تحلل البروتين المحدود والرحلان الكهربائي للهلام في وجود كاتيونات معدنية: مجال الإنارة المرتبط ب Au (III) في ألبومينات المصل

نقدم بروتوكولا لدراسة مجال ربط Au (III) في ألبومين مصل الأبقار (BSA).

الغرض من البروتوكولات المقدمة هو تحديد مجال ربط Au (III) في BSA. يظهر مركب BSA-Au (III) تلألؤ أحمر قابل للإثارة بالأشعة فوق البنفسجية (UV) (λ_em = 640 نانومتر) ، مع تحولات ستوكس غير عادية مقارنة بالأشعة فوق البنفسجية الفطرية / التألق الأزرق الناشئ عن المخلفات العطرية. تتشكل المجمعات ذات الإضاءة الحمراء في ظروف شديدة القلوية أعلى من درجة الحموضة 10 وتتطلب حدوث تغيير في التشكل داخل البروتين. بالإضافة إلى ذلك ، يعد الحفاظ على روابط ثاني كبريتيد Cys-Cys في BSA أمرا ضروريا للحصول على هذا التلألؤ الأحمر. من أجل فهم آلية هذا التلألؤ ، من الضروري توضيح موقع ربط Au (III) المكون. تتمثل إحدى الطرق السهلة لتقييم موقع تكوين اللومينوفور في (1) تجزئة البروتين بشكل متوقع عن طريق الهضم الأنزيمي ، (2) تفاعل الشظايا التي تم الحصول عليها مع Au (III) ، ثم (3) إجراء الرحلان الكهربائي للهلام لمراقبة نطاقات الشظايا المنفصلة جيدا وتحليل التلألؤ الأحمر داخل الهلام. ومع ذلك ، نظرا للظروف القلوية والتفاعل مع الكاتيونات المعدنية ، يجب تطبيق تقنيات جديدة محدودة للتحلل البروتيني وظروف الرحلان الكهربائي للهلام. على وجه الخصوص ، يمكن أن يؤدي وجود الكاتيونات المعدنية في الرحلان الكهربائي للهلام إلى جعل فصل النطاق صعبا من الناحية الفنية. نصف هذا البروتوكول الجديد في خطوات لتحديد مجال ربط المعادن المكونة لللومينوفور الأحمر في BSA. وبالتالي يمكن تطبيق هذا البروتوكول لتحليل شظايا البروتين التي يجب أن تظل في حالة غير مشوهة أو مشوهة جزئيا ، في وجود كاتيونات معدنية. نظرا لأن غالبية البروتينات تحتاج إلى كاتيونات معدنية لتعمل ، غالبا ما تكون تحليلات البروتينات المرتبطة بالمعدن مرغوبة ، والتي اعتمدت على علم البلورات بالأشعة السينية في الأدبيات. من ناحية أخرى ، يمكن استخدام هذه الطريقة في مكمل لدراسة تفاعلات البروتينات مع الكاتيونات المعدنية دون الحاجة إلى تبلور البروتين وفي حالة الأس الهيدروجيني المطلوبة.

من المعروف أن مجمعات ألبومين مصل^{الأبقار 1،2،3} (BSA) - الذهب (Au) ، التي تم الحصول عليها عن طريق التفاعلات في ظروف شديدة القلوية (درجة الحموضة > 10) ، تظهر تلألؤ أحمر قابل للإثارة للأشعة فوق البنفسجية (λ_em = 640 نانومتر) ^4،5،6،7. تم اقتراح العديد من التطبيقات لهذا المركب والتحقيق فيها ، بما في ذلك الاستشعار ، ^8،9،10 التصوير^11،12،13 ، والطب^{النانوي 14،15،16}. ومع ذلك ، فإن آلية اللمعان ليست مفهومة تماما. يعد تحديد موقع ارتباط Au (III) وتكوين luminophore في BSA خطوة مهمة.

لقد تم توضيح مؤخرا أن تغيير التشكل الديناميكي الذي يتم التحكم فيه بواسطة الأس الهيدروجيني ل BSA ، متبوعا بارتباط Au (III) برابطة ثاني كبريتيد Cys-Cys ، ضروري لإنتاج اللمعان الأحمر⁴. من أجل اكتساب مزيد من الأفكار حول آلية هذا التلألؤ ، من الضروري توضيح موقع ربط Au (III) المكون. تتمثل إحدى الطرق السهلة لتقييم موقع تكوين اللمعان في تجزئة مركب BSA-Au عن طريق الهضم الأنزيمي ، وتحليل كل جزء من أجل اللمعان. ومع ذلك ، نظرا للظروف القلوية ووجود الكاتيونات المعدنية ، هناك حاجة إلى بروتوكولات جديدة لتحلل البروتين والرحلان الكهربائي للهلام.

استخدمنا تحلل البروتين الأنزيمي المحدود كطريقة لمستحضرات شظايا البروتين ، مع الحفاظ على روابط ثاني كبريتيد Cys-Cys. في الانحلال البروتيني التقليدي ، من الضروري شق جميع روابط ثاني كبريتيد وخطية البروتين (عن طريق تغيير طبيعة العوامل مثل ثنائي ثيوثريتول واليوريا ، وكذلك الحرارة). هنا ، نوضح انحلال البروتين الذي يحافظ على رابطة Cys-Cys ونقيم الأجزاء التي تم الحصول عليها ولألؤانها بعد التفاعل مع Au (III). نستخدم التربسين للإنزيم الهضمي ، كمثال ملموس.

يصف البروتوكول بشكل عام الرحلان الكهربائي الهلامي للبروتينات والشظايا في وجود الكاتيونات المعدنية. نظرا لأن غالبية البروتينات تحتاج إلى كاتيونات معدنية لتعمل^17،18 ، غالبا ما تكون تحليلات البروتينات المرتبطة بالمعادن مرغوبة ، والتي اعتمدت على علم البلورات بالأشعة السينية في الأدبيات. لا تعرف هياكل BSA وشظاياها بمطابقات الأس الهيدروجيني غير المحايدة بما في ذلك عند درجة الحموضة > 10. لذلك ، لا يمكن تحليل التفاصيل الهيكلية لتنسيق Au (III) عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام وحده. من ناحية أخرى ، يمكن استخدام هذه الطريقة في مكمل لدراسة تفاعلات البروتينات مع الكاتيونات المعدنية دون الحاجة إلى تبلور البروتين ، والذي قد لا يكون ممكنا في حالة الأس الهيدروجيني الوظيفية المرغوبة. يمكن أن يتسبب وجود الكاتيونات المعدنية في "تلطيخ" كبير في عصابات الهلام. ينصب تركيز هذه الورقة على التغلب على هذه الصعوبة التقنية وتقديم بروتوكول لتقليل تلطيخ النطاق الناجم عن المعدن.

1. توليف شظايا BSA-Au المعقدة

1. قم بإذابة 5 مجم من BSA في 1 مل من الماء من درجة HPLC التي تحتوي على 50 ملي Tris-HCl و 50 ملي كلوريد الصوديوم مع درجة حموضة 8.0 في قارورة سعة 5 مل.
2. قم بإذابة 2 مجم من التربسين في 1 مل من محلول طازج من ماء HPLC يحتوي على 50 ملي من Tris-HCl و 50 ملي كلوريد الصوديوم مع درجة حموضة 8.0.
3. ضع قارورة تفاعل BSA في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية وحركها بقوة عند 750 دورة في الدقيقة باستخدام محرك مغناطيسي.
4. مباشرة بعد بدء التقليب ، أضف 50 ميكرولتر من التربسين الطازج إلى المحلول.
   ملاحظة: لا ينبغي إضافة كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) أو ديثيوثريتول (DDT) أو اليوريا إلى المحلول ، على عكس تفاعلات هضم الإنزيم التقليدية. أيضا ، لا ينبغي إجراء التلدين بدرجة الحرارة. بسبب هذا التحلل البروتيني المحدود ، سيتم الاحتفاظ بروابط ثاني كبريتيد Cys-Cys سليمة وسيتم شق أجزاء الملف العشوائي التي يمكن الوصول إليها على السطح فقط بواسطة الإنزيم.
5. قم بإذابة كلوريد Au (III) (حمض الكلوروريك) في 1 مل من الماء بدرجة HPLC بتركيز 750 ميكرومتر.
6. في قارورة التفاعل ، أضف محلول حمض الكلوروريك للحصول على نسبة مولار BSA: Au ناتجة عن 1:10.
7. قلب الخليط لمدة دقيقتين عند 37 درجة مئوية وعند 750 دورة في الدقيقة باستخدام محرك مغناطيسي.
8. أضف 100 ميكرولتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم إلى قارورة التفاعل لتحقيق درجة حموضة 12.5.
   ملاحظة: يجب أن تؤدي الظروف القلوية العالية للتفاعل إلى تكوين مركب الإنارة الأحمر وإخماد النشاط الأنزيمي للتربسين.
9. قلب الخليط بقوة عند 750 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: تم استخدام المنتج النهائي على الفور دون مزيد من التنقية.

2. الرحلان الكهربائي للهلام لشظايا BSA-Au المعقدة عن طريق التحلل البروتيني المحدود

1. اشطف جل Bis-Tris المتدرج مسبقا المصبوب بنسبة 4-12٪ باستخدام الماء منزوع الأيونات وضعه في خزان الرحلان الكهربائي للجل.
2. قم بإعداد 500 مل من محلول عازل تشغيل MES من محلول مخزون مركز ، مخفف بالماء منزوع الأيونات.
3. استعد لكل حارة بئر عن طريق تخفيف العينات إلى 1 ميكروغرام من البروتين / ميكرولتر في محلول جلسرين بنسبة 20٪. هذا التخفيف يجعل الرقم الهيدروجيني من 12.5 إلى ~ 8.
   ملاحظة: لا يتم استخدام SDS أو DTT أو اليوريا في المخزن المؤقت للعينة. بالإضافة إلى ذلك ، لا ينبغي إجراء التلدين بدرجة حرارة العينات.
4. أضف 10 ميكرولتر من كل محلول عينة إلى كل حارة من الجل.
5. قم بتشغيل الجل لمدة 1 ساعة بجهد ثابت 150 فولت.
6. بعد تشغيل الجل ، قم بإزالة الجل من الجبيرة واشطفه 3 مرات لمدة 1 دقيقة باستخدام الماء منزوع الأيونات لإزالة المخزن المؤقت الجاري.
7. قم بتخزين الجل في 200 مل من الماء منزوع الأيونات وقم بقياس التألق داخل الهلام على الفور ، باستخدام نظام تصوير هلامي.
8. تحضير محلول تلطيخ طازج يحتوي على 200 مجم من Coomassie Brilliant Blue في 200 مل من المحلول التالي: الميثانول وحمض الأسيتيك والماء بنسبة حجم 50:10:40.
9. اغسل الجل في 200 مل من محلول التلوين لمدة 30 دقيقة باستخدام هزاز لطيف.
10. قم بإعداد محلول جديد لإزالة البقع عن طريق خلط الميثانول وحمض الأسيتيك والماء بنسبة حجم الميثانول: حمض الخليك: الماء = 50:10:40.
11. اغسل الجل في 100 مل من محلول إزالة البقع لمدة 1 ساعة باستخدام التحريك اللطيف.
12. كرر الإجراء أعلاه 4 مرات وأخيرا قم بتخزين الماء الثابت منزوع الأيونات في درجة حرارة الغرفة.

3. تحليل شظايا BSA-Au المعقدة عن طريق تحلل البروتين المحدود

1. افحص تسلسل الأحماض الأمينية ل BSA وقم بإعداد جدول للأجزاء المتوقعة التي يمكن الحصول عليها عن طريق الهضم الأنزيمي ، بافتراض الحفاظ على رابطة Cys-Cys (التحلل البروتيني المحدود). في حالة هضم التربسين (الجدول 1) ، فإن مواقع القطع هي الطرف C من Lys و Arg ، باستثناء Pro. حساب الأخطاء الصغيرة في الأوزان الجزيئية للجزء ، الناشئة عن الغموض في مواقع القطع التربتية.
   ملاحظة: عند تحليل تسلسل الأحماض الأمينية ل BSA ، فإن الشظايا التريبتية المحدودة المتوقعة التي تم الحصول عليها من هذه الخطوة هي: [A] (7.3 kDa ، المخلفات 1 - 64) ؛ [B] (5.9 كيلو دالتون ، المخلفات 65-114) ؛ [C] (20.1 ~ 22.4 كيلو دالتون ، المخلفات 115/117 - 294/312) ؛ [د] (21.3 ~ 23.4 كيلو دالتون ، المخلفات 295/313 - 499) ؛ و [E] (9.5 كيلو دالتون ، المخلفات 500 - 583). ينتج الغموض في مواقع القطع التربتية عن الأجزاء خارج الوحدات المتصلة ب Cys. بالنسبة ل BSA ، يمكن أن تظهر المخلفات 107 - 114 (0.9 كيلو دالتون) والمخلفات 295 - 312 (2.1 كيلو دالتون) كجزء الطرف N أو C من جزء متصل برابطة Cys-Cys.
2. حدد موقع (مواقع) Cys المكشوفة للسطح في هذه الأجزاء المتوقعة. بالنسبة إلى BSA المهضوم بالتربسين ، فإن Cys34 الوحيد المكشوف للسطح موجود في جزء [A].
3. قم بإعداد قائمة الأوزان الجزيئية التي لوحظت كنطاقات الرحلان الكهربائي الهلامية ، أقل من ~ 66 كيلو دالتون (الوزن الجزيئي ل BSA).
   ملاحظة: لهضم التربسين ، فإن نطاقات الرحلان الكهربائي للهلام المرصودة هي: النطاق (1) = BSA غير المهضوم ؛ النطاق (2) ~ 50 كيلو دالتون ؛ النطاق (3) ~ 44 كيلو دالتون ؛ الفرقة (4) ~ 42 كيلو دالتون ؛ الفرقة (5) ~ 36 كيلو دالتون ؛ الفرقة (6) ~ 32 كيلو دالتون ؛ الفرقة (7) ~ 26 كيلو دالتون ؛ النطاق (8) ~ 21 كيلو دالتون ؛ الفرقة (9) ~ 15 كيلو دالتون ؛ الفرقة (10) ~ 12 كيلو دالتون ؛ الفرقة (11) ~ 10 كيلو دالتون ؛ والفرقة (12) ~ 8 كيلو دالتون.
4. أعد بناء قائمة الأوزان الجزيئية المرصودة في الهلام ، من خلال الإضافات المتسلسلة لشظايا BSA المتوقعة. بالنسبة للتربسين ، يمكن أن يشكل الجزء [A] ثنائي [A] - [A] من خلال بقايا Cys المكشوفة للسطح.

تم إعادة بناء الشريط الهلامي الاثني عشر المرصودة بشكل فريد من شظايا BSA الخمسة المتوقعة [A] - [E] (الشكل 1). كانت النتائج متوافقة مع الأدبيات ، حيث تم الحفاظ على الهياكل الثانوية بما في ذلك α الحلزونات والخيوط^{β 19،}

كان الغرض من هذا البروتوكول هو تحديد مجال تكوين اللومينوفور الأحمر في مجمعات BSA-Au. استخدمنا تحلل البروتين التربتي المحدود للحصول على شظايا BSA ، مع الحفاظ على روابط Cys-Cys الضرورية لإنتاج اللمعان الأحمر. قمنا بتحسين ظروف تحلل البروتين والرحلان الكهربائي في وجود Au (III). يمكن ت?...

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

يقر S.E. بالدعم المقدم من مؤسسة PhRMA ومؤسسة أبحاث سرطان الدم والمعاهد الوطنية للصحة (NIH R15GM129678).