Il significato del protocollo risiede nella sua convenienza nel breve tempo necessario per il suo completamento. Ciò consente un elevato rendimento, un'alta concentrazione e un alto grado di isolamento dei tricomi peduncolati e sessili. Il principale vantaggio di questa tecnica è la sua semplicità.
Durante questa tecnica, si dovrebbe considerare la densità del tricoma della fonte vegetale e ispezionare il grado di isolamento ad ogni passo tramite microscopio mentre si esegue il protocollo per la prima volta. A dimostrare questa tecnica sarà Nurit Shalev, esperta di cannabis del Volcani Center. Inizia schiacciando un blocco di ghiaccio secco in piccole scaglie sottili usando un martello e un oggetto duro e piatto in un contenitore di plastica da cinque litri.
Utilizzare un colino grande e setacciare i fiocchi di ghiaccio secco fine dal ghiaccio secco non frantumato in un altro contenitore di plastica da cinque litri. Versare circa 200 centimetri cubici di scaglie di ghiaccio secco in un becher di vetro verticale da un litro. Aggiungere fino a 10 grammi di infiorescenze di cannabis sativa congelate sul primo strato di ghiaccio secco tritato e coprirlo con un ulteriore strato di 200 centimetri cubici di ghiaccio secco finemente tritato.
Quindi coprire l'apertura del becher di vetro da un litro con due o tre strati di una zanzariera da uno schermo millimetrico e fissarla con elastici. Quindi, versare azoto liquido in un grande contenitore di acciaio inossidabile a fondo rotondo. Inserire una maglia di 350 micrometri in un setaccio di farina o in un colino per setaccio per coprire la rete del setaccio della farina dal basso.
Posizionare questo setaccio di farina sopra il grande contenitore in acciaio inossidabile a fondo tondo riempito di azoto liquido. Per ridurre al minimo la perdita della massa setacciata, assicurarsi che la larghezza del contenitore superi quella del setaccio della farina. Separare i tricomi dal materiale vegetale scuotendo il bicchiere da un litro con l'apertura rivolta verso il basso verso il setaccio della farina.
Mettere da parte il becher ogni due o tre minuti, consentendo la setacciatura del ghiaccio secco tritato e del materiale vegetale accumulato sul setaccio della farina. Setacciare orizzontalmente il setaccio della farina per facilitare il passaggio del materiale vegetale nell'azoto liquido nel contenitore in acciaio inox a fondo tondo posto sotto. Quindi, aggiungere azoto liquido al contenitore in acciaio inossidabile e il ghiaccio secco frantumato al becher di vetro da un litro quando i loro livelli si esauriscono.
Quando il materiale vegetale sul setaccio della farina è esaurito, riempire nuovamente il materiale vegetale usato nel becher di vetro con altri 10 grammi di materiale vegetale fresco e ripetere il processo di setacciatura fino alla raccolta di una quantità sufficiente di tricomi arricchiti nel contenitore. Verificare la presenza di una sostanza bianca simile alla polvere sul fondo del contenitore di acciaio inossidabile immersa in azoto liquido prima di un'osservazione al microscopio per confermare la raccolta di tricomi sufficienti. Aggiungere una piccola quantità di azoto liquido in un piccolo contenitore di acciaio inossidabile a fondo rotondo pulito.
Quindi piegare un microsetaccio di 40 per 40 centimetri con una dimensione di maglia di 150 micrometri due volte per ottenere una piega di 20 per 20 centimetri e aprirlo in una forma a forma di cono. Fissare il cono di rete al bordo del contenitore in acciaio inossidabile a fondo tondo con una o due mollette in modo che la parte aperta del cono sia in posizione verticale e la sua parte appuntita sia parzialmente immersa nell'azoto liquido. Una volta fatto, versare delicatamente l'azoto liquido contenente la sostanza bianca simile alla polvere ottenuta in precedenza nel cono di microsetaccio.
Utilizzando un pennello largo, raccogliere e trasferire il materiale vegetale rimanente dal primo contenitore nel cono a maglie da 150 micrometri. Quindi, staccare con attenzione la molletta dal coperchio del contenitore e aprire il cono di microsetaccio per individuare i tricomi nel mezzo del microsetaccio aperto. Tenere insieme tutti e quattro gli angoli del microsetaccio e immergere la parte centrale contenente i tricomi in azoto liquido.
Immergere delicatamente e agitare il microsetaccio nell'azoto liquido per un minuto. Utilizzando un ago sterile, praticare piccoli fori nel cappuccio di una provetta da 50 millilitri per evitare l'accumulo di pressione. Raccogliere i detriti vegetali non setacciati, il ghiaccio secco e i tricomi più grandi avvolti al centro del microsetaccio in una provetta da 50 millilitri e conservarli a meno 80 gradi Celsius per un uso futuro.
Trasferire i tricomi setacciati immersi nell'azoto liquido sequenzialmente attraverso microsetacci, avendo dimensioni di scorrimento decrescenti da 105 a 80 a 65 e quindi a 50 micrometri. Dopo ogni trasferimento, raccogliere separatamente i tricomi di diverse dimensioni rimasti sul microsetaccio ed etichettarli. Fare piccoli fori nel cappuccio del tubo usando un ago sterile.
Trasferire i tricomi desiderati immersi in azoto liquido e avvolti nel microsetaccio da 50 micrometri in una piastra pulita utilizzando un cucchiaio pre-refrigerato. Quindi trasferire rapidamente i tricomi simili a polvere in un tubo da 1,5 millilitri pre-raffreddato etichettato utilizzando una spatola pre-raffreddata e conservare immediatamente i tubi a meno 80 gradi Celsius per ulteriori studi. Nella fase iniziale del processo di isolamento, pezzi di tessuto fogliare erano predominanti nella porzione isolata, in contrasto con il prodotto isolante finale, che era composto interamente da tricomi isolati non contaminati.
La qualità dei tricomi a peduncolo e sessili granulari isolati è stata osservata nella fase finale di isolamento. La purezza dei tricomi isolati con questo metodo era paragonabile a un protocollo convenzionale. La delicata struttura della testa del tricomo peduncolato è stata mantenuta e le teste intere del tricomi a peduncolo isolato erano visibili, in contrasto con il metodo tradizionale, in cui mancava la struttura completa della testa del tricomo e erano presenti solo cellule del disco.
L'estrazione dell'RNA e la stima dell'integrità dell'RNA dei tricomi isolati hanno indicato un elevato numero di integrità dell'RNA o valori RIN da 9,4 a 10 e la cromatografia su gel ha indicato un'elevata integrità dell'RNA. Eseguire con attenzione il movimento di infusione a forma di sacchetto T dell'isolamento microsetacciato da 150 a 50 micro. Questo metodo può fornire informazioni sulla composizione trascrittomica e probabilmente proteomica dei tricomi della cannabis e dei tricomi di altre specie vegetali.
A seguito di questa procedura, possono essere eseguite caratterizzazioni metaboliche e trascrittomiche. Questi metodi aggiuntivi possono aiutare a comprendere i livelli di espressione dei geni nei tricomi isolati e i loro profili metabolici. Questa tecnica ha permesso la caratterizzazione trascrittomica dei tricomi ghiandolari di diverse varietà di cannabis.
