Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Mrs. Clifford Elder Weiß Graham unterstützte Stiftungsprofessur Research Fund und die NIH (AR059838) zu CB, von der NIH (AR052791, AR044387-ARRA, &amp; NS063298) zu LTT, und von der Baylor College of Medicine Cytometry und Cell Sorting-Core mit Mitteln aus dem NIH (NCRR S10RR024574, NIAID AI036211, und NCI P30CA125123). Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des NIH.

1. Zellfärbung <ol><li> Bereiten Sie die Zellen. Die Zellen sollten verwendet werden, während immer noch aktiv wachsende (60 bis 80% Konfluenz) werden. Serum hungern die Zellen über Nacht, Teller ihnen Zellen bei 0,1 Millionen pro Well in 0,5 ml serum-freiem Medium in einer 24-Well-Platte und in den Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) für 30 min - 2 Stunden zu erholen von Trypsinierung. </li><li> Mischen Sie die primären und sekundären Antikörper. Mix (5 ul des primären anti-GLUT4 Antikörper mit 1 ul sekundären Huhn anti-Ziege IgG-Antikörper, konjugiert mit AlexaFluor 488) x Anzahl der Brunnen. Inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Bereiten Sie eine 2X arbeiten Lager von Insulin durch Verdünnen in Medium. </li><li> Prüfen Sie, ob die Zellen eingehalten haben oder nicht. </li><li> Gently add 6 ul Antikörper-Mix und 0,5 mL von 2X arbeiten Bestand an Insulin, um den Brunnen mit den Zellen. Vermeiden Sie jegliche Turbulenzen des Mediums. Inkubieren (37 ° C, 5% CO 2) für 30 Minuten im Dunkeln. </li><li> Fix die Zellen durch Zugabe von 0,5 ml PBS + 1% PFA in jede Vertiefung, ohne Schütteln der Zellen. Inkubieren für 20 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Wenn Ihre Zellen in die Vertiefungen haften geblieben sind, heben sie mit einer Zelle Heber. Übertragen Sie die Zellen (1 ml gesamt) in Röhrchen, die in Ihrem Durchflusszytometer fit und Zentrifuge die Zellen zu pelletieren. </li><li> Waschen Sie die Pellet zweimal mit 1 mL PBS resuspendieren und in 0,4 ml PBS + 1% PFA. An dieser Stelle Zellen können in Folie gewickelt und im Kühlschrank aufbewahrt (4-8 ° C) oder getroffen werden, um das Durchflusszytometer für die sofortige Datenerfassung. </li></ol> 2. Data Acquisition <ol><li> Legen Sie ein breites Tor in die lebenden Zellen in der side scatter (SSC) versus forward scatter (FCS) Panel. Verwenden Sie einen negativen Rohr (Zellen, die nicht mit Insulin oder Zellen &quot;befleckt&quot; mit einem Isotyp-Kontrolle) behandelt, um Ihre FL1-Parameter. Vergewissern Sie sich, Gipfel ist vollständig in das Panel, nicht auf der unteren Seite abgeschnitten. </li><li> Erwerben Sie Daten von mindestens 10.000 Zellen pro Röhrchen. </li></ol> 3. Data Analysis <ol><li> Zeichnen Sie einen Schutzzaun um die lebenden Zellen in der SSC vs FSC-Panel (Abbildung 1A). Zeichnen Sie die Histogramme der AlexaFluor 488 Fluoreszenzintensität im Vergleich zur Anzahl von Zellen innerhalb des Live-cell-Tor (Abbildung 1B). Sie können Overlay verschiedenen Histogramme, um Unterschiede zu visualisieren, sondern für die Quantifizierung, die mittlere und die mediane Fluoreszenzintensität für jede Zelle Bevölkerung und der Nutzung dieser Nummern für Ihre Vergleiche (Abbildung 1C). </li><li> Normalisieren der Daten, um den Wert in Abwesenheit von Insulin erhalten, wie in den Abbildungen 1C und 1D gezeigt. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse In Myoblasten aus einem gesunden Menschen (keine Insulinresistenz) isoliert, induziert Insulin eine Dosis-abhängige Translokation von GLUT4 aus dem Zytoplasma an die Plasmamembran (Abb. 1, links). Im Gegensatz dazu wird Insulin nicht induzieren GLUT4 Translokation an die Plasmamembran von Myoblasten von einem Patienten mit Insulinresistenz (Abbildung 1, rechts) isoliert. <img src="/files/ftp_upload/2429/2429fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Beispiel für eine Färbung zu experimentieren. Myoblasten wurden von einem Spender, ohne Insulin-Resistenz (links) und von einem Patienten mit Insulinresistenz (rechts) isoliert. A, SSC (side scatter) versus FCS (forward scatter) Grundstück mit einem Tor in die lebenden Zellen. B, gated Cells in A, mit dem Antikörper gegen ein externes Epitop des GLUT4 gefärbt, und links unstimulierten (rot) oder mit Insulin stimuliert 1 nM (blau), 10 nM (orange) oder 100 nm (grün). Für Figur Klarheit, zeigen wir nur Daten ohne und mit 100 nM Insulin für die Zellen mit einer Insulinresistenz. C, mittleren Fluoreszenzintensitäten (MFI) der Histogramme in B gezeigt wurden, die MFI der Zellen normalisiert links unstimulierten (kein Insulin). D, Plots der normalisierten MFI Daten aus der Histogramme in B gezeigt

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	<li>Zhao, F. Q., Keating, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+and+genomics+of+glucose+transporters.">Functional properties and genomics of glucose transporters.</a> Curr. Genomics. 8, 113-128 (2007).</li><li>Karnieli, E., Armoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+the+insulin-responsive+glucose+transporter+GLUT4+gene:+from+physiology+to+pathology.">Transcriptional regulation of the insulin-responsive glucose transporter GLUT4 gene: from physiology to pathology.</a> Am. J. Endocrinol. Metab. 295, 38-45 (2008).</li><li>Graham, T. E., Kahn, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+alterations+of+glucose+transport+and+molecular+mechanisms+of+intertissue+communication+in+obesity+and+type+2+diabetes.">Tissue-specific alterations of glucose transport and molecular mechanisms of intertissue communication in obesity and type 2 diabetes.</a> Horm. Metab. Res. 39, 717-721 (2007).</li><li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity.">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J. Immunol. Methods. 294, 15-22 (2004).</li><li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labeled+Annexin+V.">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V.</a> J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).</li><li>Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+analysis+in+flow+cytometry:+the+future+just+started.">Data analysis in flow cytometry: the future just started.</a> Cytometry A. 77, 705-713 (2010).</li></ol>

Wir haben ein schnelles Verfahren zur Quantifizierung der Translokation von GLUT4 aus dem Zytoplasma an die Plasmamembran von Zellen mittels Durchflusszytometrie nachgewiesen. GLUT4 ist nur vorübergehend an der Plasmamembran von Zellen exprimiert wird und durch Endozytose. Da die gebundenen Antikörper an der GLUT4, auch während der Endozytose bleiben, gibt das Fluoreszenzsignal der Gesamtbetrag der GLUT4, die an der Plasmamembran während der gewählten Dauer der Inkubation in Gegenwart von Insulin ausgesetzt war. Diese Technik kann auch zur Untersuchung der Translokation von anderen Proteinen aus einem intrazellulären Kompartiment zur Plasmamembran angewandt werden, sofern eine gute Antikörper gerichtet an einen externen Epitop des Proteins von Interesse ist vorhanden. Zum Beispiel, ist ein ähnlicher Test jetzt häufig verwendet, um die Rate der Degranulation von zytotoxischen T-Lymphozyten und natürliche Killer-Lymphozyten durch die Messung der Translokation von CD107a ihrer Plasmamembran 4,5 zu bewerten. Die Translokation von Phosphatidylserin von der Innenseite der Plasmamembran auf die Außenseite während Apoptose oder Nekrose kann auch mittels Durchflusszytometrie detektiert werden, mit Fluorophor-markierten Annexin V 6. Neben Schnelligkeit des Tests präsentiert Durchflusszytometrie den Vorteil, dass die Untersuchung von Protein-Translokation an die Plasmamembran in gemischten Zellpopulationen. Tatsächlich kann man Färbung für Zell-Untergruppe Marker und für das Protein von Interesse, durch die Datenerfassung auf einem Multi-Laser-Durchflusszytometer 7 an zu kombinieren. Die Mengen von Antikörpern in Absatz 1.2 des Protokolls gegeben sind ein Ausgangspunkt, empfehlen wir Ihnen titrieren Ihre Antikörper mit Zellen von Interesse, um die minimale Antikörperkonzentration, die Ihnen ein maximales Signal zu bestimmen. Ein guter Ausgangspunkt Bereich für die Primär-Anti-Human-Antikörper GLUT4 wir hier verwendet haben würde 1-10 ul pro Röhrchen (dh 0,2-2 ug Antikörper pro Röhrchen), wobei jedes Rohr mit nicht mehr als 1 Million Zellen. Für andere primäre Antikörper, die Anweisungen des Herstellers beziehen. Die Normalisierung der Daten ist notwendig, da die Autofluoreszenz von Zellen vom Spender zum Spender und von Experiment zu Experiment variieren.

<table><tbody><tr><td>Anti-human GLUT4 antibodies</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-1606</td><td>Against an external epitope of GLUT4</td></tr><tr><td>Chicken anti-goat IgG conjugated to AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21467</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>Cell lifters</td><td>VWR international</td><td>29942-118</td><td>Cut to fit the wells</td></tr><tr><td>5 ml tubes for FACS</td><td>VWR international</td><td>60819-138</td><td>Fit all BD machines</td></tr></tbody></table>

quantitative measurement of glut4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry

Glukose ist der wichtigste Energiequelle für den Körper, die eine konstante Regelung seiner Konzentration im Blut. Insulinfreisetzung der Bauchspeicheldrüse verursacht Glukoseaufnahme durch Insulin-sensitiven Geweben, vor allem das Gehirn, Skelettmuskel und Adipozyten. Patienten mit Typ-2-Diabetes und / oder Übergewicht entwickeln häufig eine Insulinresistenz und sind unfähig, ihre Glukose-Homöostase zu kontrollieren. Neue Einblicke in die Mechanismen der Insulinresistenz können neue Therapiestrategien bei Typ-2-Diabetes. Die GLUT-Familie Glucose-Transporter besteht aus dreizehn Mitgliedern auf verschiedenen Gewebe im gesamten Körper 1 verteilt. Glucose-Transporter Typ 4 (GLUT4) ist der wichtigste Transporter, vermittelt Glukoseaufnahme durch Insulin empfindlicher Gewebe wie die Skelettmuskulatur. Bei der Bindung von Insulin an seinen Rezeptor, Vesikel mit GLUT4 aus dem Zytoplasma transloziert zur Plasmamembran, induzieren Glukoseaufnahme. Reduzierte GLUT4 Translokation ist eine der Ursachen der Insulinresistenz bei Typ-2-Diabetes 2,3. Die Translokation von GLUT4 aus dem Zytoplasma an die Plasmamembran visualisiert werden können Immunzytochemie, mit Fluorophor-konjugierten GLUT4-spezifischen Antikörpern. Hier beschreiben wir eine Technik, um Gesamtmengen von GLUT4 Translokation an die Plasmamembran von Zellen in einem ausgewählten Zeitraum zu quantifizieren, mittels Durchflusszytometrie. Dieses Protokoll ist schnell (weniger als 4 Stunden, einschließlich der Inkubation mit Insulin) und ermöglicht die Analyse von so wenig wie 3.000 Zellen oder so viele wie 1 Million Zellen pro Bedingung in einem einzigen Experiment. Es stützt sich auf anti-GLUT4 Antikörper, die gegen einen externen Epitop des Transporters, die an sie bindet, sobald sie an die extrazelluläre Medium nach Translokation an die Plasmamembran ausgesetzt ist.

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Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Dieses Protokoll beschreibt ein schnelles Verfahren, um die Translokation von GLUT4 aus dem Zytoplasma zu quantifizieren, um die Plasmamembran von Zellen mittels Durchflusszytometrie.

Quantitative Messung der GLUT4 Translokation an die Plasmamembran mittels Durchflusszytometrie

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

26.4K Aufrufe.  Baylor College of Medicine. Dieses Protokoll beschreibt ein schnelles Verfahren, um die Translokation von GLUT4 aus dem Zytoplasma zu quantifizieren, um die Plasmamembran von Zellen mittels Durchflusszytometrie.

Serie: Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Kidney diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in the permeability barrier comprised of podocytes, vascular endothelial cells, and a basement membrane working in unison. Data from our laboratory using intravital 2-photon microscopy revealed a more permeable glomerular filtration barrier (GFB) than previously thought under physiologic conditions, with retrieval of filtered albumin occurring in an early subset of cells called proximal tubule cells (PTC)1,2,3.
Previous techniques used to study renal filtration and establishing the characteristic of the filtration barrier involved micropuncture of the lumen of these early tubular segments with sampling of the fluid content and analysis4. These studies determined albumin concentration in the luminal fluid to be virtually non-existent; corresponding closely to what is normally detected in the urine. However, characterization of dextran polymers with defined sizes by this technique revealed those of a size similar to serum albumin had higher levels in the tubular lumen and urine; suggesting increased permeability5.
Herein is a detailed outline of the technique used to directly visualize and quantify glomerular fluorescent albumin permeability in vivo. This method allows for detection of filtered albumin across the filtration barrier into Bowman's space (the initial chamber of urinary filtration); and also allows quantification of albumin reabsorption by proximal tubules and visualization of subsequent albumin transcytosis6. The absence of fluorescent albumin along later tubular segments en route to the bladder highlights the efficiency of the retrieval pathway in the earlier proximal tubule segments. Moreover, when this technique was applied to determine permeability of dextrans having a similar size to albumin virtually identical permeability values were reported2. These observations directly support the need to expand the focus of many proteinuric renal diseases to included alterations in proximal tubule cell reclamation.

A technique utilizing high resolution intavital 2-photon microscopy to directly visualize and quantify gloemrular filtration in surface glomeruli. This method allows for direct determination of permeability characteristics of macromolecules in both normal and diseased states.

Quantifizierung glomeruläre Permeabilität von fluoreszierenden Makromoleküle Verwendung von 2-Photonen-Mikroskopie in München Wistar Ratten

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

Forschung

Medizin

Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for biological molecules became available in the past 15 years, some of which became indispensable tools that are used routinely in many laboratories.
One of the exciting applications of genetically encoded sensors is the use of these sensors in investigating cellular transport processes. Properties of transporters such as kinetics and substrate specificities can be investigated at a cellular level, providing possibilities for cell-type specific analyses of transport activities. In this article, we will demonstrate how transporter dynamics can be observed using genetically encoded glutamine sensor as an example. Experimental design, technical details of the experimental settings, and considerations for post-experimental analyses will be discussed.

This article will demonstrate how to monitor glutamine dynamics in live cells using FRET. Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. Experimental design, technical details of the experimental settings, and considerations for post-experimental analyses will be discussed for genetically encoded glutamine sensors.

Glutamin Flux Imaging Verwendung genetisch codierten Sensoren

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

Biotechnik

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[3H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

Glutamate removal from the extracellular space by high-affinity Na+-dependent transporters is essential to ensure that the brain&#39;s intrinsic connectivity mechanisms work properly and homeostasis is maintained. The hippocampus is a unique brain structure that manages higher cognitive functions, and is the subject of several studies regarding neurologic diseases. The investigation of physiological and pathological mechanisms in rodent models can benefit from acute hippocampal slice (AHS) preparations. AHS has the advantage of providing reliable information on cell function since the cytoarchitecture and synaptic circuits are preserved. Although AHS preparations are commonly used in neurochemistry laboratories, it is possible to find some methodological differences in the literature. Considering that distinctive slice preparation protocols might change the hippocampal regions analyzed, this current protocol proposes a standard technique for obtaining transverse AHS from resected hippocampus. This simple-to-perform protocol may be used in mice and rats&#39; experimental models and allow several ex vivo approaches investigating neurochemical dynamics (in dorsal, intermediate and ventral hippocampus) in different backgrounds (e.g., transgenic manipulations) or after in vivo manipulations (e.g., pharmacological treatments or suitable rodent models to study clinical disorders). After dissecting the hippocampus from the rodent brain, transverse slices along the septo-temporal axis (300 &#181;m thick) were obtained. These AHS contain distinct parts of the hippocampus and were subjected to an individual neurochemical investigation (as an example: neurotransmitter transporters using their respective substrates). As the hippocampus presents a high density of excitatory synapses, and glutamate is the most important neurotransmitter in the brain, the glutamatergic system is an interesting target for in vivo observed phenomena. Thus, the current protocol provides detailed steps to explore glutamate uptake in ex vivo AHS using L-[3H]-Glutamate. Using this protocol to investigate hippocampal function may help to better understand the influence of glutamate metabolism on mechanisms of neuroprotection or neurotoxicity.

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[3H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

This article describes a reliable and simple way to obtain ex vivo acute hippocampal transverse slices from mice and rats using a tissue chopper. Slices obtained from resected hippocampi can be submitted for functional glutamate uptake analysis to investigate glutamatergic system homeostasis.

Glutamate removal from the extracellular space by high-affinity Na+-dependent transporters is essential to ensure that the brain&#39;s intrinsic ...

Biochemie

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of monocytes induces effector functions and a concomitant shift from oxidative to glycolytic metabolism that is accompanied by increased glucose transporter expression. This increased glycolytic metabolism is also observed for trained immunity of monocytes, a form of innate immunological memory. Although in vitro protocols examining glucose transporter expression and glucose uptake by monocytes have been described, none have been examined by multi-parametric flow cytometry in whole blood. We describe a multi-parametric flow cytometric protocol for the measurement of fluorescent glucose analog 2-NBDG uptake in whole blood by total monocytes and the classical (CD14++CD16-), intermediate (CD14++CD16+) and non-classical (CD14+CD16++) monocyte subpopulations. This method can be used to examine glucose transporter expression and glucose uptake for total monocytes and monocyte subpopulations during homeostasis and inflammatory disease, and can be easily modified to examine glucose uptake for other leukocytes and leukocyte subpopulations within blood.

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

Eine einfache Durchflusszytometrischer Methode Glukoseaufnahme und Glukosetransporter-Expression für Monozytensubpopulationen in Vollblut zu messen

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Immunologie und Infektion

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at the plasma membrane. Here, we present detailed protocols for 2 methods that facilitate the study of such processes, both of which are based on the principle of the biotinylation of cell-surface proteins. The first is designed to allow for the semi-quantitative determination of the relative levels of a particular protein at the cell-surface. In it, the lysine residues of the plasma membrane proteins of cells are first labeled with a biotin moiety. Once the cells are lysed, these proteins may then be specifically precipitated via the use of agarose-immobilized streptavidin by exploiting the natural affinity of the latter for biotin. The proteins isolated in such a manner may then be analyzed via a standard western blotting approach. The second method provides a means of determining the endocytic rate of a particular cell-surface target over a period of time. Cell-surface proteins are first modified with a biotin derivative containing a cleavable disulfide bond. The cells are then shifted back to normal culture conditions, which causes the endocytic uptake of a proportion of biotinylated proteins. Next, the disulfide bonds of non-internalized biotin groups are reduced using the membrane-impermeable reducing agent glutathione. Via this approach, endocytosed proteins may thus be isolated and quantified with a high degree of specificity.

Two biotinylation-based methods, designed for determining the cell-surface expression and endocytic rate of proteins expressed at the plasma membrane, are presented in this report.

Bestimmung der Zelloberflächenexpression und der endozytischen Rate von Proteinen in primären Astrozytenkulturen unter Verwendung von Biotinylierung

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

Neurowissenschaften

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical manifestations include weight loss, dyslipidemia, and hypermetabolism; however, it remains unclear how these relate to motor neuron degeneration. Using a Drosophila model of TDP-43 proteinopathy that recapitulates several features of ALS including cytoplasmic inclusions, locomotor dysfunction, and reduced lifespan, we recently identified broad ranging metabolic deficits. Among these, glycolysis was found to be upregulated and genetic interaction experiments provided evidence for a compensatory neuroprotective mechanism. Indeed, despite upregulation of phosphofructokinase, the rate limiting enzyme in glycolysis, an increase in glycolysis using dietary and genetic manipulations was shown to mitigate locomotor dysfunction and increased lifespan in fly models of TDP-43 proteinopathy. To further investigate the effect on TDP-43 proteinopathy on glycolytic flux in motor neurons, a previously reported genetically encoded, FRET-based sensor, FLII12Pglu-700&#181;&#948;6, was used. This sensor is comprised of a bacterial glucose-sensing domain and cyan and yellow fluorescent proteins as the FRET pair. Upon glucose binding, the sensor undergoes a conformational change allowing FRET to occur. Using FLII12Pglu-700&#181;&#948;6, glucose uptake was found to be significantly increased in motor neurons expressing TDP-43G298S, an ALS causing variant. Here, we show how to measure glucose uptake, ex vivo, in larval ventral nerve cord preparations expressing the glucose sensor FLII12Pglu-700&#181;&#948;6 in the context of TDP-43 proteinopathy. This approach can be used to measure glucose uptake and assess glycolytic flux in different cell types or in the context of various mutations causing ALS and related neurodegenerative disorders.

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Glucose uptake is increased in Drosophila motor neurons affected by TAR DNA binding protein (TDP-43) proteinopathy, as indicated by a FRET-based, genetically encoded glucose sensor.

Messung der Glukoseaufnahme in Drosophila-Modellen der TDP-43-Proteinopathie

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical ...

Quantifizierung der Histonmodifikation des Mausgehirns mittels Durchflusszytometrie

Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to histone tails. Histone post-translational modifications (HPTMs) can either facilitate gene expression or repression. For example, acetylation of histone tail lysine residues neutralizes the positive charge and reduces interactions between the tail and negatively charged DNA. The decrease in histone tail-DNA interactions results in increased accessibility of the underlying DNA, allowing for increased transcription factor access. The acetylation mark also serves as a recognition site for bromodomain-containing transcriptional activators, together resulting in enhanced gene expression. Histone marks can be dynamically regulated during cell differentiation and in response to different cellular environments and stimuli. While next-generation sequencing approaches have begun to characterize genomic locations for individual histone modifications, only one modification can be examined concurrently. Given that there are hundreds of different HPTMs, we have developed a high throughput, quantitative measure of global HPTMs that can be used to screen histone modifications prior to conducting more extensive genome sequencing approaches. This protocol describes a flow cytometry-based method to detect global HPTMs and can be conducted using cells in culture or isolated cells from in vivo tissues. We present example data from isolated mouse brain microglia to demonstrate the sensitivity of the assay to detect global shifts in HPTMs in response to a bacteria-derived immune stimulus (lipopolysaccharide). This protocol allows for the rapid and quantitative assessment of HPTMs and can be applied to any transcriptional or epigenetic regulator that can be detected by an antibody.

Autor im Rampenlicht: Verbesserungen in der Forschung zur Genexpressionsregulation

This work describes a protocol for the quantification of global histone modifications using intranuclear flow cytometry in isolated brain microglia. The work also contains the microglia isolation protocol that was used for data collection.

Quantifizierung globaler posttranslationaler Histonmodifikationen mittels intranukleärer Durchflusszytometrie in isolierten Mikroglia des Mausgehirns

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to ...

Durchflusszytometrie-basierte Assays für das mikrogliale Engulfment von synaptischen Materialien

Quantification of Microglial Engulfment of Synaptic Material Using Flow Cytometry

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this process; however, currently available methods for identifying microglial engulfment of synapses, such as immunohistochemistry (IHC) and imaging, are laborious and time-intensive. To address this challenge, herein we present in vitro and in vivo* assays that allow fast and high-throughput quantification of microglial engulfment of synapses using flow cytometry.
In the in vivo* approach, we performed intracellular vGLUT1 staining following fresh cell isolation from adult mouse brains to quantify engulfment of vGLUT1+ synapses by microglia. In the in vitro synaptosome engulfment assay, we used freshly isolated cells from the adult mouse brain to quantify the engulfment of pHrodo&#160;Red-labeled synaptosomes by microglia. These protocols together provide a time-efficient approach to quantifying microglial engulfment of synapses and represent promising alternatives to labor-intensive image analysis-based methods. By streamlining the analysis, these assays can contribute to a better understanding of the role of microglia in synaptic refinement in different disease models.

Autor im Rampenlicht: Förderung des Verständnisses durch technologische Innovationen in der Psychoneuroimmunologie

Here we present two protocols to quantify microglial engulfment of vGLUT1-positive synapses and pHRodo&#160;Red-labeled crude synaptosomes using flow cytometry.

Quantifizierung des mikroglialen Engulfments von synaptischem Material mittels Durchflusszytometrie

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this ...

Quantitative Messung der GLUT4 Translokation an die Plasmamembran mittels Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

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Quantifizierung glomeruläre Permeabilität von fluoreszierenden Makromoleküle Verwendung von 2-Photonen-Mikroskopie in München Wistar Ratten

Glutamin Flux Imaging Verwendung genetisch codierten Sensoren

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[³H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

Eine einfache Durchflusszytometrischer Methode Glukoseaufnahme und Glukosetransporter-Expression für Monozytensubpopulationen in Vollblut zu messen

Bestimmung der Zelloberflächenexpression und der endozytischen Rate von Proteinen in primären Astrozytenkulturen unter Verwendung von Biotinylierung

Messung der Glukoseaufnahme in Drosophila-Modellen der TDP-43-Proteinopathie

Quantifizierung globaler posttranslationaler Histonmodifikationen mittels intranukleärer Durchflusszytometrie in isolierten Mikroglia des Mausgehirns

Quantifizierung globaler posttranslationaler Histonmodifikationen mittels intranukleärer Durchflusszytometrie in isolierten Mikroglia des Mausgehirns

Quantifizierung globaler posttranslationaler Histonmodifikationen mittels intranukleärer Durchflusszytometrie in isolierten Mikroglia des Mausgehirns

Quantifizierung des mikroglialen Engulfments von synaptischem Material mittels Durchflusszytometrie