Questo protocollo è fondamentale per generare ceppi che possono essere utilizzati in saggi di screening ad alto rendimento per valutare il potenziale e l'attività tradizionale delle molecole A dimostrare la procedura saranno Juana Quintero e Laura Pineda, assistenti di ricerca del mio laboratorio. Per iniziare, amplificare il gene bersaglio utilizzando una polimerasi ad alta fedeltà per preservare la sequenza codificante. Aggiungere i primer alla miscela di reazione in una concentrazione finale di 0,2 micromolari ed eseguire un protocollo di ciclo PCR come descritto nel manoscritto.
Purificare il frammento di PCR amplificato utilizzando un kit di purificazione del prodotto PCR convenzionale. Per tagliare le estremità del prodotto eGFP PCR, impostare una reazione con l'enzima Kpn I secondo le istruzioni del produttore e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi aggiungere 100 millimolari di cloruro di sodio e 10 unità di Bgl II alla reazione e incubare per 15 minuti.
Dopo la digestione, purificare la reazione come mostrato in precedenza. Successivamente, digerire il vettore di espressione di pLEXSY con Bgl II e Kpl I seguendo la digestione sequenziale come dimostrato in precedenza. Ligare 100 nanogrammi di vettore pLEXSY digerito e 28 nanogrammi di eGFP digerito in una reazione da 20 microlitri contenente tampone ligasi e tre unità di T4 DNA ligasi.
Incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, trasformare cellule competenti di Escherichia coli con il prodotto di legatura utilizzando protocolli di trasformazione standard. Placcare le cellule trasformate in agar ampicillina LB e incubare per 24 ore a 30 gradi Celsius per selezionare cloni ricombinanti.
Dopo lo screening delle colonie, purificare il DNA plasmidico da un clone positivo per la successiva trasfezione utilizzando un kit di isolamento plasmidico commerciale. Per produrre frammenti linearizzati del plasmide, prendere almeno 10 microgrammi del plasmide purificato pLEXSY eGFP e digerirlo con SWA1 per tre o quattro ore a 25 gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, il calore inattiva il prodotto di digestione a 65 gradi Celsius per 20 minuti.
Quindi eseguire il prodotto digestivo nell'elettroforesi su gel di agarosio per separare i frammenti risultanti. Purificare la cassetta di espressione utilizzando un kit di estrazione del gel di agarosio commerciale secondo le istruzioni del produttore. Coltiva le colture di parassiti fino a quando non ci sono abbastanza propagherati in fase logaritmica o propagandisti in fase stazionaria precoce.
Se necessario, raggruppa il contenuto di più borracce di coltura. Centrifugare la coltura parassitaria a 2.000 G per tre minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in tampone di elettroporazione a quattro gradi Celsius per ottenere una concentrazione di una volta 10 all'ottavo parassita per millilitro e tenerlo in ghiaccio per 10 minuti.
Contemporaneamente, tubi pre-chill con 2-10 microgrammi di pLEXSY linearizzato eGFP costruiscono in 50 microlitri di acqua o tampone tris da 10 millimolari con pH 8,0 e cuvette di elettroporazione di due millimetri di diametro. Quindi, aggiungere 350 microlitri di parassiti pre-raffreddati al tubo con il plasmide linearizzato e trasferire l'intero 400 microlitri alla cuvetta di elettroporazione sul ghiaccio. Elettroporare le cellule del parassita con plasmide e, in parallelo, cellule parassitarie senza DNA plasmidico come controllo negativo.
Mettere la cuvetta sul ghiaccio per 10 minuti. Trasferire i parassiti elettroporati a cinque millilitri del terreno di coltura appropriato e incubare a 26 gradi Celsius per 20 ore. Circa 20 ore dopo l'elettroporazione, osservare le colture al microscopio e aggiungere l'antibiotico selettivo appropriato a seconda del plasmide pLEXSY utilizzato.
Seguire le colture microscopicamente fino a quando non c'è una chiara differenza tra parassiti elettroporati con e senza DNA plasmide. Per verificare la fluorescenza del parassita attraverso la citometria a flusso, centrifugare un millilitro della coltura in fase stazionaria a 2.000 G per tre minuti a temperatura ambiente. Dopo aver lavato le celle due volte in PBS, risospendere il pellet finale in un millilitro di PBS.
Esegui campioni e raccogli 20.000 eventi a una velocità di 0,5 microlitri al secondo. Impostare i valori di guadagno per i canali forward scatter, side scatter e fluorescenza one rispettivamente come 225,0, 200,0 e 520,0. Creare un gate G1 contenente la popolazione di parassiti.
Filtrare il canale FL1 attraverso quel gate per determinare l'autofluorescenza dei promastigoti e impostare un range gate G2 per il canale FL1. Eseguire i parassiti trasfettati per verificare se c'è fluorescenza. Registrare la percentuale di parassiti in G1 che sono fluorescenti e la media dell'intensità di fluorescenza in G2. Purificare il DNA genomico da due a cinque millilitri di una coltura parassitaria in fase stazionaria mediante estrazione convenzionale di cloroformio fenolico o con un kit commerciale.
Eseguire la PCR diagnostica per pLEXSY-sat2.1 utilizzando un protocollo ciclico come descritto nel manoscritto. Dopo la conferma della fluorescenza attraverso la citometria a flusso, preparare una diluizione di parassiti ricombinanti ad una concentrazione di cinque promastigoti per millilitro. Aggiungere 100 microlitri di questa diluizione in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e lasciare la piastra indisturbata per almeno 12 ore.
Seguire la piastra al microscopio con un ingrandimento minimo di 100X fino a quando non vengono rilevati pozzetti con crescita parassitaria. Quando un pozzo è pieno di parassiti, utilizzare il contenuto per inoculare una coltura da cinque millilitri. Una volta che le colture seminate da clone raggiungono la fase stazionaria, verificare la fluorescenza utilizzando la citometria a flusso come descritto in precedenza.
Selezionare cloni con parassiti fluorescenti dal 98% al 99% e la più alta intensità media di fluorescenza per saggi in vitro e in vivo. La colony PCR delle cellule di E.coli trasformate con il costrutto pLEXSY eGFP ha generato un prodotto di 859 coppie di basi. La digestione totale del plasmide utilizzando SWA1 ha portato a due frammenti, un frammento di coppia di 2,9 kilobasi contenente tutti gli elementi necessari per la replicazione e la selezione in E.coli e un frammento di coppia di sette o otto kilobasi che rappresenta la cassetta di espressione linearizzata utilizzata per la trasfezione.
L'analisi della citometria a flusso ha rivelato che l'82% dei parassiti L.panamensis trasfettati esprimeva eGFP. Dopo la selezione policlonale, il 98,44% dei parassiti di L.donovani analizzati mediante citometria a flusso erano fluorescenti rispetto all'82,0% di L.panamensis. La riuscita integrazione di pLEXSY eGFP nel locus SSU ha portato a un prodotto da 2,3 kilobasi nella PCR diagnostica.
I cloni con la più alta percentuale di parassiti fluorescenti e intensità media di fluorescenza sono stati selezionati per un ulteriore utilizzo nei test di screening farmacologico. Questo metodo consente la produzione di parassiti Leishmania ricombinanti con il
