この作品は、ミセスクリフォードエルダーホワイトグラハムがCBに、NIH（AR052791、AR044387 - ARRA、＆NS063298）からLTTに研究基金とNIHの（AR059838）寄附からの補助金によって、医学サイトメトリーのベイラー大学によってサポートされていましたNIH（NCRR S10RR024574、NIAID AI036211、＆NCI P30CA125123）からの資金でコアをソートしてセル。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしもNIHの公式見解を表すものではありません。

1。細胞の染色<ol><li>細胞を準備します。それでも積極的に（ - 80％コンフルエント60）成長中の細胞を使用する必要があります。回復するために2時間-血清は、一晩30分間インキュベーター内で24ウェルプレートと場所に0.5 mLの無血清培地（37℃、5％CO 2）にも当たり0.1万でプレートそれらの細胞を細胞を飢えさせるトリプシン処理から。 </li><li>一次および二次抗体を混ぜる。ミックス（AlexaFluor 488コンジュゲート1μL二次ニワトリ抗ヤギIgG抗体と一次抗GLUT4抗体の5μL）井戸のx数。暗闇の中で、室温で10分間インキュベートする。 </li><li>培地で希釈してインスリンの2X作業用ストックを準備します。 </li><li>細胞が付着したかしていないかどうかを確認します。 </li><li>穏やかに細胞を含むウェルにインスリンのご2X作業用ストックの6μL抗体ミックスと0.5 mLを加える。培地のいずれかの乱流を避けてください。暗所で30分間インキュベート（37℃、5％CO 2）、。 </li><li>細胞を振盪せずに、各ウェルにPBS + 1％PFAの0.5 mLを加えることによって細胞を固定する。暗闇の中で、室温で20分間インキュベートする。 </li><li>あなたの細胞がウェルに付着している場合は、軽く細胞リフターでそれらを持ち上げます。あなたのフローサイトメーターに適合して細胞をペレット化する遠心チューブに細胞を（1 mLの合計）に転送します。 </li><li> 0.4 mLのPBS + 1％PFAで1 mLのPBSに懸濁するで二回ペレットを洗浄します。この時点で、細胞はホイルでラップすることができますし、冷蔵庫に保存されている（4-8 ° C）または即時のデータ取得のためのフローサイトメーターに撮影。 </li></ol> 2。データ収集<ol><li>側方散乱光（SSC）に対する前方散乱光（FCS）パネルで、生細胞の周り広範なゲートを設定します。おFL1パラメータを設定するには、負のチューブを（アイソタイプコントロールとインスリンや細胞で処理していない細胞&quot;ステンドグラス&quot;）を使用してください。あなたのピークは、パネルで完全に下側のカットではないことを確認してください。 </li><li>チューブごとに少なくとも10,000個の細胞からデータを取得する。 </li></ol> 3。データ解析<ol><li> SSC VS FSCパネル（図1A）で生細胞の周りにゲートを描きます。 AlexaFluor 488蛍光強度に対する生細胞ゲート内の細胞（図1B）の数のヒストグラムをプロット。あなたは（図1C）の違いを視覚化する別のヒストグラムをオーバーレイが定量のために、各細胞集団の平均値と中央値蛍光強度を判断し、比較のためにこれらの番号を使用することができます。 </li><li>として図の1Cと1Dに示すようにインスリンの非存在下で得られた値にデータを正規化する。 </li></ol> 4。代表的な結果健常者（無インスリン抵抗性）から分離された筋芽細胞で、インスリンは細胞質から形質膜（図1、左）へのGLUT4の用量依存性の転座を誘発する。対照的に、インスリンは、インスリン抵抗性（図1、右）の患者から分離された筋芽細胞の形質膜へのGLUT4トランスロケーションを誘導しない。 <img src="/files/ftp_upload/2429/2429fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。染色実験の例。の筋芽細胞がインスリン抵抗性のないドナー（左）からとインスリン抵抗性（右）患者から分離された。生細胞の周りのゲートと、SSC（側方散乱光）に対するFCS（前方散乱）プロット。B、セルはゲート、GLUT4の外部エピトープに対する抗体で染色し、そして非刺激左（赤）またはインスリン1nMの（青）、10nMの（オレンジ）、または100 nm（緑）で刺激した。図をわかりやすくするために、我々は唯一、C。インスリン抵抗性を持つ細胞に100 nMのインスリンなしとでデータを表示Bに示すようにヒストグラムの蛍光強度（MFI）の平均（無インシュリン）非刺激のまま細胞のMFIに標準化した。 D、Bに示すように、ヒストグラムから正規化されたMFIのデータのプロット

<ol>
	<li>Zhao, F. Q., Keating, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+and+genomics+of+glucose+transporters.">Functional properties and genomics of glucose transporters.</a> Curr. Genomics. 8, 113-128 (2007).</li><li>Karnieli, E., Armoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+the+insulin-responsive+glucose+transporter+GLUT4+gene:+from+physiology+to+pathology.">Transcriptional regulation of the insulin-responsive glucose transporter GLUT4 gene: from physiology to pathology.</a> Am. J. Endocrinol. Metab. 295, 38-45 (2008).</li><li>Graham, T. E., Kahn, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+alterations+of+glucose+transport+and+molecular+mechanisms+of+intertissue+communication+in+obesity+and+type+2+diabetes.">Tissue-specific alterations of glucose transport and molecular mechanisms of intertissue communication in obesity and type 2 diabetes.</a> Horm. Metab. Res. 39, 717-721 (2007).</li><li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity.">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J. Immunol. Methods. 294, 15-22 (2004).</li><li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labeled+Annexin+V.">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V.</a> J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).</li><li>Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+analysis+in+flow+cytometry:+the+future+just+started.">Data analysis in flow cytometry: the future just started.</a> Cytometry A. 77, 705-713 (2010).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々は、フローサイトメトリーにより細胞質から細胞の形質膜へのGLUT4のトランスロケーションを定量化するための迅速な技術を実証している。 GLUT4は、一時的に細胞の形質膜に発現され、エンドサイトーシスされる。結合した抗体は、さらにエンドサイトーシスの間に、GLUT4に接続されたままにするので、蛍光シグナルはインスリンの存在下でインキュベーションの選択した期間中に形質膜に露出されてGLUT4の総量を与えます。 この手法は、目的のタンパク質の外エピトープに向け良好な抗体を提供する、細胞内コンパートメントから形質膜への他の蛋白質の転座を勉強にも適用することができる利用可能です。例えば、同じようなアッセイは、現在一般的に4,5それらの形質膜にCD107aの転座を測定することにより、細胞傷害性Tリンパ球およびナチュラルキラーリンパ球の脱顆粒の割合を評価するために使用されます。細胞のアポトーシスやネクローシスの間に原形質膜の内側から外側へのホスファチジルセリンの転座はまた、蛍光標識アネキシンV 6を使用して、フローサイトメトリーにより検出することができます。 アッセイの迅速性に加え、フローサイトメトリーは、混合細胞集団における形質膜へのタンパク質転移の研究をできるという利点を提示。確かに、一つはマルチレーザーフローサイトメーター7のデータ取得、続いて細胞のサブセットマーカーのために、目的のタンパク質の染色を組み合わせることができます。 プロトコルのパラグラフ1.2で与えられた抗体の量は、出発点であり、私たちは、あなたがあなたの最大の信号を与える最小の抗体濃度を決定する目的の細胞を使用して抗体を滴定することをお勧めします。我々がここで使用している主要な抗ヒトGLUT4抗体が試験管当たり1〜10μL（チューブあたりすなわち0.2〜2μgの抗体）、これ以上の100万人以上のセルを含む各チューブになるための良い出発範囲。他の一次抗体の場合は、供給者の指示を参照してください。 細胞の自家蛍光は、ドナーからアクセプターへと実験間に変化するとして、データの正規化が必要である。

<table><tbody><tr><td>Anti-human GLUT4 antibodies</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-1606</td><td>Against an external epitope of GLUT4</td></tr><tr><td>Chicken anti-goat IgG conjugated to AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21467</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>Cell lifters</td><td>VWR international</td><td>29942-118</td><td>Cut to fit the wells</td></tr><tr><td>5 ml tubes for FACS</td><td>VWR international</td><td>60819-138</td><td>Fit all BD machines</td></tr></tbody></table>

quantitative measurement of glut4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry

グルコースはその血中濃度の一定の規制を必要とする、身体のエネルギーの主な情報源です。膵臓からのインスリン放出は、インスリン感受性組織、特に脳、骨格筋、および脂肪細胞によるグルコース取り込みを誘導する。 2型糖尿病および/または肥満に苦しむ患者はしばしばインスリン抵抗性を開発し、そのグルコースの恒常性を制御することはできません。インスリン抵抗性のメカニズムに新しい洞察は、2型糖尿病の新しい治療戦略を提供することがあります。 グルコーストランスポーターのGLUTファミリーは、本体1全体の異なる組織に分散し13人で構成されています。グルコーストランスポータータイプ4（GLUT4）はそのような骨格筋などのインスリン感受性組織による仲介グルコースの取り込みを主要なトランスポーターです。その受容体にインスリンが結合すると、GLUT4のグルコースの取り込みを誘導、細胞質から細胞膜へ転位する含有小胞。減少GLUT4転座は、2型糖尿病2,3のインスリン抵抗性の原因の一つです。 細胞質から形質膜へのGLUT4のトランスロケーションは、蛍光標識GLUT4 -特異的抗体を用いて、免疫細胞化学により可視化することができます。 ここで、我々は、フローサイトメトリーを用いて、選択した期間中に細胞の形質膜へのGLUT4転座の合計額を定量化する手法を説明します。このプロトコルは急速である（4時間未満、インスリンとのインキュベーションを含む）と一回の実験で、わずか3000のような細胞または条件ごとに、多くの100万などの細胞の分析を行うことができます。それはそれにバインドするとすぐそれが細胞膜へトランスロケーションした後に細胞外培地にさらされるとして、そのトランスポーターの外部エピトープに向けられた抗GLUT4抗体に依存しています。

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Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

このプロトコルは、フローサイトメトリーにより細胞質から細胞の形質膜へのGLUT4のトランスロケーションを定量化するために迅速なテクニックを説明します。

フローサイトメトリーによる細胞膜へのGLUT4転の定量的測定

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

quantitative-measurement-glut4-translocation-to-plasma-membrane-flow

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

26.4K ビュー.  Baylor College of Medicine. このプロトコルは、フローサイトメトリーにより細胞質から細胞の形質膜へのGLUT4のトランスロケーションを定量化するために迅速なテクニックを説明します。

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Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Kidney diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in the permeability barrier comprised of podocytes, vascular endothelial cells, and a basement membrane working in unison. Data from our laboratory using intravital 2-photon microscopy revealed a more permeable glomerular filtration barrier (GFB) than previously thought under physiologic conditions, with retrieval of filtered albumin occurring in an early subset of cells called proximal tubule cells (PTC)1,2,3.
Previous techniques used to study renal filtration and establishing the characteristic of the filtration barrier involved micropuncture of the lumen of these early tubular segments with sampling of the fluid content and analysis4. These studies determined albumin concentration in the luminal fluid to be virtually non-existent; corresponding closely to what is normally detected in the urine. However, characterization of dextran polymers with defined sizes by this technique revealed those of a size similar to serum albumin had higher levels in the tubular lumen and urine; suggesting increased permeability5.
Herein is a detailed outline of the technique used to directly visualize and quantify glomerular fluorescent albumin permeability in vivo. This method allows for detection of filtered albumin across the filtration barrier into Bowman's space (the initial chamber of urinary filtration); and also allows quantification of albumin reabsorption by proximal tubules and visualization of subsequent albumin transcytosis6. The absence of fluorescent albumin along later tubular segments en route to the bladder highlights the efficiency of the retrieval pathway in the earlier proximal tubule segments. Moreover, when this technique was applied to determine permeability of dextrans having a similar size to albumin virtually identical permeability values were reported2. These observations directly support the need to expand the focus of many proteinuric renal diseases to included alterations in proximal tubule cell reclamation.

A technique utilizing high resolution intavital 2-photon microscopy to directly visualize and quantify gloemrular filtration in surface glomeruli. This method allows for direct determination of permeability characteristics of macromolecules in both normal and diseased states.

ミュンヘンWistar系ラットにおける2光子顕微鏡を用いた蛍光高分子の糸球体透過性を定量化

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

医学

Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for biological molecules became available in the past 15 years, some of which became indispensable tools that are used routinely in many laboratories.
One of the exciting applications of genetically encoded sensors is the use of these sensors in investigating cellular transport processes. Properties of transporters such as kinetics and substrate specificities can be investigated at a cellular level, providing possibilities for cell-type specific analyses of transport activities. In this article, we will demonstrate how transporter dynamics can be observed using genetically encoded glutamine sensor as an example. Experimental design, technical details of the experimental settings, and considerations for post-experimental analyses will be discussed.

This article will demonstrate how to monitor glutamine dynamics in live cells using FRET. Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. Experimental design, technical details of the experimental settings, and considerations for post-experimental analyses will be discussed for genetically encoded glutamine sensors.

遺伝的にコードされたセンサを用いたグルタミンフラックスイメージング

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

生物工学

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[3H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

Glutamate removal from the extracellular space by high-affinity Na+-dependent transporters is essential to ensure that the brain&#39;s intrinsic connectivity mechanisms work properly and homeostasis is maintained. The hippocampus is a unique brain structure that manages higher cognitive functions, and is the subject of several studies regarding neurologic diseases. The investigation of physiological and pathological mechanisms in rodent models can benefit from acute hippocampal slice (AHS) preparations. AHS has the advantage of providing reliable information on cell function since the cytoarchitecture and synaptic circuits are preserved. Although AHS preparations are commonly used in neurochemistry laboratories, it is possible to find some methodological differences in the literature. Considering that distinctive slice preparation protocols might change the hippocampal regions analyzed, this current protocol proposes a standard technique for obtaining transverse AHS from resected hippocampus. This simple-to-perform protocol may be used in mice and rats&#39; experimental models and allow several ex vivo approaches investigating neurochemical dynamics (in dorsal, intermediate and ventral hippocampus) in different backgrounds (e.g., transgenic manipulations) or after in vivo manipulations (e.g., pharmacological treatments or suitable rodent models to study clinical disorders). After dissecting the hippocampus from the rodent brain, transverse slices along the septo-temporal axis (300 &#181;m thick) were obtained. These AHS contain distinct parts of the hippocampus and were subjected to an individual neurochemical investigation (as an example: neurotransmitter transporters using their respective substrates). As the hippocampus presents a high density of excitatory synapses, and glutamate is the most important neurotransmitter in the brain, the glutamatergic system is an interesting target for in vivo observed phenomena. Thus, the current protocol provides detailed steps to explore glutamate uptake in ex vivo AHS using L-[3H]-Glutamate. Using this protocol to investigate hippocampal function may help to better understand the influence of glutamate metabolism on mechanisms of neuroprotection or neurotoxicity.

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[3H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

This article describes a reliable and simple way to obtain ex vivo acute hippocampal transverse slices from mice and rats using a tissue chopper. Slices obtained from resected hippocampi can be submitted for functional glutamate uptake analysis to investigate glutamatergic system homeostasis.

Glutamate removal from the extracellular space by high-affinity Na+-dependent transporters is essential to ensure that the brain&#39;s intrinsic ...

生化学

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of monocytes induces effector functions and a concomitant shift from oxidative to glycolytic metabolism that is accompanied by increased glucose transporter expression. This increased glycolytic metabolism is also observed for trained immunity of monocytes, a form of innate immunological memory. Although in vitro protocols examining glucose transporter expression and glucose uptake by monocytes have been described, none have been examined by multi-parametric flow cytometry in whole blood. We describe a multi-parametric flow cytometric protocol for the measurement of fluorescent glucose analog 2-NBDG uptake in whole blood by total monocytes and the classical (CD14++CD16-), intermediate (CD14++CD16+) and non-classical (CD14+CD16++) monocyte subpopulations. This method can be used to examine glucose transporter expression and glucose uptake for total monocytes and monocyte subpopulations during homeostasis and inflammatory disease, and can be easily modified to examine glucose uptake for other leukocytes and leukocyte subpopulations within blood.

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

シンプルなフローサイトメトリー法は、全血における単球亜集団のためのグルコース取り込みおよびグルコーストランスポーターの発現を測定するために

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

免疫・感染学

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at the plasma membrane. Here, we present detailed protocols for 2 methods that facilitate the study of such processes, both of which are based on the principle of the biotinylation of cell-surface proteins. The first is designed to allow for the semi-quantitative determination of the relative levels of a particular protein at the cell-surface. In it, the lysine residues of the plasma membrane proteins of cells are first labeled with a biotin moiety. Once the cells are lysed, these proteins may then be specifically precipitated via the use of agarose-immobilized streptavidin by exploiting the natural affinity of the latter for biotin. The proteins isolated in such a manner may then be analyzed via a standard western blotting approach. The second method provides a means of determining the endocytic rate of a particular cell-surface target over a period of time. Cell-surface proteins are first modified with a biotin derivative containing a cleavable disulfide bond. The cells are then shifted back to normal culture conditions, which causes the endocytic uptake of a proportion of biotinylated proteins. Next, the disulfide bonds of non-internalized biotin groups are reduced using the membrane-impermeable reducing agent glutathione. Via this approach, endocytosed proteins may thus be isolated and quantified with a high degree of specificity.

Two biotinylation-based methods, designed for determining the cell-surface expression and endocytic rate of proteins expressed at the plasma membrane, are presented in this report.

ビオチン化を用いた初代星状細胞培養におけるタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度の測定

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

神経科学

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical manifestations include weight loss, dyslipidemia, and hypermetabolism; however, it remains unclear how these relate to motor neuron degeneration. Using a Drosophila model of TDP-43 proteinopathy that recapitulates several features of ALS including cytoplasmic inclusions, locomotor dysfunction, and reduced lifespan, we recently identified broad ranging metabolic deficits. Among these, glycolysis was found to be upregulated and genetic interaction experiments provided evidence for a compensatory neuroprotective mechanism. Indeed, despite upregulation of phosphofructokinase, the rate limiting enzyme in glycolysis, an increase in glycolysis using dietary and genetic manipulations was shown to mitigate locomotor dysfunction and increased lifespan in fly models of TDP-43 proteinopathy. To further investigate the effect on TDP-43 proteinopathy on glycolytic flux in motor neurons, a previously reported genetically encoded, FRET-based sensor, FLII12Pglu-700&#181;&#948;6, was used. This sensor is comprised of a bacterial glucose-sensing domain and cyan and yellow fluorescent proteins as the FRET pair. Upon glucose binding, the sensor undergoes a conformational change allowing FRET to occur. Using FLII12Pglu-700&#181;&#948;6, glucose uptake was found to be significantly increased in motor neurons expressing TDP-43G298S, an ALS causing variant. Here, we show how to measure glucose uptake, ex vivo, in larval ventral nerve cord preparations expressing the glucose sensor FLII12Pglu-700&#181;&#948;6 in the context of TDP-43 proteinopathy. This approach can be used to measure glucose uptake and assess glycolytic flux in different cell types or in the context of various mutations causing ALS and related neurodegenerative disorders.

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Glucose uptake is increased in Drosophila motor neurons affected by TAR DNA binding protein (TDP-43) proteinopathy, as indicated by a FRET-based, genetically encoded glucose sensor.

TDP-43蛋白症の ショウジョウバエ モデルにおけるグルコース取り込みの測定

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical ...

フローサイトメトリーを用いたマウス脳ヒストン修飾定量

Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to histone tails. Histone post-translational modifications (HPTMs) can either facilitate gene expression or repression. For example, acetylation of histone tail lysine residues neutralizes the positive charge and reduces interactions between the tail and negatively charged DNA. The decrease in histone tail-DNA interactions results in increased accessibility of the underlying DNA, allowing for increased transcription factor access. The acetylation mark also serves as a recognition site for bromodomain-containing transcriptional activators, together resulting in enhanced gene expression. Histone marks can be dynamically regulated during cell differentiation and in response to different cellular environments and stimuli. While next-generation sequencing approaches have begun to characterize genomic locations for individual histone modifications, only one modification can be examined concurrently. Given that there are hundreds of different HPTMs, we have developed a high throughput, quantitative measure of global HPTMs that can be used to screen histone modifications prior to conducting more extensive genome sequencing approaches. This protocol describes a flow cytometry-based method to detect global HPTMs and can be conducted using cells in culture or isolated cells from in vivo tissues. We present example data from isolated mouse brain microglia to demonstrate the sensitivity of the assay to detect global shifts in HPTMs in response to a bacteria-derived immune stimulus (lipopolysaccharide). This protocol allows for the rapid and quantitative assessment of HPTMs and can be applied to any transcriptional or epigenetic regulator that can be detected by an antibody.

著者スポットライト:遺伝子発現制御研究の強化

This work describes a protocol for the quantification of global histone modifications using intranuclear flow cytometry in isolated brain microglia. The work also contains the microglia isolation protocol that was used for data collection.

単離マウス脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いたグローバルヒストン翻訳後修飾の定量化

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to ...

シナプス材料のミクログリア包絡に対するフローサイトメトリーベースのアッセイ

Quantification of Microglial Engulfment of Synaptic Material Using Flow Cytometry

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this process; however, currently available methods for identifying microglial engulfment of synapses, such as immunohistochemistry (IHC) and imaging, are laborious and time-intensive. To address this challenge, herein we present in vitro and in vivo* assays that allow fast and high-throughput quantification of microglial engulfment of synapses using flow cytometry.
In the in vivo* approach, we performed intracellular vGLUT1 staining following fresh cell isolation from adult mouse brains to quantify engulfment of vGLUT1+ synapses by microglia. In the in vitro synaptosome engulfment assay, we used freshly isolated cells from the adult mouse brain to quantify the engulfment of pHrodo&#160;Red-labeled synaptosomes by microglia. These protocols together provide a time-efficient approach to quantifying microglial engulfment of synapses and represent promising alternatives to labor-intensive image analysis-based methods. By streamlining the analysis, these assays can contribute to a better understanding of the role of microglia in synaptic refinement in different disease models.

著者スポットライト:精神神経免疫学の技術革新による理解の促進

Here we present two protocols to quantify microglial engulfment of vGLUT1-positive synapses and pHRodo&#160;Red-labeled crude synaptosomes using flow cytometry.

フローサイトメトリーを用いたシナプス材料のミクログリア包絡の定量化

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this ...

フローサイトメトリーによる細胞膜へのGLUT4転の定量的測定

要約

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ミュンヘンWistar系ラットにおける2光子顕微鏡を用いた蛍光高分子の糸球体透過性を定量化

遺伝的にコードされたセンサを用いたグルタミンフラックスイメージング

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[³H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

シンプルなフローサイトメトリー法は、全血における単球亜集団のためのグルコース取り込みおよびグルコーストランスポーターの発現を測定するために

ビオチン化を用いた初代星状細胞培養におけるタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度の測定

TDP-43蛋白症のショウジョウバエモデルにおけるグルコース取り込みの測定

単離マウス脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いたグローバルヒストン翻訳後修飾の定量化

単離マウス脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いたグローバルヒストン翻訳後修飾の定量化

単離マウス脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いたグローバルヒストン翻訳後修飾の定量化

フローサイトメトリーを用いたシナプス材料のミクログリア包絡の定量化

フローサイトメトリーによる細胞膜へのGLUT4転の定量的測定

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ミュンヘンWistar系ラットにおける2光子顕微鏡を用いた蛍光高分子の糸球体透過性を定量化

遺伝的にコードされたセンサを用いたグルタミンフラックスイメージング

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[3H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

シンプルなフローサイトメトリー法は、全血における単球亜集団のためのグルコース取り込みおよびグルコーストランスポーターの発現を測定するために

ビオチン化を用いた初代星状細胞培養におけるタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度の測定

TDP-43蛋白症の ショウジョウバエ モデルにおけるグルコース取り込みの測定

単離マウス脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いたグローバルヒストン翻訳後修飾の定量化

単離マウス脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いたグローバルヒストン翻訳後修飾の定量化

単離マウス脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いたグローバルヒストン翻訳後修飾の定量化

フローサイトメトリーを用いたシナプス材料のミクログリア包絡の定量化

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[³H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

TDP-43蛋白症のショウジョウバエモデルにおけるグルコース取り込みの測定