金属カチオン存在下での限定的なタンパク質分解およびゲル電気泳動:血清アルブミン中のAu(III)結合発光ドメイン

ウシ血清アルブミン(BSA)におけるAu(III)の結合ドメインを研究するためのプロトコールを提示します。

提示されたプロトコルの目的は、BSAにおけるAu(III)結合のドメインを決定することです。BSA-Au(III)化合物は、紫外(UV)励起性赤色発光(_λem = 640 nm)を示し、芳香族残基から生じる自然UV/青色蛍光と比較して、珍しいストークスシフトを示します。赤色発光複合体は、pH 10以上の高アルカリ性条件で形成され、タンパク質内のコンフォメーション変化が起こる必要があります。さらに、この赤色発光を得るためには、BSA中のCys-Cysジスルフィド結合の保存が必要です。この発光のメカニズムを理解するためには、発光体を形成するAu(III)結合部位の解明が不可欠です。発光団形成部位を評価する簡単な方法は、(1)酵素消化によってタンパク質を予測可能にフラグメント化し、(2)得られたフラグメントをAu(III)と反応させ、(3)ゲル電気泳動を行って、十分に分離されたフラグメントバンドを観察し、ゲル内の赤色発光を分析することです。しかし、アルカリ性条件と金属カチオンとの反応により、新しい限定タンパク質分解技術とゲル電気泳動条件を適用する必要があります。特に、ゲル電気泳動に金属カチオンが存在すると、バンド分離が技術的に困難になる可能性があります。この新しいプロトコルを、BSAの赤色発光団形成金属結合ドメインを同定する手順で説明します。したがって、このプロトコルは、金属カチオンの存在下で、非変性状態または部分的に変性した状態に留まらなければならないタンパク質断片の分析に適用できます。タンパク質の大部分は機能するために金属カチオンを必要とするため、金属結合タンパク質の分析がしばしば望まれますが、文献ではX線結晶構造解析に依存してきました。一方、この方法は、タンパク質の結晶化を必要とせず、目的のpH条件でタンパク質と金属カチオンとの相互作用を研究するためのサプリメントで使用できます。

ウシ血清アルブミン^1,2,3(BSA)-金(Au)錯体は、高アルカリ性条件(pH > 10)での反応により、UV励起性赤色発光(λem=640nm^)を示すことが知られている4,5,6,7。この化合物の多数の用途が提案され、調査されており、これには、センシング、^8,9,10イメージング11,12,13、およびナノメディシン14,15,16が含まれます。しかし、発光のメカニズムは完全には解明されていません。BSAにおけるAu(III)結合の位置と発光団形成を特定することは、重要なステップです。

近年、赤色発光4を得るためには、BSAのpH制御された動的立体配座変化と、それに続くCys-Cysジスルフィド結合へのAu(III)結合が必要であることが明らかに^{なっています4。}この発光のメカニズムをさらに解明するためには、発光団形成膜Au(III)結合部位の解明が不可欠です。発光団形成部位を評価する簡単な方法は、酵素消化によってBSA-Au化合物を断片化し、各断片の発光性を分析することです。しかし、アルカリ性条件と金属カチオンの存在により、新しいタンパク質分解およびゲル電気泳動プロトコルが必要です。

私たちは、Cys-Cysジスルフィド結合を保持しながら、タンパク質断片調製の方法として限定的な酵素タンパク質分解を採用しました。従来のタンパク質分解では、すべてのジスルフィド結合の切断とタンパク質の直鎖化(ジチオスレイトールや尿素などの変性剤、および熱による)が必要です。ここでは、Cys-Cys結合保存タンパク質分解を実証し、得られたフラグメントとAu(III)との反応後の発光を評価します。具体例として、消化酵素にトリプシンを使用します。

このプロトコルは、一般に、金属カチオンの存在下でのタンパク質およびフラグメントのゲル電気泳動を説明しています。タンパク質の大部分は機能するために金属カチオンを必要とするため^17,18、金属結合タンパク質の分析がしばしば望まれますが、これは文献でX線結晶構造解析に依存してきました。BSAの構造とそのフラグメントは、pH > 10を含む中性でないpHコンフォメーションについては知られていません。したがって、Au(III)配位の構造の詳細は、ゲル電気泳動だけでは解析できません。一方、この方法は、タンパク質の結晶化を必要とせずに、タンパク質と金属カチオンとの相互作用を研究するためのサプリメントに使用することができますが、これは望ましい機能的pH条件では不可能な場合があります。金属カチオンの存在は、ゲルバンドの著しい「汚れ」を引き起こす可能性があります。この論文の焦点は、この技術的な困難を克服し、金属誘発バンドスミアリングを最小限に抑えるためのプロトコルを提示することです。

1. BSA-Au複合体フラグメントの合成

1. 5 mLバイアルに、50 mM Tris-HClおよび50 mM NaClを含有し、pH 8.0のHPLCグレード水1 mLにBSA5 mgを溶解します。
2. 50 mM Tris-HClおよび50 mM NaClを含むHPLC水の調製した溶液1 mLに2 mgのトリプシンをpH 8.0で溶解します。
3. BSAの反応バイアルを37°Cのウォーターバスに入れ、マグネチックスターラーを使用して750rpmで激しく撹拌します。
4. 攪拌が始まった直後に、調製したばかりのトリプシン50μLを溶液に加えます。
   注:従来の酵素消化反応とは対照的に、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ジチオスレイトール(DDT)、または尿素を溶液に追加しないでください。また、温度焼鈍は行わないでください。この限られたタンパク質分解により、Cys-Cysジスルフィド結合は無傷に保たれ、表面的にアクセス可能なランダムなコイルセグメントのみが酵素によって切断されます。
5. 塩化Au(III)(クロロアウリン酸)をHPLCグレードの水1 mLに750 μMの濃度で溶解します。
6. 反応バイアルにクロロアウリン酸溶液を添加すると、BSA:Auモル比が1:10になります。
7. マグネチックスターラーを使用して、混合物を37°Cおよび750rpmで2分間撹拌します。
8. 100 μLの1 M NaOHを反応バイアルに加え、pH 12.5にします。
   注:反応の高アルカリ性条件は、赤色発光複合体の形成を誘発し、トリプシンの酵素活性を消光するはずです。
9. 混合物を750rpmで37°Cで2時間激しく撹拌します。
   注:最終製品は、それ以上の精製を行わずにすぐに使用しました。

2. 限定タンパク質分解法によるBSA-Au複合体フラグメントのゲル電気泳動

1. プレキャストした4-12%グラジエントBis-Trisゲルを脱イオン水で洗い流し、ゲル電気泳動タンクに入れます。
2. 濃縮ストック溶液から500 mLのMESランニングバッファー溶液を調製し、脱イオン水で希釈します。
3. 20%グリセロール溶液でサンプルを1 μgのタンパク質/μLに希釈することにより、各ウェルレーンを調製します。この希釈により、pHは12.5から~8になります。
   注:サンプルバッファーにはSDS、DTT、尿素は使用されていません。また、サンプルの温度アニーリングは行わないでください。
4. 各サンプル溶液10 μLをゲルの各レーンに加えます。
5. ゲルを150Vの定電圧で1時間泳動します。
6. ゲルを流した後、ゲルをキャストから取り出し、脱イオン水を使用してそれぞれ1分間3回すすぎ、ランニングバッファーを取り除きます。
7. ゲルを200 mLの脱イオン水に保存し、ゲルイメージングシステムを使用してゲル内の蛍光を直ちに測定します。
8. 200 mLの溶液に200 mgのCoomassie Brilliant Blueを含有する新鮮な染色溶液を調製します:メタノール、酢酸、および水の容量比は50:10:40です。
9. ゲルを200mLの染色液で30分間、穏やかに揺さぶって洗浄します。
10. メタノール、酢酸、および水をメタノール:酢酸:水= 50:10:40の体積比で混合することにより、新鮮な脱染溶液を調製します。
11. ゲルを100mLの除染液で1時間、穏やかに攪拌しながら洗浄します。
12. 上記の手順を4回繰り返し、最後に固定ゲル脱イオン水を室温で保存します。

3. 限定タンパク質分解法によるBSA-Au複合体フラグメントの解析

1. BSAのアミノ酸配列を調べ、Cys-Cys結合の保存(限定的なタンパク質分解)を仮定して、酵素消化によって得られると予想されるフラグメントの表を準備します。トリプシン消化の場合(表1)、切断位置はLysとArgのC末端ですが、Proが続くことを除いて、トリプシン切断位置の曖昧さから生じるフラグメント分子量の小さな誤差を考慮してください。
   注:BSAのアミノ酸配列を分析すると、このステップから得られる予想される限定的なトリプシン断片は、[A](7.3 kDa、残基1〜64)です。[B] (5.9 kDa、残基 65 - 114);[C] (20.1 ~ 22.4 kDa, 残基 115/117 - 294/312);[D] (21.3 ~ 23.4 kDa, 残基 295/313 - 499);および[E](9.5 kDa、残基500〜583)。トリプティック カット位置のあいまいさは、Cys 結合ユニットの外側のセグメントから生じます。BSAの場合、残基107〜114(0.9 kDa)および残基295〜312(2.1 kDa)は、Cys-Cys結合結合フラグメントのN末端またはC末端部分として現れることがあります。
2. これらの予想されるフラグメント内の表面露出したCysの位置を特定します。トリプシン消化BSAの場合、表面に露出したCys34はフラグメント[A]のみです。
3. ゲル電気泳動バンドとして観察された分子量のリストを、~66 kDa(BSAの分子量)未満で調製します。
   注:トリプシン消化の場合、観察されたゲル電気泳動バンドは次のとおりです:Band(1)=未消化BSA;バンド(2) ~50 kDa;バンド(3) ~44 kDa;バンド(4) ~42 kDa;バンド(5) ~36 kDa;バンド(6) ~32 kDa;バンド(7) ~26 kDa;バンド(8) ~21 kDa;バンド(9) ~15 kDa;バンド(10) ~12 kDa;バンド(11) ~10 kDa;バンド(12) ~8 kDa.
4. ゲル内で観察された分子量のリストを、予想されるBSAフラグメントの逐次追加によって再構築します。トリプシンの場合、フラグメント[A]は、表面に露出したCys残基を介して[A]-[A]二量体を形成することができます。

観察された12のゲルバンドは、予想される5つのBSAフラグメント[A]〜[E]から一意に再構築されました（図1〉。結果は文献と一致しており、αヘリックスおよびβストランドを含む二次構造が保存されている19,20,21,22,23。

本プロトコールの目的は、BSA-Au複合体中の赤色発光団形成ドメインを同定することでした。BSAフラグメントを得るためには、限定的なトリプシンタンパク質分解法を用いて、赤色発光に必要なCys-Cys結合を保持しました。Au(III)存在下でのタンパク質分解と電気泳動の条件を最適化しました。同じ原理は、金属カチオンの存在下での断片化タンパク質のゲル分析にも広?...

著者は何も開示していません。

S.E.は、PhRMA財団、白血病研究財団、国立衛生研究所(NIH R15GM129678)からの支援に感謝しています。