プラズモニック光熱がん治療:光熱温度分布を可視化するためのナノ粒子包埋腫瘍組織模倣ファントム

この記事では、プラズモン光熱療法の光学特性を再現する腫瘍組織ファントムを調製するためのプロトコルを紹介します。ファントムの調製、光熱評価、および治療パラメータを評価するための光熱温度測定に基づく開発された数値モデルの検証について詳しく説明し、予備試験のための in vivo 研究に代わる倫理的で費用対効果の高い代替手段を提供します。

新しいがん治療薬であるプラズモニック光温熱療法(PPTT)は、ナノ粒子(NP)を腫瘍に送達した後、近赤外線(NIR)を照射して局所的な熱を発生させ、がん細胞を破壊するという治療法です。PPTTを投与する前に、治療パラメータ(NP濃度、照射強度、および持続時間)を推定する必要があります。このために、数値シミュレーションが実行されます。しかし、ロバストな計算を確保するためには、これらのシミュレーションを、腫瘍組織の光学特性を再現する腫瘍組織模倣ファントムを用いた光熱実験を通じて検証する必要があります。PPTTの場合、治療パラメータは、組織とNPによる入射放射線の散乱と吸収によって支配されます。そのため、対象腫瘍・組織の減少した散乱係数(μ_s')と吸収係数(μ_a)を模倣したファントムで検証実験を行うことができます。

具体的には、このプロトコルは、正常な乳房組織に囲まれた、金ナノロッドを注入された乳房腫瘍のμ_およびμ_aを模倣したファントムを準備するための指示を提供する。このプロトコルでは、NIR照射、温度モニタリング、および時空間温度と熱電対を使用して測定された温度を比較することによる数値結果の検証についても詳しく説明しています。この研究で提示されたプロトコルは、寸法(φ40 x 12 mm)および中央腫瘍領域(φ20 x 6 mm)を有するヒドロゲルベースの円筒形乳房腫瘍組織ファントムの調製を容易にし、1%アガロースをベースマトリックスとして、脂質内を散乱成分として含み、腫瘍領域を25μg/mLの濃度で金ナノロッドで包埋した。ケーススタディの代表的な結果は、PPTTの数値シミュレーションを検証するための作製ファントムの応用を示しています。この研究では、実証されたプロトコルは、in vivo実験の前に治療パラメータを最適化および計画し、PPTTの数値シミュレーションを検証することを目的とした光熱実験を実施するために価値があると結論付けています。

プラズモン光温熱療法(PPTT)は、ナノ粒子(NP)を腫瘍部位に送達した後、近赤外線(NIR)放射線を照射する新たな限局性がん治療法です。NPは通常、腫瘍内(IT)または静脈内(IV)ルート¹を介して投与されます。NIR照射を受けると、入射放射線とNPsのプラズモン相互作用により、NPsの表面に局所的な熱が発生し、それが周囲の腫瘍組織に放散されます^2,3。この局所的な加熱は腫瘍領域の温度を上昇させ、熱アブレーション^4,5を通じて癌細胞死を引き起こします。効果的ながん治療は、さまざまな生物学的プロセスを通じて、1時間⁶で46°C、4〜6分7で50〜52°C、瞬間的な損傷⁸で60°Cなどの特定の温度を維持することによって達成できます。

光熱療法の適用については、さまざまな光熱剤が調査および報告されており、その治療効果はin vitroまたはin vivo研究を通じて評価されています。これらの薬剤には、近赤外染料(例えば、インドシアニングリーン、IR780、IR820)、ポリマーベースの光熱剤(例えば、ポリドーパミン)、および無機材料10、例えば、貴金属ベースのNPまたはプラズモニックNP(例えば、金NP)¹¹、遷移金属硫黄/酸化物¹²、およびMXenes13を含む無機材料¹⁰が含まれる.これらの中で、プラズモニックNP、特に金NPは、従来の光熱剤(例えば、染料)に比べて、より優れた光熱安定性、より高い光熱変換効率、および形状およびサイズの変化による調整可能なプラズモニック応答など、いくつかの利点を提供する¹⁰。これらの特性により、ゴールドNPは光温熱療法の理想的な候補となっており、現在臨床試験中のものもあります¹⁴。

治療効果を最適化し、PPTT中の腫瘍熱損傷を十分に確保するためには、PPTTの前臨床/臨床適用前に、NP投与量(濃度)やNIR放射線パラメータ(照射強度と照射時間を含む)などの治療パラメータを推定することが不可欠です。通常、これらのパラメータを確立するために数値シミュレーションが使用されます。腫瘍組織内の熱損傷を評価するために、さまざまな数値的方法が開発されており、格子ボルツマン法はそのようなアプローチの1つです^15,16。ただし、これらのシミュレーションの信頼性を確保するには、組織模倣ファントムと呼ばれる組織アナログを使用して検証する必要があります。これらのファントムは、実際の組織の光学的、熱的、生物学的、または機械的特性を再現するように調製することができ、生物学的応用^17,18を意図した新たに開発されたデバイス、材料、または方法の予備試験、治療評価、および検証を実施するための代替品として機能します。これにより、動物や人間の被験者の不必要な苦痛を軽減し、そのような実験に関連する倫理的懸念に対処することができる^19,20。

ファントムの設計と製造は、意図されたアプリケーション²¹に依存します。例えば、PPTTのような光線療法では、入射放射線の線量は、NPおよび組織^22,23によって吸収または散乱される光の量によって影響を受ける。したがって、光学特性、特に生体組織の減少散乱係数(μ_s^')および吸収係数(μ_a)を模倣する光ファントムは、PPTT評価およびその後の数値シミュレーション^{の検証に使用される24,25}。光ファントムは、典型的には、3つの主要な構成要素、すなわち、塩基マトリックス、散乱剤、および吸収剤^17,26から構成される。ベースマトリックスは、散乱成分と吸収成分を適切な濃度で保持し、目的の光学特性を再現します。これらのファントムは、ベースマトリックスのタイプに応じて、固体、液体、および半固体(ヒドロゲル)ファントムに分類できます。PPTTのような熱治療研究では、ヒドロゲルファントム、特にアガロースベースのファントムは、その生体適合性、固有の散乱および吸収が無視できること、単純な製造プロセス、および腫瘍の形状に対応する所望の形状およびサイズにキャストできる柔軟性のために好まれる^19,22。最も重要なことは、アガロースタイプのファントムの融解温度が~80°Cであるのに対し、調製されたアガロースベースのファントムは、バルク温度~70~80°Cまで使用できることです¹⁹。PPTTの場合、50~80°Cの温度範囲で十分であるため、このようなアガロースベースのファントムをPPTTベースの光熱評価に使用できます。

さまざまなハイドロゲルベースの組織模倣ファントムが開発され、さまざまな用途で報告されています。Mustariらは、アガロースベースの組織模倣ファントムを開発し、新たに設計された光学系¹⁸の検証においてその有用性を実証した。別の研究では、高密度集束超音波(HIFU)療法中の熱損傷の程度を測定するために、組織を模倣したサーモクロミックファントムが調製された²⁷。ポリアクリルアミドベースの組織模倣ファントムも、HIFUベースの癌治療中のキャビテーション効果を分析するために準備されています²⁸。この研究の目的は、腫瘍組織を模倣するファントムを製造するための段階的な方法を実証することです PPTT評価のためのファントムベースの光熱実験のプロトコルとともに。この提案された詳細なプロトコルは、ファントム製剤の採用と再現性、およびその後のファントムベースの光熱実験方法を促進することを目的としています 新しく開発されたナノ構造の光熱性能をテストするための、それにより数値シミュレーションを検証し、PPTTの治療パラメータの前処理計画または最適化を支援します。この記事では、表面下乳房腫瘍用に特別に設計されたファントム調製プロトコルについて説明します。しかし、光吸収剤および散乱剤の組成を変更することにより、同じステップをさまざまな腫瘍組織タイプ(さまざまな形状およびサイズ)の作製に適合させることができます。一例として、実証された組織模倣ファントムベースの光熱評価は、以前に報告された研究で採用され、表面下前腕腫瘍²⁴、表面下^IDC25、および皮膚腫瘍²⁹のPPTTシミュレーションを検証しています。

この論文では、皮膚表面下3 mmに位置し、正常な乳房組織に囲まれた、表面下または皮下乳房腫瘍、特に浸潤性乳管がん(IDC)のμ_を模倣する光学ファントムの準備手順について説明します。ファントムは、アガロースをベースマトリックスとして使用し、イントラリピッド(IL)を散乱剤として調製した円筒形の形状で、正常および癌性の乳房組織のμ_s'を模倣するために適切な濃度で添加されています。アガロースは、散乱と吸収が無視できる透明なヒドロゲルであり、光学ファントム^18,30の理想的なベースマトリックスです。さらに、ILは、細胞膜の二重層構造を模倣する20%脂肪エマルジョンであり、散乱剤^{として広く使用されている31,32}そして、正常および癌性乳房組織のμ_s'を再現するためにこの研究のために選ばれた。このファントムは、プラズモンNPとして金ナノロッド(AuNR)を注入した乳房腫瘍(IDC)を模倣し、AuNRのない正常な乳房組織に囲まれるように設計されています。PPTTで使用されるさまざまな金NPの中で、AuNRは、NIR領域での強力なプラズモン応答と、イヌやネコの患者を含む前臨床PPTT研究で広く使用されているため、この研究に選択されました¹⁴。このプロトコルは、2種類のファントムの調製を示しています:1つはIV注射で見られるようにAuNR分布を特徴とする腫瘍で、もう1つはIT注射によって達成されたAuNR分布を反映した腫瘍を持つものです。ファントム調製プロトコルに従って、NIR照射の実験セットアップとファントムの光熱評価を行う手順について説明します。最後に、これらの評価から得られた温度分布の結果を解釈し、実験データと数値シミュレーション結果を比較するためのステップバイステップのガイドを提供します。この比較は、開発された数値法の検証に役立ち、腫瘍に特化した最適な治療パラメーターのチューニングを可能にします。

注:ファントムは、文献で報告された組成に基づいてアガロースとイントラリピッドを使用して調製され、所望の光学特性を達成しました。患者や死体からの実際の生体組織は使用されていません。したがって、これらのファントムの準備には倫理的な制約がなく、インフォームドコンセントは必要ありません。

1. 適切な金型の選定または製作

1. .適切な金型の選択
   1. ファントムの希望の形状と寸法に一致する金型を選択します。腫瘍領域がNPで均一に分布し、正常組織に囲まれた円筒形ファントムの場合、ガラスのペトリ皿と小さなビーカーを型⁸ として使用します(図1A)。
      注:これらの手順は、円筒形の形状で腫瘍組織を模倣するファントムを準備するためのものです。その他の形状やサイズについては、適切な金型を選択してください。適切な金型が利用できない場合は、手順1.2で詳しく説明されているように、3次元(3D)印刷を使用して金型を製作します。
2. 3Dプリントによる金型の作製
   1. CAD(Computer-aided Design)ソフトウェア(SolidWorks、Autodesk Inventor、CATIAなど)を使用して、目的の形状とサイズに合わせて3Dモデルを設計します。このプロトコルに従うには、図1Bに示すように、中空シリンダー(内径40mm、厚さ2mm、高さ12mm、補足ファイル1参照)と2つの固体円筒形マスキングモールド(寸法φ20×6mm、φ14×3mm)を設計します。
      1. 中空円筒の設計/製図の場合は、CADソフトウェアで直径40mmと44mmの2つの円を作成します。次に、ジオメトリを 12 mm 押し出します。
      2. 固体の円筒形マスキング金型の場合は、直径20 mmと14 mmの円を作成し、それぞれ6 mmと3 mmだけ押し出します( 補足ファイル2 および 補足ファイル3を参照)。円柱の片側に長方形(辺44mmと5mm)を描き、2mm押し出します。
   2. 3Dプリンター対応ソフトウェア(Curaなど)を使用して3DモデルをGcode形式に変換して印刷します。
   3. このGcodeを使用して、3Dプリンターを使用して金型(例えば、ここではポリ乳酸[PLA]φ1.75mm、1kgのeSunを使用)を印刷します。
      注:長方形は、マスキング金型を吊り下げるために描かれています。さまざまな金型を設計し、製作して、他の目的の形状のファントムを準備できます。

2. 腫瘍組織模倣ファントム溶液の調製²⁵

注:この研究では、腫瘍組織を模倣した円筒形のアガロースベースの光学ファントムは、 図2に示すように、ITまたはIV注射を介してAuNRを注入した表面下乳房腫瘍に似せて準備されています。ITファントムには、AuNRを持つ中央腫瘍領域と周囲の正常組織領域の2つの領域があります。IVファントムには、腫瘍末梢にAuNRがある腫瘍領域、AuNRがない中央のむき出し腫瘍領域、および周囲の正常組織領域の3つの領域があります。光学特性(μ_a と μ_s')は腫瘍組織と正常組織で異なるため、組成の異なる領域ごとに別々のファントム溶液を調製し、個別に説明します。

1. 正常な乳房組織を模倣したファントム溶液の調製(溶液1)
   注:このソリューションは、ITファントムとIVファントムの両方に使用されます。 溶液 1 の調製ステップを 図 3A に示します。
   1. 金型の寸法に基づいて、解の理論体積を計算します。
      注:ここでは、φ40×12mmの円筒型の場合、計算体積は15cm3またはファントムあたり15mLです。このようなファントムを2つ用意する必要があるため、総容量は15mL×2、つまり30mLとなります。したがって、ファントム調製ステップ中の蒸発またはこぼれを考慮して、35 mLの溶液を調製します。
   2. 35mL溶液に添加するすべてのファントム成分(アガロース(基材)およびIL(飛散成分))の量(重量/濃度/容量)を計算します。
      1. 0.35 gのアガロースを加えて、1% w/v濃度に対応する35 mLの溶液を調製します。
      2. 文献で利用可能な μ_s' データに対する IL 濃度に基づいて、正常な乳房組織の所望の μ_s' に対応する IL 濃度 (すなわち、10.1 ^{cm-1 33}) を推定します。次に、式(1)を使用して、ファントム溶液に添加されるIL(20%エマルジョンストック)の量を計算します。
         (1)
         ここで、 C₁ および V₁ は、それぞれ試薬ストックの濃度(ここでは20%ILストック)および添加される試薬ストック溶液の量(ここでは計算される)である。 C₂は最終作業溶液中の試薬の必要濃度(文献から得られる)であり、 V₂ は最終作業溶液の総容量(ここでは35mL)です。
         注:ここで、10.1 ^cm-1のμ_s'の場合、報告された文献から推定されるIL濃度は1.04%^34,35です。上記の手順を使用して、添加するIL(20%ILストック)の容量は1.82mLです。
   3. 0.35 gのアガロースを秤量し、ビーカー内の33.18 mLの脱イオン(DI)水に加えます。ビーカーをアルミホイルで覆って、水の損失を防ぎます。
   4. 溶液の入ったビーカーをホットプレートに載せ、溶液が透明になるまで攪拌しながら120°Cで加熱します。
   5. ホットプレートの温度を60°Cに下げます。15分後、撹拌しながらIL1.82mLを加えます。得られた 溶液1を、使用する(注ぐ準備ができる)まで60°Cで攪拌します。
      注:60°Cのファントム溶液は、攪拌条件下で保管する必要があります。さもなければ、それは溶液の固化につながります。
2. AuNR包埋腫瘍ファントム溶液の調製(ソリューション2)
   注:このソリューションは、ITファントムとIVファントムの両方に使用されます。 ソリューション 2 の準備ステップを 図 3B に示します。
   1. 埋める腫瘍領域の容積(φ20×6mm)を計算します。
      注:このような2つの腫瘍ファントムのおおよその容量は3.8mLです。したがって、調製する溶液の量は4.5mLになります。
   2. 追加する腫瘍ファントム成分の量を計算します - アガロース、IL、およびAuNRs-セクション2.1で説明したのと同様の手順を使用して。
      1. 45 mgを加えて、1% w/v濃度に対応する4.5 mLの溶液を調製します。
      2. IL:乳房腫瘍の μ_s' は 4.6 ^{cm-1 33} であり、それを模倣するには、対応する IL 濃度が必要です 0.472%^34,35。したがって、20% ILストックから106.2 μLのILを4.5 mLの腫瘍ファントム溶液に加えます。
      3. ファントム内のAuNRの所望濃度は25μg/mLです。同じことを達成するために、3.21 mLのAuNRs溶液(ストック濃度:35 μg/mL)を腫瘍ファントム溶液に加えます。
   3. ビーカーに入れたDI水1.18mLにアガロース45mgを加え、アルミホイルで覆います。
   4. ビーカーをホットプレートに置き、溶液が透明になるまで120°Cで攪拌します。
   5. ホットプレートの温度を60°Cに下げ、溶液を15分間放置します。
   6. 撹拌条件下で、106.2 μL の IL と 3.21 mL の AuNR 懸濁液 (35 μg/mL) を添加します。得られた溶液 である溶液2を、注ぐまで60°Cで攪拌し続けます。
3. 裸腫瘍(AuNRなし)ファントム溶液の調製(ソリューション3)
   注:このソリューションはIVファントムにのみ使用されます。 ソリューション 2 の準備手順を 図 3C に示します。
   1. 腫瘍領域をむき出しにするために添加する懸濁液の理論体積(~φ20×6mm)を計算します。
      注:腫瘍ファントムのおおよその容量は1.9mLです。したがって、調製する溶液の量は2.5mLになります。
   2. セクション2.1で述べたのと同様の手順を使用して、追加する腫瘍ファントム成分(アガロースおよびIL)の量を計算します。
      1. 25 mgのアガロースを加えて2.5 mLの溶液を調製し、1%w / v濃度を達成します。.
      2. IL:乳房腫瘍の μ_s' は 4.6 ^{cm-1 33} であり、それを模倣するには、対応する IL 濃度が必要です 0.472%^34,35。20% ILストック59 μLを添加します。
   3. ビーカーのDI水2.44mLにアガロース25mgを加え、アルミホイルで覆います。
   4. ビーカーをホットプレートに置き、溶液が透明になるまで120°Cで攪拌します。
   5. ホットプレートの温度を60°Cに下げ、溶液を15分間放置します。
   6. 撹拌条件下で59μLのILを溶液に加えます。得られた溶液である 溶液3を、注ぐまで60°Cの攪拌条件下で保管します。

3. 腫瘍組織模倣ファントムの作製 24,25,36

1. 注湯ステップ用の型を準備します。そのためには、円筒型の底部をパラフィルムでシールし、マスキング型(φ20×6mm)を中央に置きます。
2. 溶液1をマスキングモールドのトップマークまで円筒形モールドに注ぎ、固化させます(図4A)。
3. 固化後、マスキング型を取り外して、腫瘍領域の空洞を作成します(図4B)。
   注:プロトコルは、ステップ3.3まではITファントムとIVファントムの両方で同じです。このプロセスについては、ステップ 3.3 の後に IT ファントムと IV ファントムについて別々に説明します。
4. ITファントム 24,25,36
   1. キャビティに 溶液2 を充填し、固化させます(図4C)。
   2. ソリューション1をファントムの上部に追加し、完全に固化させます(図4D)。
5. IVファントム ^24,25
   1. 小さめのマスキングモールド(φ14×3mm)を挿入し、その周りのキャビティに 溶液2 を充填します(図4E)。
   2. 固化後、小さい方の金型を取り外し、残りのキャビティに 溶液3 を充填します(図4F)。
   3. 溶液1を上部に追加し、完全に固化させます(図4G)。

4. ファントム24,25,36内の熱電対の挿入

注意: 空間温度分布を監視するために、図2に示すように、タイプKの熱電対がファントム内のさまざまな半径方向(r)および軸方向(z)の位置に挿入されます。正確な位置に熱電対を挿入するために、ガラスキャピラリーがガイドとして使用され、精度を確保します。熱電対の位置は(r、z)で示され、深さz = 3 mmの腫瘍の上面の中点は、図2A、Bに示すように、ITファントムとIVファントムの両方の基準点として機能し、(0、3)として指定されます。腫瘍領域の熱損傷を定量化するために半径方向と軸方向の位置を選択する場合、腫瘍の周辺部(半径方向と軸方向の両方)の位置が重要です。NIR照射中にこれらの周辺点で必要な温度を達成することで、完全な腫瘍アブレーションが保証されます。したがって、熱電対は、z = 3および9 mmの(腫瘍の)半径方向の極点、すなわち(10,3)および(10,9)に配置され、1つの熱電対は、図2A,Bに示されているように、z = 9 mm(末梢軸位置)の腫瘍-組織界面に配置される。さらに、軸方向の温度分布を評価するために、(0, 3) と (0, 9) の位置の間に熱電対を挿入し、(0, 6) と指定します。最後に、周囲の健康な組織領域の温度上昇を評価するために、1つの熱電対を(15,3)に挿入します。

1. ガラスキャピラリーを適切な長さにカットして、ファントム内の目的の半径方向および軸方向の位置に到達するようにします。
2. これらのガラスキャピラリー内に熱電対を挿入し、指定された半径方向および軸方向のファントム位置に1つずつ穴を開けます。
3. すべての熱電対が所定の位置に配置されたら、 図5Aに示すように、ファントムをガラスのペトリ皿に慎重に配置して、その後のNIR照射に備えます。

5. NIR照射への曝露と結果として生じる光熱温度の測定³⁶

1. 図5Aに示すように、ファントムの天面の中央領域がNIR光源の光ファイバーの先端に垂直になるように、ファントムを含むガラスシャーレ(熱電対で挿入)を配置します。
   注:ファントム表面のビーム径は、表面と光ファイバー先端の間の距離を変更することで調整できます。ここでは、9 mmの距離を保ち、ビーム径を20 mmにすることで、腫瘍中心領域を覆います。
2. データ集録(DAQ)システムをコンピュータに接続し、LabVIEWソフトウェアを開きます。
3. NIR光源(図5B)とソフトウェアの 再生 ボタン を同時に オンにして、 照射開始時の温度データを記録します。
4. ファントムに20分間照射した後、NIR光源のスイッチを切り、記録を停止します。
5. 記録された温度対時間データをプロットします。

6. シミュレーション結果との温度比較^24,25

注:実験は通常繰り返され、温度はすべての熱電対の場所で設定された時間間隔で記録されます。検証では、次の手順を実行します。

1. すべての熱電対位置 (r、z)における実験温度の平均と標準偏差を計算します。
2. 考慮された熱電対の位置での温度を数値で計算します。
3. 実験から得られた平均温度と、すべての熱電対位置でのシミュレーションによって得られた温度を、時間に対してプロットします( 図6)。
4. 表1に示すように、すべての熱電対位置の二乗平均平方根誤差(RMSE)と平均絶対誤差(MAE)を計算して、温度差を定量化して検証を評価します。
   注:MAEとRMSEは、それぞれ式2と式3を使用して計算されます。
   (2)
   (3)
   ここで、 TE、 TS、 およびN は実験的に得られた温度、数値で計算された温度、およびデータポイントの数(ここでは、温度は毎秒20分間記録されるため、= 1,200)それぞれです。i は時間の瞬間を表します。

図6は、 図2に示すように、AuNRに埋め込まれた腫瘍組織ファントムをすべての熱電対位置で実験中に得られた時間平均温度と、対応する熱電対位置でのシミュレーション中に得られた温度を比較したものです。ここでは、各分布、つまりAuNRのIT分布とIV分布ごとに4回実験を行いました。実験中の室?...

この論文では、光学ファントムを模倣したアガロースベースの腫瘍組織を調製するためのプロトコルを示します。ファントムは、PPTTの研究で使用するために、腫瘍と正常組織の光学特性を模倣するように設計されています。この研究では、PPTT中の数値法の検証にこれらのファントムを適用することに焦点を当てています。このプロトコルで最も重要なステップは、?...

著者らには、開示すべき競合する利害関係はありません。

この研究は、公的、商業的、または非営利の資金提供機関からの財政的支援なしに実施されました。著者らは、インドのチャンディーガルにあるCSIR-Central Scientific Instruments Organisationのインフラストラクチャとサポートに感謝しています。