a href="http://www.sigma.com/zfn" target="_blank">http://www.sigma.com/zfn</a> . Wenn es ein Potenzial für eine kommerzielle Anwendung mit ZFN modifizierten Zellen Sigma fragt dann, dass eine kommerzielle Lizenz an Ort und Stelle gelegt wird. Produktion und freien Zugang zu diesem Beitrag wird von Sigma, Inc. gesponsert

Sobald ZFN-modifizierten Zellen werden isoliert haben sie dauerhafte und vererbbare Änderungen der DNA. Daraus ergibt sich die Möglichkeit, stabil veränderte Zelllinien oder Zuchttiere mit gewünschten genetischen Veränderungen zu erzeugen, um Forschung zu betreiben. CompoZr Benutzerdefinierte ZFNs bieten eine robuste Methode zur Genom-Bearbeitung in einer Vielzahl von Zelltypen. Veröffentlichung der erfolgreichen Bearbeitung mit ZFNs Genom beinhaltet, ist aber nicht zu humanen Zelllinien, Maus, Ratte, Zebrafisch, Frosch-, Schweine-und CHO-Forschung Modelle beschränkt. 3,4,5,6,7,8,9 die Möglichkeit, eine zu erstellen doppelsträngigen Bruch an der gewünschten Zielstelle in der angegebenen Zelltyp ist gewährleistet, wenn die ZFNs ordnungsgemäß in eine Zelle abgegeben werden. Es ist auch möglich, sequentielle Zink-Finger-Modifikationen zu einer Zelle durchzuführen, um mehr als eine genetische Veränderung innerhalb einer Zelle zu haben. 10. Die Fähigkeit, eine spezifische Ziel-Sequenz wählen und nur zu modifizieren, dass bestimmten Locus ist eine der Hauptursachen für die Fähigkeit, mehrere erstellen ModifikationenKationen. Die CompoZr Benutzerdefinierte ZFN Zertifikat von Analyse wird mit den sehr Reagenzien im Kit wodurch sichergestellt, dass alle Komponenten des Kits sind sorgfältig den Erfolg unserer Kunden bestätigt vorausgesetzt generiert. Kritische Schritte des Workflows von Anfang bis Ende sind nachfolgend dargestellt: Zellklonierung Die Fähigkeit zu isolieren und zu erweitern eine bestimmte Zelllinie sollten vor Beginn jeder ZFN getestet werden. Einzelne Zellen zu isolieren und erweitert werden, um sicherzustellen, dass ein klonal abgeleitete Bevölkerung möglich ist. Manche Zelllinien sind in dieser Angelegenheit widerspenstigen und Tricks wie Bereicherung für Klone bearbeitet oder Kultur mit konditionierten Medien können helfen, diese Herausforderungen zu meistern. Liefer-Effizienz Optimierung der Lieferzeiten Effizienz ist ein Muss vor der Lieferung der ZFNs. Es können viele Verfahren, einschließlich Lipid-basierte Transfektion, Elektroporation und nucleofecti verwendet werdenauf. Die ideale Lieferung Methode besteht darin, eine, die die optimale Mischung aus Effizienz und Lieferung das Überleben der Zelle liefert. Quantifizieren diese Effizienz kann durch die Bereitstellung einer GFP-Kontroll-Plasmid und zur quantitativen Bestimmung durch visuelle Inspektion oder FACS 24 48 Stunden nach der Lieferung geschätzt werden. Cel-I-Test Es ist zwingend notwendig, dass Cel-I-Test parallel mit den entsprechenden Kontrollen durchgeführt, um sicherzustellen, dass PCR, Verdauung und Elektrophorese-Parameter werden nicht mit der Interpretation von ZFN Experiment stören. Jedes Kit beinhaltet Kontrolle genomischer DNA, mit der die Cel-I-Bild in der Bescheinigung über die Analyse zu erstellen. Verstärkung aus der Kontroll-DNA mit den mitgelieferten Primer durch Cel-I-Test gefolgt wird dem Benutzer erlauben, die Ergebnisse mit, dass in dem Certificate of Analysis (CofA) Bild zu vergleichen, und zu isolieren, mögliche Ineffizienzen in diesem Aspekt eines Experiments. Eine entsprechende negative Kontrolle z. B. irreführende oder GFP behandelten ZelleProbe sollte ebenfalls enthalten, um Aufklärung über alle nicht-spezifische Spaltung Erzeugnisse zu ermöglichen. Qualitative / Quantitative Analyse von Einzel-Zell-Klone Nach ZFN Behandlung und Einzelzell-Klonierung, können die Populationen von Zellen für die Bearbeitung an dem Ort von Interesse durch eine Anzahl von Verfahren gescreent werden. Cel-I-Assay kann mit genomischer DNA von Klonen werden zum Zwecke der Identifizierung von Kandidaten-Klone für weitere Genotypisierung durchgeführt. Es ist wichtig, Spike WT PCR-Fragments in die Probe Amplikons im Verhältnis 1:1 vor der Durchführung der Cel-I verdauen als homozygot mutierten Klone homogene Moleküle enthalten wird, zu vermitteln und damit einen negativen Cel-I-Test Ergebnis. Ein alternatives Verfahren zum Screening von Kandidaten-Klone diese ist, um einen PCR-Primer Landung direkt auf der ZFN Zielstelle zu entwerfen. In Verbindung mit einem der Kontroll-Primer, zeigt ein negatives Ergebnis Ergebnis Verlust des WT-Sequenz. Eine heterozygote Klon, enthaltend mindestens eine WT-Allel yield PCR-Signal, sondern kann aus vollständig WT Klone durch die Durchführung der PCR im Zusammenhang mit SYBR qPCR getrennt werden. Sobald Kandidaten-Klone durch die obigen Verfahren identifiziert wurden, können sie durch Standard-Pyrosequenzierung, tief-Sequenzierung oder anderen Sequenzierverfahren genotypisiert werden. Für alle Sequenzierungsmethoden, sollte ein Fragment aus der genomischen DNA klonale erstellt generiert werden. Für traditionelle Pyrosequenzierung Allele können durch TA-Klonierung der PCR-Produkt getrennt werden, und Sequenzierung der einzelnen Kolonien. Für Methoden, wie tief die Sequenzierung dieser Schritt ist nicht erforderlich. Homologie Regie Repair (HDR) Dieses Protokoll bietet die Methode für die ZFN vermittelte Gen-Knockout über NHEJ. Integration von Transgenen kann auch durch Einführung eines Donor-Plasmids mit Homologiearme durchgeführt werden, die Flanke eine ZFN Schnitt Seite. 11. In diesem Szenario wird das ZFN erstellt doppelsträngigen Pause von HDR anstelle von NHEJ repariert wird. HDR gerichtet integration von Transgenen kann bestätigt mit ähnlichen Methoden auf die Verfahren in diesem Protokoll zur Verfügung gestellt werden. Fehlerbehebung Lieferung von ZFNs ZFN Lieferung und Ausdruck-Lieferung können durch Lieferung einer GFP oder andere solche Plasmid für die Visualisierung und / oder die Quantifizierung. Gesteuert werden Niedrige Expression aufgrund Promoter Inkompatibilität mit dem Zelltyp von Interesse können durch Zustellung ZFNs in mRNA-Format überwunden werden. Darüber hinaus kann die Kälte-Schock-Methode verwendet werden, um weiteren Erhöhung der Wirksamkeit von ZFNs in Zellen. 12. Wenn mRNA verwendet wird es unerlässlich, dass die Zellen vor der Lieferung gewaschen, um sicherzustellen, dass alle aus Serum stammender RNasen wurden entfernt wird. Es ist auch klug, um die mRNA auf Eis auftauen, und fügen Sie es zu den Zellen im allerletzten Moment eine Chance für den Abbau zu minimieren. Cel-I-Test Die Gründung der Cel-I ASSAy ist spezifisch und ausreichend Verstärkung des Locus von Interesse. Wenn nicht-spezifische Amplifikationsprodukte beobachtet werden verwenden Standard-PCR-Verfahren zur Problembehandlung, um die Spezifität wie Optimierung der Vorlage Betrag, Primer-Konzentration, und Radfahren Parameter zu erhöhen. Führen Sie PAGE-Analyse als Standard zu Agaroseelektrophorese entgegengesetzt, wie das letztgenannte Verfahren keine ausreichende Auflösung und Empfindlichkeit. Cel-I-Digest Bedingungen können auch optimiert werden, wenn nicht verdaute Produkt oder übermäßigen Schlieren beobachtet werden. Titration der Menge an Cel-1-Nuclease und / oder Länge der Kochzeit kann titriert werden, um diese Aspekte zu verbessern.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Nuclease S (Cel-1-Enzym) </td><td> Transgenomic </td><td> 706025 </td></tr><tr><td> Expand High Fidelity PCR System </td><td> Roche </td><td> 03 300 242 001 </td></tr><tr><td> Cell Line Nucleofector Kit V </td><td> Lonza </td><td> VCA-1003 </td></tr><tr><td> GenElute HP endotoxinfreier Plasmide Maxiprep Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

genome editing with compozr custom zinc finger nucleases (zfns)

Genome-Bearbeitung ist eine leistungsfähige Technik, die verwendet werden, um Genfunktionen und den genetischen Grundlagen von Erkrankungen aufklären können. Traditionelle Gen Bearbeitungsmethoden wie chemisch-basierten Mutagenese oder zufällige Integration von DNA-Sequenzen übertragen wahllosen genetischen Veränderungen in einer allgemeinen ineffizient und erfordern Einbau von unerwünschten oder synthetische Sequenzen mit aberranter Kulturbedingungen, möglicherweise verwirrend biologische Studie. Im Gegensatz dazu können transiente ZFN Expression in einer Zelle ermöglichen präzise, ​​vererbbare Gen-Bearbeitung in sehr effizienter Weise ohne die Notwendigkeit für die Verwaltung von Chemikalien oder die Integration von synthetischen Transgene. Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) sind Enzyme, die binden und schneiden verschiedene Sequenzen der doppelsträngigen DNA (dsDNA). Eine funktionale CompoZr ZFN Gerät besteht aus zwei einzelnen monomeren Proteine, die eine DNA &quot;half-site&quot; binden von ca. 15-18 Nukleotiden (siehe Abbildung 1). Wenn zwei ZFN MonoMers &quot;nach Hause&quot; zu ihren benachbarten Zielstellen die DNA-Spaltung Domänen dimerisieren und erstellen Sie ein Doppel-(DSB) in der DNA. 1 Einführung von ZFN-vermittelte DSBs im Genom wird die Grundlage für hocheffiziente Genom-Bearbeitung. Imperfect Reparatur von DSB in einer Zelle über die nicht-homologen Ende (NHEJ) DNA-Reparaturwegs in kleine Insertionen und Deletionen (indels) führen. Erstellung der indels innerhalb des Gens kodierende Sequenz von einer Zelle in Leserasters nachfolgenden funktionellen Knockout eines Genlocus mit hoher Effizienz. 2 ergeben Während dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von ZFNs, ein Gen-Knockout erstellen, Integration von Transgenen kann auch über durchgeführt werden Homologie-gerichteten Reparatur an der ZFN Schnitt vor Ort. Die CompoZr Benutzerdefinierte ZFN-Service stellt eine systematische, umfassende und gut charakterisierten Ansatz zur gezielten Gen-Bearbeitung für die wissenschaftliche Gemeinschaft mit ZFN Technologie. Sigma Forscher arbeiten eng mit den Ermittlern zu 1) perform Due-Diligence-Analyse einschließlich der Analyse der relevanten Gen-Struktur, Biologie und Modell-System gemäß den Projektzielen, 2) wenden dieses Wissen auf eine solide Targeting-Strategie, 3 entwickeln), dann planen, bauen, und funktionell zu validieren ZFNs für Aktivität in einer entsprechenden Zelllinie. Der Prüfer erhält positive Kontrolle genomischer DNA und Primer, und ready-to-use ZFN Reagenzien sowohl in Plasmid-DNA und in-vitro-transkribierten mRNA-Format geliefert. Diese Reagenzien können dann für die transiente Expression in des Ermittlers Zelllinie oder Zelltyp der Wahl geliefert werden. Die Proben werden dann für die Gen-Bearbeitung an dem Ort von Interesse durch molekularbiologische Standardtechniken, einschließlich PCR-Amplifikation, enzymatischen Verdau und Elektrophorese getestet. Nach dem positiven Signal für die Gen-Editing in der Anfangsphase Bevölkerung erkannt wird, sind Single-Cell-Zellen geklont und genotypisiert zur Identifizierung von Mutanten-Klone / Allele.

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Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

Die CompoZr Benutzerdefinierte Zinkfinger-Nuclease (ZFN) Service ermöglicht die präzise Bearbeitung Genoms in jedem Organismus oder einer Zelllinie an jedem Ort durch den Anwender definiert. Dieser Artikel beschreibt das Verfahren für die Konstruktion, Herstellung, Prüfung und Umsetzung der CompoZr Benutzerdefinierte ZFN-Service.

Genome Editing mit CompoZr Benutzerdefinierte Zinkfinger Nukleasen (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

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Universidad de Cartagena UDEC

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Biology

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

25.3K Aufrufe.  Sigma Life Science. Die CompoZr Benutzerdefinierte Zinkfinger-Nuclease (ZFN) Service ermöglicht die präzise Bearbeitung Genoms in jedem Organismus oder einer Zelllinie an jedem Ort durch den Anwender definiert. Dieser Artikel beschreibt das Verfahren für die Konstruktion, Herstellung, Prüfung und Umsetzung der CompoZr Benutzerdefinierte ZFN-Service.

Serie: Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human development and investigate the pathophysiology of disease. By employing site-specific nucleases (SSNs) for genome editing, the rapid derivation of new hPSC lines harboring specific genetic alterations in an otherwise isogenic setting becomes possible. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 are the most commonly used SSNs. All of these nucleases function by introducing a double stranded DNA break at a specified site, thereby promoting precise gene editing at a genomic locus. SSN-meditated genome editing exploits two of the cell&#39;s endogenous DNA repair mechanisms, non-homologous end joining (NHEJ) and homology directed repair (HDR), to either introduce insertion/deletion mutations or alter the genome using a homologous repair template at the site of the double stranded break. Electroporation of hPSCs is an efficient means of transfecting SSNs and repair templates that incorporate transgenes such as fluorescent reporters and antibiotic resistance cassettes. After electroporation, it is possible to isolate only those hPSCs that incorporated the repair construct by selecting for antibiotic resistance. Mechanically separating hPSC colonies and confirming proper integration at the target site through genotyping allows for the isolation of correctly targeted and genetically homogeneous cell lines. The validity of this protocol is demonstrated here by using all three SSN platforms to incorporate EGFP and a puromycin resistance construct into the AAVS1 safe harbor locus in human pluripotent&#160;stem cells.

Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.

Einrichtung von Genom bearbeitet humanen pluripotenten Stammzelllinien: Von Targeting zur Isolation

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development of a customizable platform to rapidly generate gene modifications in a wide variety of organisms, including zebrafish. CRISPR-based genome editing uses a single guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to a genomic DNA (gDNA) target of interest, where the Cas endonuclease generates a double-strand break (DSB). Repair of DSBs by error-prone mechanisms lead to insertions and/or deletions (indels). This can cause frameshift mutations that often introduce a premature stop codon within the coding sequence, thus creating a protein-null allele. CRISPR-based genome engineering requires only a few molecular components and is easily introduced into zebrafish embryos by microinjection. This protocol describes the methods used to generate CRISPR reagents for zebrafish microinjection and to identify fish exhibiting germline transmission of CRISPR-modified genes. These methods include in vitro transcription of sgRNAs, microinjection of CRISPR reagents, identification of indels induced at the target site using a PCR-based method called a heteroduplex mobility assay (HMA), and characterization of the indels using both a low throughput and a powerful next-generation sequencing (NGS)-based approach that can analyze multiple PCR products collected from heterozygous fish. This protocol is streamlined to minimize both the number of fish required and the types of equipment needed to perform the analyses. Furthermore, this protocol is designed to be amenable for use by laboratory personal of all levels of experience including undergraduates, enabling this powerful tool to be economically employed by any research group interested in performing CRISPR-based genomic modification in zebrafish.

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Targeted genome editing in the model system Danio rerio (zebrafish) has been greatly facilitated by the emergence of CRISPR-based approaches. Herein, we describe a streamlined, robust protocol for generation and identification of CRISPR-derived nonsense alleles that incorporates the heteroduplex mobility assay and identification of mutations using next-generation sequencing.

Effiziente Produktion und Kennzeichnung der CRISPR/Cas9 generiert gen Knockouts im Modellsystem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Genetik

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

Verbesserte Genom Bearbeitung mit Cas9 Ribonucleoprotein in verschiedenen Zellen und Organismen

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

The bacterial Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) system has been harnessed by researchers to study important biologically relevant problems. The unparalleled power of the CRISPR/Cas genome editing method allows researchers to precisely edit any locus of their choosing, thereby facilitating an increased understanding of gene function. Several methods for editing the C. elegans genome by CRISPR/Cas9 have been described previously. Here, we discuss and demonstrate a method which utilizes in vitro assembled ribonucleoprotein complexes and the dpy-10 co-CRISPR marker for screening. Specifically, in this article, we go through the step-by-step process of introducing premature stop codons into the C. elegans rbm-3.2 gene by homology-directed repair using this method of CRISPR/Cas9 editing. This relatively simple editing method can be used to study the function of any gene of interest and allows for the generation of homozygous-edited C. elegans by CRISPR/Cas9 editing&#160;in less than two weeks.

CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

The goal of this protocol is to enable seamless CRISPR/Cas9 editing of the C. elegans genome using assembled ribonucleoprotein complexes and the dpy-10 co-CRISPR marker for screening. This protocol can be used to make a variety of genetic modifications in C. elegans including insertions, deletions, gene replacements and codon substitutions.

CRISPR/Cas9-Editierung des C. elegans rbm-3.2-Gens mit dem dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker und Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

The bacterial Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) system has been ...

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging model systems. CRISPR-Cas genome editing systems use a synthetic guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to specific genomic DNA loci, where the Cas endonuclease generates a double-strand break. The repair of double-strand breaks by intrinsic error-prone mechanisms leads to insertions and/or deletions, disrupting the locus. Alternatively, the inclusion of double-stranded DNA donors or single-stranded DNA oligonucleotides in this process can elicit the inclusion of precise genome edits ranging from single nucleotide polymorphisms to small immunological tags or even large fluorescent protein constructs. However, a major bottleneck in this procedure can be finding and isolating the desired edit in the germline. This protocol outlines a robust method for screening and isolating germline mutations at specific loci in Danio rerio (zebrafish); however, these principles may be adaptable in any model where in vivo sperm collection is possible.

CRISPR-Cas technologies have revolutionized the field of genome editing. However, finding and isolating the desired germline edit remains a major bottleneck. Therefore, this protocol describes a robust method for quickly screening F0 CRISPR-injected zebrafish sperm for germline edits using standard PCR, restriction digest, and gel electrophoresis techniques.

Screening von Spermien zur schnellen Isolierung von Keimbahnveränderungen im Zebrafisch

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal experiments. When generating animal models, the electroporation of zygotes offers higher efficiency, simplicity, cost, and throughput as an alternative to the gold standard method of microinjection. Electroporation is also gentler, with higher viability, and reliably delivers Cas9/single-guide RNA (sgRNA) ribonucleoproteins (RNPs) into the zygotes of common laboratory mouse strains (e.g., C57BL/6J and C57BL/6N) that approaches 100% delivery efficiency. This technique enables insertion/deletion (indels) mutations, point mutations, the deletion of whole genes or exons, and small insertions in the range of 100-200 bp to insert LoxP or short tags like FLAG, HA, or V5. While constantly being improved, here we present the current state of CRISPR-EZ in a protocol that includes sgRNA production through in vitro transcription, embryo processing, RNP assembly, electroporation, and the genotyping of preimplantation embryos. A graduate-level researcher with minimal experience manipulating embryos can obtain genetically edited embryos in less than 1 week using this protocol. Here, we offer a straightforward, low-cost, efficient, high-capacity method that could be used with mouse embryos.

Here, we describe a simple technique intended for the efficient generation of genetically modified mice called CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). This method delivers editing reagents by electroporation into embryos at an efficiency approaching 100%. This protocol is effective for point mutations, small genomic insertions, and deletions in mammalian embryos.

Effiziente Genom-Editierung von Mäusen durch CRISPR-Elektroporation von Zygoten

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well as for modeling human diseases and testing therapeutic strategies. Recent advances in the use of designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system for site-specific genome engineering open the possibility to perform rapid targeted genome modification in virtually any laboratory species without the need to rely on embryonic stem (ES) cell technology. A genome editing experiment typically starts with identification of designer nuclease target sites within a gene of interest followed by construction of custom DNA-binding domains to direct nuclease activity to the investigator-defined genomic locus. Designer nuclease plasmids are in vitro transcribed to generate mRNA for microinjection of fertilized mouse oocytes. Here, we provide a protocol for achieving targeted genome modification by direct injection of TALEN mRNA into fertilized mouse oocytes.

Designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) can be used to modify the genome of mouse preimplantation embryos by triggering both the nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) pathways. These advances enable the rapid generation of mice with precise genetic modifications.

Maus-Genom-Engineering mit Designer Nukleasen

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Biologie

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell populations.&#160;These cultures contain the cells of interest, but are also contaminated with undifferentiated ESCs, non-neural derivatives and other neuronal subtypes.&#160; This limits their use in in vitro and in vivo applications, such as in vitro modeling for drug discovery or cell replacement therapy. To help overcome this, reporter cell lines, which offer a means to visualize, track and isolate cells of interest, can be engineered.&#160;However, to achieve this in human embryonic stem cells via conventional homologous recombination is extremely inefficient.&#160;This protocol describes targeting of the Pituitary homeobox 3 (PITX3) locus in human embryonic stem cells using custom designed zinc-finger nucleases, which introduce site-specific double-strand DNA breaks, together with a PITX3-EGFP-specific DNA donor vector. Following the generation of the PITX3 reporter cell line, it can then be differentiated using published protocols for use in studies such as in vitro Parkinson&#8217;s disease modeling or cell replacement therapy.

Reporter cell lines offer a means to visualize, track and isolate cells of interest from heterogeneous populations.&#160;However, gene-targeting using conventional homologous recombination in human embryonic stem cells is extremely inefficient. Herein, we describe targeting CNS midbrain specific transcription factor PITX3 locus with EGFP using zinc-finger nuclease enhanced homologous recombination.

Zinkfinger-Nuklease Verbesserte Gene Targeting in humanen embryonalen Stammzellen

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but protospacer adjacent motif (PAM) limitations are a major obstacle to creating accurate animal models of human genetic disorders caused by single-nucleotide variants (SNVs). Until now, some SpCas9 variants with broad PAM compatibility have shown efficiency in zebrafish. The application of the optimized SpRY-mediated adenine base editor (ABE), zSpRY-ABE8e, and synthetically modified gRNA in zebrafish has enabled efficient adenine-guanine base conversion without PAM restriction. Described here is a protocol for efficient adenine base editing without PAM limitation in zebrafish using zSpRY-ABE8e. By injecting a mixture of zSpRY-ABE8e mRNA and synthetically modified gRNA into zebrafish embryos, a zebrafish disease model was constructed with a precise mutation that simulated a pathogenic site of the TSR2 ribosome maturation factor (tsr2). This method provides a valuable tool for the establishment of accurate disease models for studying disease mechanisms and treatments.

This protocol describes how to perform efficient adenine base editing without PAM limitation to construct a precise zebrafish disease model using zSpRY-ABE8e.

Effizientes PAM-loses Baseneditieren für die Zebrafisch-Modellierung menschlicher genetischer Erkrankungen mit zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but ...

Genome Editing

A well-established technique for modifying specific sequences in the genome is gene targeting by homologous recombination, but this method can be laborious and only works in certain organisms. Recent advances have led to the development of &#8220;genome editing&#8221;, which works by inducing double-strand breaks in DNA using engineered nuclease enzymes guided to target genomic sites by either proteins or RNAs that recognize specific sequences. When a cell attempts to repair this damage, mutations can be introduced into the targeted DNA region. In this video, JoVE explains the principles behind genome editing, emphasizing how this technique relates to DNA repair mechanisms. Then, three major genome editing methods&#8212;zinc finger nucleases, TALENs, and the CRISPR-Cas9 system&#8212;are reviewed, followed by a protocol for using CRISPR to create targeted genetic changes in mammalian cells. Finally, we discuss some current research that applies genome editing to alter the genetic material in model organisms or cultured cells.