Il nostro protocollo è il primo metodo documentato per l'anestesia e l'intubazione endotracheale di cuccioli di topo pre-adolescenti per la chirurgia cardiotoracica. Abbiamo sviluppato regimi anestetici, attrezzature specializzate e pratiche di manipolazione specifiche che consentono l'intubazione endotracheale di cuccioli di topo C57 Black Six J di 10 = giorni per la chirurgia cardiotoracica riducendo al minimo la mortalità animale. Prevediamo che un operatore esperto in intubazioni per adulti possa raggiungere la competenza nell'intubazione pre-adolescenziale dopo aver praticato su 10 cucciolate da sette a otto cuccioli A dimostrare la procedura sarà il Dr.Jianxin Wu, uno scienziato senior del nostro laboratorio.
Il giorno dell'esperimento, installare attrezzature specializzate per l'intubazione di cuccioli di 10 giorni come descritto nel manoscritto. Per l'intervento chirurgico, utilizzare una cannula costituita da un tubo di plastica lungo 19 millimetri collegato a un adattatore di plastica femmina da 21 millimetri. Irrigidire il tubo della cannula inserendo un pezzo di filo di rame tramite l'adattatore di blocco dell'esca.
Fissare il cucciolo anestetizzato supino su una piattaforma di intubazione. Prima dell'intubazione del cucciolo anestetizzato, controllare la profondità dell'anestesia dal riflesso del pizzico della zampa. Il riflesso del pizzicamento della zampa deve essere presente ma notevolmente ridotto da quello di un animale cosciente.
Tenere la lingua del cucciolo con una piccola pinza e utilizzare un laringoscopio modellato da un pezzo di filo di rame e una luce flessibile a fibre ottiche per esporre la glottide e le corde vocali. Inclinare la cannula irrigidita in modo che l'estremità del blocco esca sia leggermente più bassa della punta e non appena le corde vocali si separano, inserire la cannula e farla avanzare fino a quando l'adattatore di blocco esca è appena fuori dalla bocca. Quindi rimuovere immediatamente il filo.
Valutare la profondità dell'anestesia dopo l'intubazione dalla capacità dell'animale di respirare spontaneamente. Trasferire il cucciolo intubato su un pad riscaldante impostato a 37 gradi Celsius. Confermare il successo dell'intubazione tracheale del cucciolo che respira spontaneamente bloccando brevemente il catetere di intubazione per verificare che ciò impedisca il movimento del torace.
Collegare la cannula endotracheale a un ventilatore, fornendo ossigeno al 100% a una portata di un litro al minuto. La procedura dovrebbe richiedere meno di 15 secondi per ridurre al minimo la respirazione. Dopo aver indotto un piano chirurgico di anestesia per l'intervento chirurgico, confermare l'intubazione tracheale controllando che la frequenza del movimento della parete toracica sia uguale a quella del ventilatore.
Posizionare il cucciolo sotto un microscopio chirurgico con obiettivi 10X e 16X per la chirurgia dell'infarto miocardico. Dopo aver disinfettato la pelle, praticare un'incisione orizzontale della pelle tra la terza e la quarta costola nella parete laterale sinistra del torace usando un bisturi. Con l'aiuto di una pinza fine, aprire il torace mediante dissezione smussata dello spazio intercostale e utilizzare un divaricatore per mantenere lo spazio aperto.
Indurre un infarto miocardico legando l'arteria coronaria sinistra distale all'appendice atriale sinistra con una sutura monofilamento in polipropilene 9-0. Dopo i 10 minuti dell'intervento chirurgico di infarto, chiudere la pelle con una sutura 7-0. Pulire il sangue con etanolo al 70% o soluzione salina e disinfettare l'incisione con Betadine.
Consentire all'animale di riprendersi e garantire che la respirazione spontanea riprenda entro pochi minuti. Quindi riportare il cucciolo nella camera pre-ossigenata riscaldata e monitorare continuamente durante il recupero. Quando il riflesso raddrizzante viene recuperato, estubare il cucciolo.
Strofinare delicatamente il cucciolo con la lettiera della gabbia domestica. Tieni il cucciolo al caldo e controlla che la respirazione sia regolare e che sia in grado di muoversi spontaneamente. Riportare la diga nella gabbia.
Quindi restituire tutti i cuccioli quando si sono completamente ripresi dall'anestesia. Ospita la diga e i cuccioli durante la notte in una gabbia posta per metà su un pad riscaldante impostato a 37 gradi Celsius. Il terzo giorno dopo l'intervento, fissare il cucciolo anestetizzato in posizione supina su un pad riscaldante registrando la coda.
Metti un filo sopra gli incisivi e fissa il cucciolo in una posizione e tieni la testa estesa in un cono nasale. Disinfettare la pelle con etanolo al 70%. Usando forbici sottili, praticare un'incisione di un centimetro nella pelle sopra l'arteria carotide comune destra lungo la trachea e cannulare il vaso esposto utilizzando un tubo di polietilene a lume singolo collegato a un ago di calibro 26 per somministrare 0,2 millilitri di soluzione salina eparinizzata per un minuto dopo aver causato un arresto cardiaco come descritto nel manoscritto, Sezionare la vena giugulare destra attraverso l'incisione precedente e transettarla.
Perfondere il cuore con 0,2 millilitri di PBS e poi con 0,1 millilitri di 0,2% Alcian Blue per colorare il miocardio remoto non infartuato. Controllare la perfusione riuscita, evidenziata dal lavaggio del sangue, PBS e poi Alcian Blue attraverso la vena giugulare. Al termine, aprire il torace e asportare il cuore sezionando il tessuto connettivo circostante e vasi per rilasciare il cuore.
Risciacquare il cuore in PBS, quindi rimuovere gli atri e fotografare il cuore con una fotocamera montata su un microscopio chirurgico utilizzando un soggettivo 10X. Negli esperimenti preliminari, il regime di anestesia è stato ottimizzato per i cuccioli di 10 giorni. Una dose di 50 milligrammi per kg di ketamina, sei milligrammi per kg di xilazina e 0,18 milligrammi per kg di atropina ha provocato una profondità sufficiente di anestesia per consentire l'intubazione endotracheale di cuccioli che respirano spontaneamente da 5,5 a 7,30 grammi.
Poiché i cuccioli più leggeri non potevano tollerare la dose più elevata di anestesia, la riduzione del dosaggio a 30 milligrammi per kg di ketamina, quattro milligrammi per kg di xilazina e 0,12 milligrammi per kg di atropina ha permesso l'intubazione dei cuccioli che pesavano da 4,50 a 5,49 grammi. In confronto, un'ulteriore riduzione del dosaggio di ketamina a 20 milligrammi per kg ha permesso l'intubazione di cuccioli di peso compreso tra 3,15 e 4,49 grammi. La tabella mostra anche il numero e la percentuale di cuccioli intubati che hanno proceduto all'intervento chirurgico.
I cuccioli con un peso corporeo inferiore erano più difficili da intubare rispetto ai cuccioli più pesanti e richiedevano più tentativi che hanno portato a una percentuale di sopravvivenza inferiore dei cuccioli rispetto al gruppo di peso più alto. Inoltre, un numero maggiore di cuccioli intubati del gruppo di peso più alto ha proceduto alla chirurgia dell'infarto miocardico rispetto al gruppo di peso basso e medio. La sopravvivenza due giorni dopo l'intervento chirurgico di infarto miocardico è stata coerente tra i diversi gruppi di peso all'86% al 92% La profondità dell'anestesia è fondamentale per l'intubazione e la sopravvivenza.
Se l'anestesia è troppo leggera, l'intubazione è difficile. Se troppo in profondità, i cuccioli smetteranno di respirare spontaneamente durante o dopo l'intubazione. Il nostro protocollo di intubazione anestesiologica consentirà di stabilire modelli che richiedono chirurgia toracica cardiaca in topi preadolescenti, permettendo, ad esempio, studi sui polmoni, sull'esofago e sul cuore durante questo periodo.
