生体材料に対する細胞毒性と細胞応答へのアクセス

この方法論は、フローサイトメトリー、RT-PCR、免疫細胞化学、およびその他の細胞および分子生物学的手法を含む生存率アッセイおよび表現型分析を使用して、可溶性抽出物の調製を通じて生体材料の細胞毒性を評価することを目的としています。

生体材料はヒト組織と直接的または間接的に接触するため、その細胞毒性を評価することが重要です。この評価はいくつかの方法で実行できますが、使用するアプローチの間に大きな不一致が存在し、再現性と得られた結果の比較が損なわれます。本論文では、歯科用生体材料に使用する可溶性抽出物を用いて生体材料の細胞毒性を評価するためのプロトコルを提案する。抽出物の調製は、ペレットの製造から培養培地での抽出まで、詳細に説明されています。生体材料の細胞毒性評価は、MTTアッセイを使用した代謝活性、スルホルホダミンB(SBR)アッセイを使用した細胞生存率、フローサイトメトリーを使用した細胞死プロファイル、およびMay-Grünwald Giemsaを使用した細胞形態に基づいています。細胞毒性評価に加えて、免疫細胞化学およびPCRによって評価された特異的マーカーの発現に基づいて細胞機能を評価するためのプロトコルが記載されている。このプロトコルは、抽出物の方法論を使用して、再現性のある堅牢な方法で、生体材料の細胞毒性および細胞効果評価のための包括的なガイドを提供します。

生体適合性は、局所的および全身的な損傷のない、組織を統合し、好ましい治療反応を誘発する材料の能力として定義することができます^1,2,3。生体適合性評価は、医療用材料の開発に不可欠です。したがって、このプロトコルは、新しい生体材料の開発を目指す、または既存の生体材料の新しいアプリケーションの研究を目指すすべての研究者に体系的かつ包括的なアプローチを提供します。

in vitro細胞毒性試験は、初代細胞培養または細胞株を用いた生体適合性評価の第1段階として広く使用されています。結果は、潜在的な臨床応用の最初の指標を構成します。この試験は、生体材料の開発に不可欠であることに加えて、EUAおよびEU規制当局(FDAおよびCE^認証)4,5,6,7,8からの市場導入に関する現在の規制に準拠するために必須です。さらに、生物医学研究における標準化された試験は、類似の生体材料またはデバイスに関する異なる研究からの結果の再現性および比較の点で大きな利点を提供する⁹。

国際標準化機構(ISO)のガイドラインは、正確で再現性のある方法で材料を試験するために、複数の独立した商業、規制、および学術研究所で広く使用されています。ISO 10993-5はin vitro細胞毒性評価を指し、ISO 10993-12はサンプリング調製^10,11に報告しています。生体材料試験には、材料の種類、接触組織、および治療目標に応じて選択される3つのカテゴリが提供されます:抽出物、直接接触、および間接接触8,11,12,13。抽出物は、細胞培養培地を生体材料で濃縮することによって得られる。直接接触試験のためには、生体材料を細胞培養物上に直接配置し、そして、間接接触において、細胞とのインキュベーションをアガロースゲル¹¹などの障壁によって分離して行う。適切なコントロールが必須であり、少なくとも3つの独立した実験を実行する必要があります⁵、^8、10、^11、14。

細胞毒性の可能性を判断するには、臨床状態をシミュレートまたは誇張することが重要です。抽出物試験の場合、材料の表面積。 中程度の量;培地および材料pH;材料の溶解度、浸透圧および拡散比。攪拌、温度、時間などの抽出条件は、培地濃縮に影響を与える⁵。

この方法論により、固体および液体の両方のいくつかの医薬製剤の細胞毒性の定量的および定性的評価が可能になります。中性赤色取り込み試験、コロニー形成試験、MTTアッセイ、およびXTTアッセイ⁵、^10、14などのいくつかのアッセイを実施することができる。

発表されたほとんどの細胞毒性評価研究では、より単純なアッセイ、すなわちMTTおよびXTTが使用されており、限られた情報しか提供されない。生体適合性の評価には、細胞毒性の評価だけでなく、このプロトコルが承認している^{ように、特定の}試験材料の生物活性も含まれる必要があります2。正当化され、文書化されている場合は、追加の評価基準を使用する必要があります。したがって、このプロトコルは、生体材料の細胞毒性評価のための一連の方法を詳述した包括的なガイドを提供することを目的としています。さらに、さまざまな細胞プロセス、すなわち細胞死の種類、細胞形態、特定のタンパク質の合成における細胞機能、および特定の組織産生の評価について説明します。

1.ペレットの準備

1. PVCプレートに既知寸法の円形の穴を開けることにより、ポリ塩化ビニル(PVC)型を作製する。
   注意: PVC成形品はさまざまなサイズで作ることができます。式 A= h(2πr)+2πr² (r: 円柱の半径、h: 円柱の高さ) を使用して、PVC 金型の接触面を計算します。
2. 製造元の指示に従って、実験の開始にできるだけ近いところで試験する生体材料を準備します。
   注:ペースト/ペースト製剤の生体材料の調製のために、適切な量のベースペーストと触媒を混合スパチュラで手動で混合します。液体および粉末の配合に基づく他の材料については、製造元の指示に従うか、新しい材料に適した指示に従って、手動のへらまたは振動を伴う機械的混合を実行する必要があります。液体材料の場合、このステップは必要ありません。手順 2 でプロトコルを開始します。
3. へらで型の上に生体材料を置き、適切な時間に設定します。
   注意: 生体材料の硬化時間と設定条件は、製造元の指示に従うか、新しい材料に適している必要があります。
4. 固めた後、生体材料のペレットをPVC型から取り出し、容器に入れます(6ウェルプレートまたはペトリ皿を使用できます)。
5. ペレットを紫外線(UV)ランプの下に各面で20分間置き、滅菌します。

2. 生体材料抽出物の入手

注意: すべての手順は、厳格な無菌条件下で実行する必要があります。

1. 1.1に記載の式に基づいてペレット表面積を計算して、必要なペレット数を決定します。
   注:基準値として、250 mm² / mL ^11,15の接触表面積は、培地^1mLあたり9ペレット(r 3 mm x h 1.5 mm)を添加することによって達成されます。
2. 可溶性抽出物(生体材料が豊富な抽出物)を調製する。
   1. ペレットを50 mLチューブに入れ、対応する細胞培養培地を加えます。チューブを37°のインキュベーターに24時間、一定の回転で置きます。
      注:細胞培養に適した細胞培養培地を使用してください。
   2. 24時間後、インキュベーターからチューブを取り外します。この時点で、抽出物は1/1または100%の濃度に対応する。
   3. 等量のコンディショニング培地を細胞培養培地に順次添加することにより、抽出物の希釈を行います。
      注意: メディアのpH調整は行わないでください。
      1. 100%抽出物1mLに培養液1mLを加え、50%抽出物を得た。50%抽出物1 mLに培地1 mLを加えて25%抽出物を得る、以下同様です(図1)。
         注:各化合物に関連する濃度を使用してください。

図1:可溶性抽出物の調製および希釈のスキーム。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3. 生体材料抽出物を用いた細胞インキュベーション

1. 細胞懸濁液を調製し、実験に必要な細胞数に応じて、マルチウェルプレートなどの適切な細胞容器にプレートします。
   1. 80%〜90%のコンフルエントを有する所望の細胞のフラスコから始める。
   2. 細胞培養培地を廃棄し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、トリプシン-EDTA(75 cm 2細胞培養フラスコの場合は1〜² mL)で細胞を剥離します。
   3. 細胞培養培地(75 cm 2細胞培養フラスコの場合は² 〜4 mL)を加え、細胞懸濁液をチューブに移し、200 x g で5分間遠心分離します。
   4. ペレットを既知量の細胞培養培地に懸濁します。
      注:このプロトコルは、接着細胞培養の使用用に設計されています。ただし、浮遊細胞培養で機能するように簡単に適応させることができます。
   5. 血球計算盤で細胞を数え、細胞懸濁液の細胞濃度を計算します。
   6. 決定された量の細胞懸濁液を培地に懸濁し、マルチウェルディッシュに移します。播種密度の基準値として、5 – 20 x 10⁵ セル/ cm²を検討してください。
      注:適切な細胞数は、細胞の種類と細胞特性、つまり細胞倍加時間に応じて計算する必要があります。
2. 細胞を24時間インキュベートして、細胞接着を可能にします。
3. この期間の後、可溶性抽出物を培養プレートに投与する。
   1. 細胞培養培地を吸引する。
   2. 前述のように、濃度の順序に従って、生体材料の抽出物を各ウェルに追加します。新鮮な細胞培養培地をコントロールウェルに加えます。
   3. プレートを24時間以上インキュベートします。
      注:ネガティブコントロールは、培養液中に維持されている未処理の細胞に対応する各アッセイで実行する必要があります。インキュベーション時間は、研究目標に応じて選択できます。

4.代謝活性の評価

1. 生体材料の抽出物との細胞インキュベーションの後、プレートから培地を吸引し、各ウェルPBSを洗浄します。
2. PBS、pH 7.4で調製した0.5 mg/mL 3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾールブロミド(MTT)を各ウェルに入れます。
3. プレートを4時間または37°Cの暗所で一晩インキュベートする。
4. 得られたホルマザン結晶を可溶化するために、イソプロパノール中の塩酸の0.04M溶液の適量を各ウェルに加え、プレートを30分間撹拌する。
   注:ウェルのサイズに応じて、MTTとイソプロパノールの量を調整してください。
5. 必要に応じて、結晶が見られなくなるまで上下にピペッティングして、各ウェルの内容物を攪拌および均質化します。
6. 分光光度計で、620 nmのリファレンスフィルターを使用して波長570 nmの吸光度を定量します。
7. 代謝活性を計算するには、処理した細胞の吸光度を対照培養物の吸光度で割ります。パーセンテージ値を取得するには、100を掛けます。

5. 細胞死評価

注:この評価を実行するには、条件ごとに最低10個の⁶ セルを使用する必要があります。

1. 評価される条件に応じて、適切に識別された遠心チューブを使用してください。
2. 生体材料の抽出物との細胞インキュベーションの後、培養液をそれぞれのチューブに集めます。
3. 細胞を剥離し、細胞懸濁液をそれぞれのチューブに加えます。
4. 細胞懸濁液を120 x g で5分間遠心分離して濃縮します。
5. ペレットをPBSで洗浄します。1,000 x g で5分間遠心分離することにより、PBSを除去します。
6. 1 mLのPBSを添加し、細胞ペレットを同定したサイトメトリーチューブに移します。
7. 1,000 x g で5分間遠心分離することにより、PBSを除去します。
8. 100 μLの結合バッファー(0.01 M HEPES、0.14 mM NaCl、0.25 mM CaCl₂)16でインキュベートし、細胞膜を回収するために細胞を約¹⁵分間休止させます。
9. 蛍光標識されたアネキシンV2.5 μLとヨウ化プロピジウム1 μLを室温暗所で15分間加えます。
10. インキュベーション後、400 μLのPBSを添加し、サイトメーターで分析します。情報の分析と定量化には、適切なソフトウェアを使用してください。
11. 生細胞、アポトーシス、後期アポトーシス/壊死、および壊死の割合として結果を提示します。

6. 形態評価

1. マルチウェルプレート内に収まる滅菌ガラスカバーガラスの適切なサイズを選択してください。
2. 滅菌ピンセットを使用して各スライドをウェルに入れます。
3. 細胞懸濁液を適切な濃度でウェルに分配し、95%の空気と5%のCO 2を含む加湿雰囲気下で37°Cのインキュベーターで一晩放置します_。
4. 前述のように、細胞培養物を抽出物にさらします。
5. メディアを吸引し、PBSで洗浄します。
6. カバーガラスを室温で乾燥させてから、カバーガラスを覆うのに十分な量のメイ・グリューンヴァルト溶液を加えます。3分間インキュベートします。
7. 染料を取り除き、蒸留水で1分間洗浄します。
8. 水を取り除き、カバーガラスを覆うのに十分な量のギムザ溶液を追加します。15分間インキュベートします。
9. カバーガラスを流水で洗います。
10. カバーガラスをスライドに転送します。
11. 顕微鏡で見てください。選択した倍率で写真を撮ります。

7. 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)による細胞機能評価

注: この評価を実行するには、条件ごとに最低 2x10^{6 セル} を使用する必要があります。一例として、アルカリホスファターゼは、歯芽細胞活性評価のための関心のある遺伝子として提示される。関心のある他の遺伝子を 表1に見ることができる。

1. 上記のように細胞をプレートします。
   注:播種する細胞の濃度は、研究対象の生体材料の細胞タイプと細胞毒性に応じて調整する必要がある場合があります。
2. 上記のように、可溶性抽出物と一緒にインキュベートします。
3. 細胞を剥離し、前述のように懸濁液を得る。
4. 細胞をPBSで2回洗浄する。この遠心分離機では、室温で5分間200 x gで。
5. ペレットを1 mLのRNA精製溶液(NZYolなど)に懸濁し、激しく攪拌し、連続したピペッティングを行うことにより、細胞を溶解します。
6. サンプルを室温で5分間インキュベートします。
7. 200 μLのクロロホルムを加え、チューブを手で15秒間振とうします。
8. 室温で3分間インキュベートします。
9. 遠心分離機は、4°Cで12,000 x gで15分間溶解します。この遠心分離中、2つの相がサンプルに由来し、RNAは水性(上)相に残ります。
10. 水相を新しいチューブに移し、500 μLの冷イソプロパノールを加えてRNAを沈殿させます。
11. サンプルを室温で10分間インキュベートし、12,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
12. 上清を除去し、7,500 x g で4°Cで5分間遠心分離することにより、ペレットを1 mLの75%エタノールで洗浄します。
13. エタノールが蒸発するまでペレットを室温で乾燥させる。
14. RNaseフリーの水に懸濁します。
15. 波長260 nmおよび280 nmで、吸収分光光度法を使用してサンプルの純度を定量および決定します。RNAの純度を決定し、純度比(A260/280)が約2.0のサンプルを使用します。
16. サンプルは-80°Cで保存してください。
17. 製造元のプロトコル¹⁷に従ってRT-PCRの実行に進みます。
    注:研究の目標に応じて、評価する特定のマーカーを選択します。

8. タンパク質同定による細胞機能評価

注:研究目標に応じて、評価する特定のタンパク質を選択します。一例として、象牙質シアロタンパク質(DSP)は、歯芽細胞活性評価のための関心のあるタンパク質として提示される。関心のある他のタンパク質は 、表1に見ることができます。

1. カバーガラスで細胞を培養し、前述のように抽出物にさらします。
2. 細胞培養物をPBSで洗浄する。
3. 室温で30分間3.7%パラホルムアルデヒドで固定します。
4. PBSで2回洗ってください。
5. PBS中の0.5%トリトンで15分間透過処理します。
6. ペルオキシダーゼをPBS中の0.3%過酸化水素で5分間ブロックします。
7. PBSで2回洗ってください。
8. 0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)で2回洗浄します。
9. 細胞培養を2%BSAで45分間ブロックします。
10. PBS中の0.5%BSAで洗浄します。
11. 選択したタンパク質に応じた一次抗体で培養物を室温で60分間インキュベートします。
    注:このプロトコルは、一次抗体DSP(M20)抗体(1:100)と二次抗体ポリクローナルウサギ抗ヤギ免疫グロブリン/ HRP(1:100)を使用します。
12. PBS中の0.5%BSAで5回洗浄します。
13. 二次抗体とともに室温で90分間インキュベートします。
    注:PBS中の0.5%BSAを使用して抗体希釈を行います。
14. PBS中の0.5%BSAで各洗浄で1分間5回洗浄します。
15. 基質と色原体混合物を20 μLのクロモゲン/mL基質の濃度で25分間インキュベートします。
16. PBS中の0.5%BSAで2回洗浄する。
17. ヘマトキシリンで15分間対比染色する。
18. 0.037 mol/Lのアンモニアと蒸留水のシーケンスで5分間洗浄し、余分な染料を除去します。
19. スライドにカバーガラスを取り付けます。封入剤としてグリセロールを使用してください。
20. 一晩乾燥させます。
21. 顕微鏡で見てください。選択した倍率で写真を撮ります。

9.アリザリンレッドSアッセイによる石灰化評価

1. アリザリンレッドS溶液を40mMの濃度で調製^する18。ホモジナイズ用の溶液を暗所で12時間攪拌します。
   注:アリザリンレッドS溶液100 mLを調製するには、1.44 gのアリザリン粉末(分子量:360 g / mol)を光から保護された超純水に可溶化します。このソリューションでは、pH値が重要であり、4.1〜4.3である必要があります。
2. 上記のように、可溶性抽出物を用いて細胞培養物をインキュベートする。
3. 細胞培養物をPBSで3回洗浄します。
4. 室温で15分間4%パラホルムアルデヒドで固定します。
5. PBSで3回洗ってください。
6. アリザリンレッド染色液で37°C暗所で20分間染色します。
7. 染色後、プレートをPBSで洗浄して余分な染料を除去します。
8. 顕微鏡で見てください。選択した倍率で写真を撮ります。
9. 10%(w/v)酢酸と20%(w/v)メタノールからなる抽出溶液を各ウェルに加え、室温で40分間攪拌します。
10. 分光光度計¹⁹で波長490nmの吸光度を測定する。

ここでの代表的な結果は、歯科用生体材料の研究に関するものです。抽出物の方法論により、代謝活性(図2)、細胞生存率、細胞死プロファイルと細胞形態(図3)、および特定のタンパク質発現(図4)への影響に関して、歯科材料に曝露した後の細胞毒性プロファイルと細胞機能を得ることができます。

MTTア?...

このプロトコルは、組織と接触する生体材料のin vitro細胞毒性の評価を指すISO 10993-5を考慮して設計され、生体適合性を評価し、研究の再現性に貢献する²¹。これは科学における懸念の高まりであり、多くの著者は、in vitro研究の実験デザインですでにこれらの推奨事項に従っています¹⁵、22、²³、^24、25、

著者には、競合する金銭的利益やその他の利益相反はありません。

GAI 2013 (コインブラ大学医学部);CIBBは、戦略プロジェクトUIDB/04539/2020およびUIDP/04539/2020(CIBB)を通じて、FCT(科学技術財団)を介して国家基金によって資金提供されています。細胞株MDPC-23を提供してくれたミシガン大学デンタルスクールのJacques Nörに感謝します。