Applicazione coerente della spettroscopia Raman anti-Stokes (CARS) per l'imaging della mielinizzazione nelle fette di cervello

Questa tecnica può visualizzare la mielina nelle sezioni del tessuto cerebrale. La mielinizzazione svolge un ruolo importante nella conduzione dei potenziali d'azione e la comprensione della mielina ci aiuterà a capire la funzione cerebrale. Il vantaggio principale della tecnica CARS rispetto, ad esempio, alla microscopia elettronica è che CARS è una tecnica di microscopia ottica e può essere facilmente combinata con altre immagini a fluorescenza, come quelle utilizzate nell'immunoistochimica.

Diverse condizioni mediche sono dovute ad alterazioni della mielinizzazione, ad esempio la sclerosi multipla, l'invecchiamento e l'autismo. Comprendere queste alterazioni ci aiuterà a capire le condizioni mediche sottostanti. In questo caso, il laser CARS è sintonizzato sui lipidi dell'immagine o, in particolare, sui legami CH2.

Nel cervello, la più grande fonte di lipidi è la mielina. Quindi, questa è una tecnica per visualizzare la mielina nel tessuto cerebrale. Dovrebbe essere possibile utilizzare lo stesso metodo per altri tipi di tessuto quando l'imaging dei lipidi è di interesse.

La messa a punto e l'allineamento del laser CARS richiede una notevole esperienza e viene eseguita al meglio da un esperto di microscopia laser o ottica. Dopo aver preparato i tessuti come descritto nel manoscritto, colorare le sezioni fluttuanti per i mezzi nisel e anticorpali per visualizzare i corpi cellulari, quindi incubare le sezioni su uno shaker da laboratorio standard per 30 minuti a temperatura ambiente. Prima di portare i campioni al microscopio, accendere e riscaldare il laser CARS per almeno un'ora, quindi allineare il laser CARS sovrapponendo spazialmente la pompa e alimenta i raggi laser e regolare il ritardo tra i due raggi laser.

Colorare l'ottica del condensatore e il diaframma del microscopio per l'imaging CARS in avanti, quindi regolare il periscopio esterno per centrare i due laser spazialmente sovrapposti sugli specchi della testa di scansione del microscopio. Per il miglior rilevamento CARS non descanizzato in avanti. Assicurarsi che il condensatore sia colorato.

Per l'immunofluorescenza, l'imaging confocale e l'imaging CARS, montare il laser CARS con rivelatori non descansionati sia in avanti che epi CARS incorporando un microscopio confocale dotato di laser visibili per l'imaging a fluorescenza. Ora, posizionare le sezioni in un piatto di coltura con un fondo di copertura e PBS per evitare di asciugare il tessuto. Inoltre, utilizzare un peso di vetro per mantenere il tessuto vicino al vetrino di copertura.

Utilizzando l'interfaccia utente grafica, impostare i parametri di acquisizione delle immagini per le automobili e l'imaging confocale a fluorescenza missilistica. Posizionare il campione sul palco del microscopio, mettere a fuoco il campione e acquisire le immagini. Gli spettri di CARS vanno da 640 a 660 nanometri e non sembra esserci sovrapposizione negli spettri con marcatori immunofluorescenti marcati con nisel, indicando che i segnali CARS possono essere utilizzati con segnali immunofluorescenti.

Nisel è stato utilizzato per visualizzare i corpi cellulari del gerbillo mongolo e del cervello di topo, e l'imaging di CARS è stato utilizzato per visualizzare la guaina mielinica, indicando che questa tecnica potrebbe essere utilizzata in tutte le specie. Entrambe le serie di immagini mostrano una sezione del nucleo mediale del corpo trapezoidale nel tronco cerebrale. La risoluzione di CARS è inferiore a quella del microscopio elettronico ed è dell'ordine di diverse centinaia di nanometri.

Le immagini possono essere analizzate con software di analisi delle immagini standard, come ImageJ per quantificare i parametri di interesse, ad esempio lo spessore o la lunghezza della mielina.