Bu protokol, moleküllerin potansiyelini ve geleneksel aktivitesini değerlendirmek için yüksek verimli tarama tahlillerinde kullanılabilecek suşlar üretmenin anahtarıdır Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan araştırma görevlileri Juana Quintero ve Laura Pineda olacaktır. Başlamak için, kodlama dizisini korumak için yüksek kaliteli bir polimeraz kullanarak hedef geni çoğaltın. Primerleri 0.2 mikromolar nihai konsantrasyonda reaksiyon karışımına ekleyin ve makalede açıklandığı gibi bir PCR döngü protokolü çalıştırın.
Konvansiyonel bir PCR ürün saflaştırma kiti kullanarak amplifiye edilmiş PCR fragmanını saflaştırın. eGFP PCR ürününün uçlarını kesmek için, üreticinin talimatlarına göre Kpn I enzimi ile bir reaksiyon kurun ve 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Daha sonra reaksiyona 100 milimolar sodyum klorür ve 10 birim Bgl II ekleyin ve 15 dakika inkübe edin.
Sindirimden sonra, reaksiyonu daha önce gösterildiği gibi arındırın. Ardından, daha önce gösterildiği gibi sıralı sindirimi takiben Bgl II ve Kpl I ile pLEXSY ekspresyon vektörünü sindirin. Ligaz tamponu ve üç birim T4 DNA ligaz içeren 20 mikrolitrelik bir reaksiyonda 100 nanogram sindirilmiş pLEXSY vektörü ve 28 nanogram sindirilmiş eGFP'yi bağlayın.
Gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, standart transformasyon protokollerini kullanarak yetkin Escherichia coli hücrelerini ligasyon ürünü ile dönüştürün. Dönüştürülmüş hücreleri LB ampisilin agarında kaplayın ve rekombinant klonları seçmek için 30 santigrat derecede 24 saat inkübe edin.
Kolonileri taradıktan sonra, ticari bir plazmit izolasyon kiti kullanarak sonraki transfeksiyon için plazmit DNA'yı pozitif bir klondan saflaştırın. Plazmidin doğrusallaştırılmış fragmanlarını üretmek için, saflaştırılmış pLEXSY eGFP plazmidinden en az 10 mikrogram alın ve 25 santigrat derecede üç ila dört saat boyunca SWA1 ile sindirin. İnkübasyonun sonunda, sindirim ürününü 20 dakika boyunca 65 santigrat derecede etkisiz hale getirin.
Ardından, elde edilen parçaları ayırmak için sindirim ürününü agaroz jel elektroforezinde çalıştırın. Ekspresyon kasetini, üreticinin talimatlarına göre ticari bir agaroz jel ekstraksiyon kiti kullanarak saflaştırın. Parazit kültürlerini, yeterli log fazı veya erken durağan faz promastigotları olana kadar büyütün.
Gerekirse birden fazla kültür şişesinin içeriğini bir havuzda toplayın. Parazit kültürünü oda sıcaklığında üç dakika boyunca 2.000 G'de santrifüjleyin. Mililitrede bir kez 10 ila sekizinci parazit konsantrasyonu elde etmek için peleti elektroporasyon tamponunda dört santigrat derecede yeniden süspanse edin ve 10 dakika buz üzerinde tutun.
Aynı zamanda, 2 ila 10 mikrogram doğrusallaştırılmış pLEXSY eGFP'ye sahip ön soğutma tüpleri, 50 mikrolitre su veya pH 8.0 ile 10 milimolar tris tamponu ve iki milimetre çapında elektroporasyon küvetleri oluşturur. Daha sonra, doğrusallaştırılmış plazmid ile tüpe 350 mikrolitre önceden soğutulmuş parazit ekleyin ve 400 mikrolitrenin tamamını buz üzerindeki elektroporasyon küvetine aktarın. Parazit hücrelerini plazmid ile ve paralel olarak plazmit DNA'sı olmayan parazit hücrelerini negatif kontrol olarak elektropoze edin.
Küveti 10 dakika buza koyun. Elektropore edilmiş parazitleri uygun kültür ortamının beş mililitresine aktarın ve 20 saat boyunca 26 santigrat derecede inkübe edin. Elektroporasyondan yaklaşık 20 saat sonra, kültürleri mikroskop altında gözlemleyin ve kullanılan pLEXSY plazmidine bağlı olarak uygun seçici antibiyotiği ekleyin.
Plazmid DNA'lı ve plazmidsiz elektroporasyonlu parazitler arasında net bir fark olana kadar kültürleri mikroskobik olarak takip edin. Parazit floresansını akış sitometrisi yoluyla doğrulamak için, sabit faz kültürünün bir mililitresini oda sıcaklığında üç dakika boyunca 2.000 G'de santrifüjleyin. Hücreleri PBS'de iki kez yıkadıktan sonra, son peleti bir mililitre PBS'de yeniden süspanse edin.
Örnekleri çalıştırın ve saniyede 0,5 mikrolitre hızında 20.000 olay toplayın. İleri saçılma, yan saçılma ve floresan bir kanal için kazanç değerlerini sırasıyla 225.0, 200.0 ve 520.0 olarak ayarlayın. Parazit popülasyonunu içeren bir G1 kapısı oluşturun.
Promastigotların otofloresansını belirlemek için FL1 kanalını bu geçitten filtreleyin ve FL1 kanalı için bir aralık kapısı G2 ayarlayın. Floresan olup olmadığını doğrulamak için transfekte edilmiş parazitleri çalıştırın. G1'deki floresan parazitlerin yüzdesini ve G2'deki floresan yoğunluğunun ortalamasını kaydedin. Genomik DNA'yı, geleneksel fenol kloroform ekstraksiyonu veya ticari bir kit ile iki ila beş mililitre sabit faz parazit kültüründen saflaştırın.
Makalede açıklandığı gibi bir döngü protokolü kullanarak pLEXSY-sat2.1 için tanısal PCR gerçekleştirin. Akış sitometrisi ile floresan onaylandıktan sonra, mililitre başına beş promastigot konsantrasyonunda rekombinant parazitlerin seyreltilmesini hazırlayın. 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna bu seyreltmenin 100 mikrolitresini ekleyin ve plakayı en az 12 saat boyunca rahatsız etmeyin.
Parazit büyümesi olan kuyucuklar tespit edilene kadar plakayı mikroskobik olarak minimum 100X büyütmede takip edin. Bir kuyu parazitlerle dolu olduğunda, içeriği beş mililitrelik bir kültürü aşılamak için kullanın. Klon tohumlu kültürler durağan faza ulaştığında, daha önce açıklandığı gibi akış sitometrisi kullanarak floresansı doğrulayın.
Floresan parazitlerin %98 ila %99'una ve in vitro ve in vivo deneyler için en yüksek ortalama floresan yoğunluğuna sahip klonları seçin. pLEXSY eGFP yapısı ile dönüştürülen E.coli hücrelerinin koloni PCR'si, bir 859 baz çifti ürünü üretti. Plazmidin SWA1 kullanılarak toplam sindirimi, E.coli'de replikasyon ve seçim için gerekli tüm elementleri içeren 2.9 kilobaz çifti fragmanı ve transfeksiyon için kullanılan doğrusallaştırılmış ekspresyon kasetini temsil eden yedi ila sekiz kilobaz çifti fragmanı olmak üzere iki fragmanla sonuçlandı.
Flow sitometri analizi, transfekte edilen L.panamensis parazitlerinin %82'sinin eGFP eksprese ettiğini ortaya koydu. Poliklonal seleksiyondan sonra, akış sitometrisi ile analiz edilen L.donovani parazitlerinin %98.44'ü floresan iken, L.panamensis'in %82.0'si floresan idi. pLEXSY eGFP'nin SSU lokusuna başarılı bir şekilde entegrasyonu, tanısal PCR'de 2.3 kilobaz çifti ürünü ile sonuçlandı.
En yüksek floresan parazit yüzdesine ve ortalama floresan yoğunluğuna sahip klonlar, ilaç tarama deneylerinde daha fazla kullanılmak üzere seçildi. Bu yöntem, rekombinant Leishmania parazitlerinin üretimine izin verir.
