Accès à la cytotoxicité et à la réponse cellulaire aux biomatériaux

Cette méthodologie vise à évaluer la cytotoxicité des biomatériaux par la préparation d’extraits solubles, en utilisant des essais de viabilité et des analyses phénotypiques, y compris la cytométrie en flux, la RT-PCR, l’immunocytochimie et d’autres techniques de biologie cellulaire et moléculaire.

Les biomatériaux entrent en contact direct ou indirect avec les tissus humains, d’où l’importance d’évaluer leur cytotoxicité. Cette évaluation peut être réalisée par plusieurs méthodes, mais il existe un écart important entre les approches utilisées, ce qui compromet la reproductibilité et la comparaison entre les résultats obtenus. Dans cet article, nous proposons un protocole pour évaluer la cytotoxicité des biomatériaux à l’aide d’extraits solubles, que nous utilisons pour les biomatériaux dentaires. La préparation des extraits est détaillée, de la production des granulés à leur extraction dans un milieu de culture. L’évaluation de la cytotoxicité des biomatériaux est basée sur l’activité métabolique à l’aide du test MTT, la viabilité cellulaire à l’aide du test de sulforhodamine B (SBR), le profil de mort cellulaire par cytométrie en flux et la morphologie cellulaire à l’aide de May-Grünwald Giemsa. En plus de l’évaluation de la cytotoxicité, un protocole d’évaluation de la fonction cellulaire est décrit en fonction de l’expression de marqueurs spécifiques évalués par immunocytochimie et PCR. Ce protocole fournit un guide complet pour l’évaluation de la cytotoxicité des biomatériaux et des effets cellulaires, en utilisant la méthodologie des extraits, de manière reproductible et robuste.

La biocompatibilité peut être définie comme la capacité d’un matériau à intégrer les tissus et à induire une réponse thérapeutique favorable, exempte de dommages locaux et systémiques ^1,2,3. L’évaluation de la biocompatibilité est cruciale pour le développement de tout matériau destiné à un usage médical. Par conséquent, ce protocole fournit une approche systématique et complète pour chaque chercheur visant à développer de nouveaux biomatériaux ou à étudier de nouvelles applications pour les biomatériaux existants.

Les tests de cytotoxicité in vitro sont largement utilisés comme première phase pour l’évaluation de la biocompatibilité, en utilisant des cultures cellulaires primaires ou des lignées cellulaires. Les résultats constituent un premier indicateur d’application clinique potentielle. En plus d’être essentiels pour le développement de biomatériaux, ces tests sont obligatoires pour se conformer aux réglementations en vigueur pour l’introduction sur le marché, des régulateurs de l’UE et de l’UE (certification FDA et CE)4,5,6,7,8. En outre, les tests standardisés dans la recherche biomédicale offrent un avantage significatif en termes de reproductibilité et de comparaison des résultats de différentes études sur des biomatériaux ou des dispositifs similaires⁹.

Les lignes directrices de l’Organisation internationale de normalisation (ISO) sont largement utilisées par de nombreux laboratoires commerciaux, réglementaires et universitaires indépendants pour tester les matériaux de manière précise et reproductible. L’ISO 10993-5 fait référence à l’évaluation de la cytotoxicité in vitro et l’ISO 10993-12 rend compte de la préparation de l’échantillonnage^10,11. Pour les essais de biomatériaux, trois catégories sont fournies, à sélectionner en fonction du type de matériau, des tissus en contact et de l’objectif du traitement : extraits, contact direct et contact indirect 8,11,12,13. Les extraits sont obtenus en enrichissant un milieu de culture cellulaire avec le biomatériau. Pour les tests par contact direct, le biomatériau est placé directement sur les cultures cellulaires et, en contact indirect, l’incubation avec les cellules est réalisée séparées par une barrière, telle qu’un gel d’agarose¹¹. Des contrôles appropriés sont obligatoires et au moins trois expériences indépendantes doivent être effectuées 5,8,10,11,14.

Il est essentiel de simuler ou d’exagérer les conditions cliniques pour déterminer le potentiel cytotoxique. Dans le cas de l’essai d’extraits, la surface du matériau;  le volume moyen; le milieu et le pH du matériau; la solubilité, l’osmolarité et le rapport de diffusion des matériaux; et les conditions d’extraction telles que l’agitation, la température et le temps influencent les milieux^{enrichisseurs 5}.

La méthodologie permet l’évaluation quantitative et qualitative de la cytotoxicité de plusieurs formulations pharmaceutiques, solides et liquides. Plusieurs tests peuvent être effectués, tels que le test d’absorption du rouge neutre, le test de formation de colonies, le test MTT et le test XTT 5,10,14.

La plupart des études d’évaluation de la cytotoxicité publiées utilisent des tests plus simples, à savoir MTT et XTT, qui fournissent des informations limitées. L’évaluation de la biocompatibilité ne devrait pas seulement impliquer l’évaluation de la cytotoxicité, mais aussi la bioactivité d’une substance d’essai donnée², comme le confirme ce protocole. Des critères d’évaluation supplémentaires devraient être utilisés lorsque cela est justifié et documenté. Ainsi, ce protocole vise à fournir un guide complet, détaillant un ensemble de méthodes pour l’évaluation de la cytotoxicité des biomatériaux. En outre, l’évaluation de différents processus cellulaires, à savoir le type de mort cellulaire, la morphologie cellulaire, la fonction cellulaire dans la synthèse de protéines spécifiques et la production tissulaire spécifique, sont décrites.

1. Préparation des granulés

1. Préparer les moules en polychlorure de vinyle (PVC) en effectuant des trous de forme circulaire de dimensions connues dans des plaques de PVC.
   REMARQUE: Les moulures en PVC peuvent être faites de différentes tailles. Calculez la surface de contact des moules en PVC, en utilisant la formule A = h(2πr) + 2πr² (r: rayon du cylindre; h: hauteur du cylindre).
2. Préparer le biomatériau à tester selon les instructions du fabricant et le plus près possible du début de l’expérience.
   NOTE: Pour la préparation de biomatériaux de formulation pâte/pâte, une quantité adéquate de pâte de base et de catalyseur est mélangée manuellement avec une spatule de mélange. Pour les autres matériaux à base de formulations liquides et en poudre, une spatulation manuelle ou un mélange mécanique avec vibration doit être effectué, en suivant les instructions du fabricant ou le nécessaire pour les nouveaux matériaux. Pour les matériaux liquides, cette étape n’est pas nécessaire. Démarrez le protocole à l’étape 2.
3. Placez le biomatériau sur les moules avec une spatule et laissez-les prendre pendant le moment approprié.
   NOTA : Le temps de prise et les conditions de prise des biomatériaux doivent suivre les instructions du fabricant ou les instructions adéquates pour les nouveaux matériaux.
4. Après le prise, retirez les granulés du biomatériau des moules en PVC et placez-les dans un récipient (une plaque à 6 puits ou une boîte de Petri peut être utilisée).
5. Stérilisez les granulés en les plaçant sous une lampe à lumière ultraviolette (UV) pendant 20 minutes de chaque côté.

2. Obtention des extraits des biomatériaux

REMARQUE: Toutes les procédures doivent être effectuées dans des conditions stériles strictes.

1. Déterminer le nombre nécessaire de granulés en calculant la surface des granulés selon la formule décrite au point 1.1.
   NOTE: Comme valeur de référence, la surface de contact de 250 mm²/mL^11,15 est obtenue en ajoutant 9 pastilles (r 3 mm x h ^1,5 mm) par mL du milieu.
2. Préparer les extraits solubles (extrait enrichi en biomatériau).
   1. Placer les pastilles dans un tube de 50 mL et ajouter le correspondant du milieu de culture cellulaire. Placez les tubes pendant 24 heures dans l’incubateur à 37°, en rotation constante.
      REMARQUE: Utilisez le milieu de culture cellulaire approprié pour les cultures cellulaires.
   2. Après 24 heures, retirez les tubes de l’incubateur. A ce stade, les extraits correspondent à une concentration de 1/1 ou 100%.
   3. Procéder à des dilutions de l’extrait par addition séquentielle de volumes égaux de milieu conditionné à milieu de culture cellulaire.
      REMARQUE: Aucun ajustement du pH ne doit être effectué sur le milieu.
      1. Ajouter 1 mL de milieu de culture à 1 mL d’extrait à 100% pour obtenir un extrait à 50%. Ajouter 1 mL de milieu de culture à 1 mL d’extrait à 50 % pour obtenir un extrait à 25 %, et ainsi de suite (Figure 1).
         NOTE: Utilisez les concentrations jugées pertinentes pour chaque composé.

Figure 1 : Schéma de préparation et de dilution des extraits solubles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Incubation cellulaire avec les extraits des biomatériaux

1. Préparez une suspension cellulaire et placez-la dans un récipient cellulaire adéquat, tel qu’une plaque multipuits, en fonction du nombre de cellules nécessaires aux expériences.
   1. Commencez par une fiole des cellules désirées avec 80% à 90% de confluence.
   2. Jeter les milieux de culture cellulaire, laver avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et détacher les cellules avec de la trypsine-EDTA (1 à 2 mL pour un ballon de culture cellulaire de 75 cm² ).
   3. Ajouter le milieu de culture cellulaire (2 à 4 mL pour un ballon de culture cellulaire de 75 cm² ), transférer la suspension cellulaire dans un tube et centrifuger à 200 x g pendant 5 min.
   4. Suspendre la pastille dans un volume connu de milieu de culture cellulaire.
      NOTE: Ce protocole est conçu pour l’utilisation de cultures cellulaires adhérentes; Cependant, des adaptations simples peuvent être faites pour travailler avec des cultures de cellules en suspension.
   5. Comptez les cellules dans l’hémocytomètre et calculez la concentration cellulaire de la suspension cellulaire.
   6. Suspendre la quantité déterminée de suspension cellulaire dans le milieu de culture et transférer dans des boîtes multipuits. Comme valeur de référence pour la densité de semis, considérons 5 – 20 x 10⁵ cellules/cm².
      NOTE: Le nombre approprié de cellules doit être calculé en fonction du type de cellule et de ses caractéristiques, à savoir le temps de doublement de la cellule.
2. Incuber les cellules pendant 24 heures pour permettre l’adhésion cellulaire.
3. Après cette période, administrer les extraits solubles dans les plaques de culture.
   1. Aspirer le milieu de culture cellulaire.
   2. Ajouter les extraits de biomatériaux à chaque puits, selon la séquence des concentrations, comme décrit précédemment. Ajouter le milieu de culture de cellules fraîches aux puits témoins.
   3. Incuber les plaques pendant 24 h ou plus.
      NOTE: Des contrôles négatifs doivent être effectués dans chaque essai, correspondant à des cellules non traitées, maintenues dans le milieu de culture. Les temps d’incubation peuvent être sélectionnés en fonction des objectifs de l’étude.

4. Évaluation de l’activité métabolique

1. Après l’incubation cellulaire avec les extraits des biomatériaux, aspirer le milieu des plaques et laver chaque puits PBS.
2. Placer dans chaque puits le volume adéquat de bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazole (MTT) de 0,5 mg/mL préparé dans du PBS, pH 7,4.
3. Incuber les plaques pendant 4 h ou toute la nuit dans l’obscurité à 37°C.
4. Pour solubiliser les cristaux de formazan obtenus, ajouter le volume adéquat de solution 0,04 M d’acide chlorhydrique dans de l’isopropanol à chaque puits et agiter les plaques pendant 30 minutes.
   REMARQUE: Ajustez la quantité de MTT et d’isopropanol en fonction de la taille des puits.
5. Remuer et homogénéiser le contenu de chaque puits, si nécessaire, en pipetant de haut en bas jusqu’à ce qu’aucun cristal ne soit vu.
6. Quantifier l’absorbance à une longueur d’onde de 570 nm avec un filtre de référence de 620 nm, dans le spectrophotomètre.
7. Pour calculer l’activité métabolique, divisez l’absorbance des cellules traitées par l’absorbance des cultures témoins. Pour obtenir des valeurs en pourcentage, multipliez par 100.

5. Évaluation de la mort cellulaire

REMARQUE: Pour effectuer cette évaluation, un minimum de 10⁶ cellules par condition doit être utilisé.

1. Utiliser des tubes à centrifuger correctement identifiés, en fonction des conditions évaluées.
2. Après l’incubation cellulaire avec les extraits des biomatériaux, recueillir les milieux de culture dans le tube respectif.
3. Détachez les cellules et ajoutez la suspension cellulaire aux tubes respectifs.
4. Concentrer les suspensions cellulaires par centrifugation à 120 x g pendant 5 minutes.
5. Lavez les granulés avec du PBS. Retirer le PBS par centrifugation à 1 000 x g pendant 5 minutes.
6. Ajouter 1 mL de PBS et transférer les pastilles cellulaires dans des tubes de cytométrie identifiés.
7. Retirer le PBS par centrifugation à 1 000 x g pendant 5 minutes.
8. Incuber avec 100 μL de tampon de liaison (0,01 M HEPES, 0,14 mM NaCl et 0,25 mM CaCl₂)16, et laisser les cellules reposer pendant environ ¹⁵ minutes pour la récupération de la membrane cellulaire.
9. Ajouter 2,5 μL d’annexine-V marquée par fluorescence et 1 μL d’iodure de propidium pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité.
10. Après l’incubation, ajouter 400 μL de PBS et analyser sur le cytomètre. Pour l’analyse et la quantification de l’information, utilisez un logiciel approprié.
11. Présenter les résultats en pourcentage de cellules vivantes, d’apoptose, d’apoptose tardive/nécrose et de nécrose.

6. Évaluation morphologique

1. Sélectionnez la taille appropriée des lamelles de couvercle en verre stérilisé qui s’insèrent à l’intérieur de la plaque multipuits.
2. Placez chaque lame dans un puits à l’aide d’une pince à épiler stérile.
3. Distribuer une suspension cellulaire à une concentration adéquate dans les puits et laisser reposer toute la nuit dans un incubateur à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 95% d’air et 5% de CO_2.
4. Exposer les cultures cellulaires aux extraits, comme décrit précédemment.
5. Aspirez les médias et lavez-les avec PBS.
6. Laisser sécher les lamelles de couverture à température ambiante, puis ajouter un volume suffisant de solution May-Grünwald pour couvrir les lamelles de couverture; Incuber pendant 3 minutes.
7. Retirer le colorant et laver à l’eau distillée pendant 1 minute.
8. Retirer l’eau et ajouter un volume suffisant de solution Giemsa pour couvrir les lamelles de couverture; Incuber pendant 15 minutes.
9. Lavez les lamelles à l’eau courante.
10. Transférer les bordereaux de couverture sur une glissière.
11. Regardez sous un microscope. Prenez les photos avec le grossissement choisi.

7. Évaluation de la fonction cellulaire par amplification en chaîne de la polymérase à transcription inverse (RT-PCR)

REMARQUE: Pour effectuer cette évaluation, un minimum de 2x10⁶ cellules par condition doit être utilisé. À titre d’exemple, la phosphatase alcaline est présentée comme un gène d’intérêt pour l’évaluation de l’activité des odontoblastes. D’autres gènes d’intérêt peuvent être vus dans le tableau 1.

1. Plaquez les cellules comme décrit ci-dessus.
   NOTE: La concentration des cellules plaquées peut devoir être ajustée en fonction du type de cellule et de la cytotoxicité des biomatériaux étudiés.
2. Incuber avec des extraits solubles, comme décrit ci-dessus.
3. Détacher les cellules pour obtenir une suspension comme décrit précédemment.
4. Lavez les cellules deux fois avec du PBS; pour cette centrifugeuse à 200 x g pendant 5 minutes à température ambiante.
5. Lyser les cellules en suspendant la pastille dans 1 mL de solution de purification de l’ARN (p. ex. NZYol), en agitant intensément et en pipetage successif.
6. Incuber les échantillons pendant 5 minutes à température ambiante.
7. Ajouter 200 μL de chloroforme et agiter les tubes à la main pendant 15 secondes.
8. Incuber pendant 3 minutes à température ambiante.
9. Lysats centrifugés à 4°C pendant 15 min à 12 000 x g. Au cours de cette centrifugation, deux phases proviennent de l’échantillon, laissant l’ARN dans la phase aqueuse (supérieure).
10. Retirer la phase aqueuse dans un nouveau tube et ajouter 500 μL d’isopropanol froid pour précipiter l’ARN.
11. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 minutes et centrifuger à 12 000 x g pendant 10 minutes à 4°C.
12. Retirer le surnageant et laver la pastille avec 1 mL d’éthanol à 75% par centrifugation à 7 500 x g pendant 5 minutes à 4°C.
13. Sécher la pastille à température ambiante jusqu’à évaporation de l’éthanol.
14. Suspendre dans de l’eau sans RNase.
15. Quantifier et déterminer le degré de pureté des échantillons par spectrophotométrie d’absorption, aux longueurs d’onde 260 nm et 280 nm. Déterminer la pureté de l’ARN et utiliser des échantillons avec un rapport de pureté (A260/280) autour de 2,0.
16. Conserver les échantillons à -80°C.
17. Procédez à l’exécution de la RT-PCR en suivant le protocole^{du fabricant 17}.
    REMARQUE : En fonction de l’objectif de l’étude, sélectionnez les marqueurs spécifiques à évaluer.

8. Évaluation de la fonction cellulaire par identification des protéines

NOTE: Selon l’objectif de l’étude, sélectionnez les protéines spécifiques à évaluer. À titre d’exemple, la dentine sialoprotéine (DSP) est présentée comme une protéine d’intérêt pour l’évaluation de l’activité des odontoblastes. D’autres protéines d’intérêt peuvent être vues dans le tableau 1.

1. Cultivez les cellules dans des lamelles de couverture et exposez-les aux extraits, comme décrit précédemment.
2. Lavez les cultures cellulaires avec du PBS.
3. Fixer avec 3,7% de paraformaldéhyde pendant 30 minutes à température ambiante.
4. Lavez deux fois avec du PBS.
5. Perméabiliser avec 0,5% de Triton dans PBS pendant 15 minutes.
6. Bloquer la peroxydase avec 0,3% de peroxyde d’hydrogène dans du PBS pendant 5 minutes.
7. Lavez deux fois avec du PBS.
8. Laver deux fois avec de l’albumine sérique bovine (BSA) à 0,5 %.
9. Bloquer les cultures cellulaires avec 2% de BSA pendant 45 minutes.
10. Laver avec 0,5% de BSA dans du PBS.
11. Incuber les cultures avec l’anticorps primaire selon la protéine sélectionnée pendant 60 minutes à température ambiante.
    REMARQUE: Ce protocole utilise l’anticorps primaire DSP(M20) Antibody (1:100) et l’anticorps secondaire Polyclonal Rabbit Anti-chèvre immunoglobulines / HRP (1:100).
12. Laver cinq fois avec 0,5% de BSA dans PBS.
13. Incuber avec un anticorps secondaire pendant 90 minutes à température ambiante.
    REMARQUE: Faire les dilutions d’anticorps en utilisant 0,5% BSA dans PBS.
14. Laver cinq fois avec 0,5% de BSA dans du PBS pendant 1 minute à chaque lavage.
15. Incuber des cultures avec un mélange de substrat et de chromogènes à une concentration de 20 μL de substrat chromogène / mL pendant 25 minutes.
16. Laver deux fois avec 0,5% de BSA dans du PBS.
17. Contre-colorer avec de l’hématoxyline pendant 15 minutes.
18. Laver avec une séquence de 0,037 mol/L d’ammoniac et de l’eau distillée pendant 5 minutes pour éliminer l’excès de colorant.
19. Montez les lamelles de couverture sur les glissières. Utilisez du glycérol comme support de montage.
20. Laisser sécher pendant la nuit.
21. Regardez sous un microscope. Prenez les photos avec le grossissement choisi.

9. Évaluation de la minéralisation par le dosage Alizarin Red S

1. Préparer une solution de rouge d’alizarine S à une concentration de 40 mM¹⁸. Remuer la solution pour l’homogénéisation pendant 12 heures dans l’obscurité.
   NOTE: Pour préparer 100 mL de solution d’Alizarin Red S, solubiliser 1,44 g de poudre d’alizarine (poids moléculaire: 360 g / mol) dans de l’eau ultrapure, à l’abri de la lumière. Pour cette solution, la valeur du pH est critique et doit être comprise entre 4,1 et 4,3.
2. Incuber la culture cellulaire avec des extraits solubles, comme décrit ci-dessus.
3. Lavez les cultures cellulaires trois fois avec du PBS.
4. Fixer avec 4% de paraformaldéhyde pendant 15 minutes à température ambiante.
5. Lavez trois fois avec du PBS.
6. Colorer avec la solution de coloration rouge Alizarin pendant 20 minutes à 37 °C dans l’obscurité.
7. Après la coloration, lavez les plaques avec du PBS pour enlever l’excès de colorant.
8. Regardez sous un microscope. Prenez les photos avec le grossissement choisi.
9. Ajouter une solution d’extraction, composée de 10 % (p/v) d’acide acétique et de 20 % (p/v) de méthanol, à chaque puits, et laisser agiter pendant 40 minutes à température ambiante.
10. Mesurer l’absorbance à une longueur d’onde de 490 nm sur un spectrophotomètre¹⁹.

Les résultats représentatifs se réfèrent ici à l’étude des biomatériaux dentaires. La méthodologie de l’extrait permet d’obtenir un profil de cytotoxicité et de fonction cellulaire après exposition au matériel dentaire, en ce qui concerne les effets sur l’activité métabolique (Figure 2), la viabilité cellulaire, le profil de mort cellulaire et la morphologie cellulaire (Figure 3), et l’expression de protéines spécifiques (Figure 4).

Ce protocole a été conçu en tenant compte de la norme ISO 10993-5, qui fait référence à l’évaluation de la cytotoxicité in vitro des biomatériaux en contact avec les tissus, afin d’évaluer la biocompatibilité et de contribuer aux études de reproductibilité²¹. C’est une préoccupation croissante en science, et de nombreux auteurs suivent déjà ces recommandations dans la conception expérimentale de leurs études in vitro 15,22,23,24,25,26,27,28....

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents ou d’autres conflits d’intérêts.

Nous remercions les personnes suivantes pour leur soutien: GAI 2013 (Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra); Le CIBB est financé par des fonds nationaux via FCT (Foundation for Science and Technology) à travers les projets stratégiques UIDB/04539/2020 et UIDP/04539/2020 (CIBB). Nous remercions Jacques Nör, de la faculté dentaire de l’Université du Michigan, d’avoir fourni la lignée cellulaire MDPC-23.