Questo protocollo confronta le due tecniche di scattering Raman iperspettrale coerenti più utilizzate, tra cui lo scattering raman anti-Stokes coerente e i processi di scattering Raman stimolati e questo consente ai biologi di scegliere la migliore modalità di imaging per le loro applicazioni biologiche. Utilizzando le firme vibrazionali intrinseche, la spettroscopia Raman coerente è in grado di mappare informazioni chimiche e campioni biologici senza la necessità di etichettatura esogena. La microscopia Raman coerente ha ampliato la nostra comprensione del metabolismo cellulare, della mappatura, delle distribuzioni dei farmaci, della diagnostica delle malattie e della quantificazione dei cambiamenti chimici.
Questa è una tecnica che richiede una formazione sufficiente sia in ottica che in spettroscopia. Consiglierei di leggere alcuni articoli di recensione e di essere addestrati da un esperto prima di utilizzare questa tecnica. Per iniziare, preparare le diapositive di imaging posizionando un pezzo di nastro biadesivo su una slitta di copertura e ritagliare una piccola forma rettangolare del nastro dal centro del nastro per creare un'area aperta per il posizionamento del campione.
Pipettare da 1 a 2 microlitri di DMSO puro ed erogare la goccia al centro del posto vacante. Posizionare con attenzione lo slip del coperchio superiore e posizionare delicatamente i bordi degli slip del coperchio per sigillare la camera assicurandosi che il campione DMSO non entri in contatto con i bordi del nastro. Per gli esperimenti di sensibilità, preparare diluizioni seriali di DMSO in ossido di deuterio per dare un intervallo di concentrazione dal 50 allo 0% Prendere da 1 a 2 microlitri di ciascuna soluzione e preparare campioni pressati come dimostrato in precedenza.
Posizionare il campione sul palco del microscopio e aggiungere acqua o olio per immersione, se necessario, per la lente dell'obiettivo o il condensatore. Spostare correttamente il bordo della goccia DMSO nel campo visivo e regolare l'obiettivo per la migliore messa a fuoco, quindi centrare il condensatore utilizzando il metodo di illuminazione Kohler e aprire completamente il diaframma sul condensatore. Quindi, sintonizzare la lunghezza d'onda del fascio della pompa a 800 nanometri per indirizzare il picco CH3 del numero d'onda 2913 e impostare la potenza sia della pompa che del raggio di Stokes a circa 30 milliwatt prima del microscopio regolando la piastra a mezza onda.
Per SRS, impostare il guadagno dell'amplificatore lock-in su circa 10 con una costante di tempo di 7 microsecondi, assicurandosi che la costante di tempo sia inferiore al tempo di permanenza dei pixel. Imposta i parametri di acquisizione delle immagini e il software di acquisizione utilizzando un numero di pixel di 200 per 200 con una dimensione di scansione di circa 100 x 100 metri quadrati, assicurandoti che l'immagine contenga sia il droplet DMSO che un'area vuota, quindi scansiona il campione e controlla l'immagine sullo schermo del computer. Quindi, scansiona l'immagine di ritardo motorizzata nel raggio della pompa Stokes mentre monitori le immagini in tempo reale e scansiona il ritardo fino a quando il segnale non viene massimizzato.
Spostare la goccia DMSO per coprire l'intero campo visivo e verificare se il massimo del segnale CC è centrato nell'immagine poiché il segnale dipende dal fascio della pompa. Regolare la posizione del fascio della pompa tramite uno specchio o l'offset di tensione nel software di imaging. Dopo l'ottimizzazione DC, regolare gli specchi del fascio di Stokes fino a quando il segnale CA non viene massimizzato regolando il valore di soglia per visualizzare circa il 50% di saturazione controllando che la saturazione sia centrata nell'immagine.
In caso contrario, mettere a punto gli specchi solo nel fascio di Stokes e monitorare il segnale durante l'allineamento come feedback in tempo reale sulla qualità dell'allineamento. Per l'analisi SNR, aprire il software ImageJ e importare il file di testo di esempio DMSO salvato facendo clic su File, quindi su Importa, quindi sulle opzioni Immagine di testo e Apri dal menu a discesa. Una volta importata l'immagine, premere Ctrl Maiusc C per visualizzare la funzione Luminosità e Contrasto, quindi premere il pulsante Automatico nella funzione Luminosità e Contrasto finché la regione del campione DMSO appare satura per trovare il segnale di campionamento massimo.
Quindi, fare clic sullo strumento di selezione Ovale nell'interfaccia ImageJ ed evidenziare una piccola area della regione DMSO satura. Dopo l'evidenziazione, premere M per misurare la deviazione media e standard dell'area selezionata. Per misurare lo sfondo, regolare le barre nella funzione Luminosità e contrasto fino a quando non è possibile osservare il segnale della regione vuota, quindi fare clic sulla selezione ovale ed evidenziare una regione dello sfondo, assicurandosi che la regione selezionata non contenga DMSO.
Successivamente, premere M per misurare le statistiche dell'area selezionata. Quindi, calcolare l'SNR come dimostrato in precedenza misurando il valore medio del rumore e il valore medio del segnale insieme alla deviazione standard. Per elaborare le immagini CRS iperspettrali, importare il file di testo facendo clic sulle opzioni File, quindi Importa, Immagine di testo e Apri dal menu a discesa.
Una volta importato, fai clic su Immagine, quindi su Stack, seguito dalle opzioni Strumenti e Montaggio su Stack per convertire il file in uno stack di immagini, quindi scorri il montaggio fino a visualizzare il primo picco DMSO. Selezionare una regione sul DMSO e fare clic su Immagine, quindi sulle opzioni Stack e Plot Z-axis Profile per tracciare lo spettro dell'intensità rispetto allo spettro del numero di fotogrammi. Quindi, fai clic su Elenca e copia i dati del profilo per estrarre i dati spettrali grezzi.
Per convertire lo spettro recuperato in unità di frequenza, eseguire una regressione lineare utilizzando il CH simmetrico e asimmetrico che si estende da DMSO e i relativi numeri di fotogramma corrispondenti. La risoluzione spettrale del DMSO è stata misurata utilizzando una microscopia iperspettrale SRS e CARS, che mostrano una risoluzione rispettivamente di 14,6 e 17,1, indicando che SRS ha una migliore risoluzione spettrale. Gli spettri DMSO SRS sono stati ottenuti a concentrazioni dello 0,1 e dello 0,01% in cui il picco al numero d'onda 2913 può essere risolto nel primo, ma non nel secondo, indicando che il limite di rilevamento è compreso tra 0,1 e 0,01% DMSO.
Gli spettri CARS recuperati in fase mostrano che il picco del numero d'onda DMSO 2913 può essere chiaramente risolto per lo 0,1% DMSO, ma non per lo 0,01% che indica un limite di rilevamento tra queste due concentrazioni. I profili di intensità SRS e CARS di una cella MIA PaCA-2 hanno dimostrato che il segnale SRS ha dato una risoluzione di 398,6 nanometri, mentre il segnale CARS ha dato una risoluzione 1,2 volte migliore di 330,3 nanometri. Le immagini SRS e CARS delle cellule MIA PaCa-2 in diverse posizioni di ritardo ottico mostrano i segnali più forti con goccioline lipidiche come punti luminosi per SRS, mentre CARS ha contrasti molto ridotti.
Tuttavia, uno spostamento in rosso del numero d'onda 37 nella messa a fuoco spettrale ha migliorato i contrasti lipidici sia per SRS che per CARS. Gli spettri SRS mostrano un segnale molto più forte a 2850 numero d'onda per le goccioline lipidiche rispetto ad altri organelli, mentre gli spettri CARS mostrano un piccolo spostamento verso il rosso. Per ottimizzare il segnale di scattering Raman coerente, prima trova la messa a fuoco del campione, quindi sintonizza il ritardo ottico e, infine, perfeziona gli specchi fino a raggiungere il massimo.
Altre tecnologie pompa-sonda, come l'assorbimento transitorio, sono intrinsecamente integrate nella piattaforma CRS. Questa tecnologia è molto potente per misurare la cinetica di assorbimento di molecole non fluorescenti che assorbono la luce forte. Questa tecnica consente ai ricercatori di visualizzare piccole molecole in modo privo di etichette con un'elevata attività chimica delle cellule.
Consente inoltre ai ricercatori di visualizzare i cambiamenti nel metabolismo lipidico, nelle dinamiche intracellulari e nelle distribuzioni dei farmaci.
