Nuestro protocolo es el primer método documentado para anestesia e intubación endotraqueal de cachorros de ratón preadolescentes para cirugía cardiotorácica. Hemos desarrollado regímenes anestésicos, equipos especializados y prácticas de manejo específicas que permiten la intubación endotraqueal de cachorros de ratón C57 Black Six J de 10 = días de edad para cirugía cardiotorácica y minimizan la mortalidad animal. Anticipamos que un operador con experiencia en intubaciones de adultos puede lograr competencia en la intubación preadolescente después de practicar en 10 camadas de siete a ocho cachorros. Demostrando el procedimiento estará el Dr. Jianxin Wu, un científico senior de nuestro laboratorio.
El día del experimento, configure un equipo especializado para la intubación de cachorros de 10 días de edad como se describe en el manuscrito. Para la cirugía, use una cánula que consiste en un tubo de plástico de 19 milímetros de largo conectado a un adaptador de bloqueo de señuelo femenino de plástico de 21 milímetros. Endurezca el tubo de la cánula insertando un trozo de alambre de cobre a través del adaptador de bloqueo de señuelo.
Asegure al cachorro anestesiado en decúbito supino a una plataforma de intubación. Antes de la intubación del cachorro anestesiado, verifique la profundidad de la anestesia por el reflejo de pellizco de la pata. El reflejo de pellizco de la pata debe estar presente pero notablemente reducido del de un animal consciente.
Sostenga la lengua del cachorro con pequeños fórceps y use un laringoscopio hecho de un trozo de alambre de cobre y una luz de fibra óptica flexible para exponer la glotis y las cuerdas vocales. Incline la cánula rígida de modo que el extremo del bloqueo del señuelo esté ligeramente más bajo que la punta, y tan pronto como las cuerdas vocales se separen, inserte la cánula y avance hasta que el adaptador de bloqueo de señuelo esté justo fuera de la boca. Luego retire inmediatamente el cable.
Evaluar la profundidad de la anestesia después de la intubación por la capacidad del animal para respirar espontáneamente. Transfiera el cachorro intubado a una almohadilla de calentamiento establecida a 37 grados centígrados. Confirme la intubación traqueal exitosa de un cachorro que respira espontáneamente bloqueando brevemente el catéter de intubación para verificar que esto impida el movimiento del pecho.
Conecte la cánula endotraqueal a un ventilador, suministrando oxígeno al 100% a una velocidad de flujo de un litro por minuto. El procedimiento debe tomar menos de 15 segundos para minimizar la reinhalación. Después de inducir un plano quirúrgico de anestesia para la cirugía, confirme la intubación traqueal verificando que la frecuencia de movimiento de la pared torácica sea igual a la del ventilador.
Coloque al cachorro bajo un microscopio quirúrgico con objetivos 10X y 16X para la cirugía de infarto de miocardio. Después de desinfectar la piel, haga una incisión horizontal en la piel entre la tercera y cuarta costilla en la pared lateral izquierda del tórax con un bisturí. Con la ayuda de fórceps finos, abra el tórax mediante una disección roma del espacio intercostal y use un retractor para mantener el espacio abierto.
Inducir un infarto de miocardio ligando la arteria coronaria izquierda distal al apéndice auricular izquierdo con una sutura de monofilamento de polipropileno 9-0. Después de los 10 minutos de la cirugía de infarto, cierre la piel con una sutura 7-0. Limpie la sangre con etanol al 70% o solución salina y desinfecte la incisión con Betadine.
Permita que el animal se recupere y asegúrese de que la respiración espontánea se reanude en unos pocos minutos. Luego devuelva el cachorro a la cámara preoxigenada calentada y monitoree continuamente durante la recuperación. A medida que se recupera el reflejo de enderezamiento, extuba al cachorro.
Frote suavemente al cachorro con ropa de cama de jaula casera. Mantenga al cachorro caliente y verifique que la respiración sea regular y que el cachorro sea capaz de moverse espontáneamente. Devuelva la presa a la jaula.
Luego devuelva a todos los cachorros cuando se hayan recuperado completamente de la anestesia. Aloje a la presa y a los cachorros durante la noche en una jaula colocada la mitad en una almohadilla de calentamiento a 37 grados centígrados. Al tercer día después de la cirugía, asegure al cachorro anestesiado en posición supina en una almohadilla de calentamiento pegando la cola.
Coloque un hilo sobre los incisivos y pegue al cachorro en una posición y mantenga la cabeza extendida en un cono nasal. Desinfectar la piel con etanol al 70%. Usando tijeras finas, haga una incisión de un centímetro en la piel sobre la arteria carótida común derecha a lo largo de la tráquea y cannule el vaso expuesto usando un tubo de polietileno de un solo lumen conectado a una aguja de calibre 26 para administrar 0.2 mililitros de solución salina heparinizada durante un minuto después de causar un paro cardíaco como se describe en el manuscrito, Diseccionar la vena yugular derecha a través de la incisión anterior y transectarla.
Perfundir el corazón con 0,2 mililitros de PBS y luego con 0,1 mililitros de azul alcian al 0,2% para teñir el miocardio remoto no infartado. Verifique la perfusión exitosa, evidenciada por el lavado de sangre, PBS y luego Alcian Blue a través de la vena yugular. Cuando haya terminado, abra el tórax y extirpe el corazón diseccionando el tejido conectivo circundante y los vasos para liberar el corazón.
Enjuague el corazón en PBS, luego retire las aurículas y fotografíe el corazón con una cámara montada en un microscopio quirúrgico usando un subjetivo 10X. En los experimentos preliminares, el régimen de anestesia se optimizó para cachorros de 10 días de edad. Una dosis de 50 miligramos por kg de ketamina, seis miligramos por kg de xilazina y 0,18 miligramos por kg de atropina dio como resultado una profundidad suficiente de anestesia para permitir la intubación endotraqueal de cachorros que respiran espontáneamente que pesan de 5,5 a 7,30 gramos.
Como los cachorros más ligeros no podían tolerar la dosis más alta de anestesia, la disminución de la dosis a 30 miligramos por kg de ketamina, cuatro miligramos por kg de xilazina y 0,12 miligramos por kg de atropina permitió la intubación de los cachorros que pesaban de 4,50 a 5,49 gramos. En comparación, una mayor reducción de la dosis de ketamina a 20 miligramos por kg permitió la intubación de cachorros que pesaban de 3,15 a 4,49 gramos. La tabla también muestra el número y porcentaje de cachorros intubados que procedieron a la cirugía.
Los cachorros con pesos corporales más bajos eran más difíciles de intubar que los cachorros más pesados y requerían más intentos, lo que resultó en un menor porcentaje de supervivencia de los cachorros que el grupo de mayor peso. Además, un mayor número de cachorros intubados del grupo de mayor peso procedieron a la cirugía de infarto de miocardio que el grupo de bajo y medio peso. La supervivencia dos días después de la cirugía de infarto de miocardio fue consistente entre los diferentes grupos de peso en 86% a 92%La profundidad de la anestesia es crítica para la intubación y la supervivencia.
Si la anestesia es demasiado ligera, la intubación es difícil. Si son demasiado profundos, los cachorros dejarán de respirar espontáneamente durante o después de la intubación. Nuestro protocolo de intubación anestésica permitirá establecer modelos que requieran cirugía torácica cardíaca en ratones preadolescentes, permitiendo, por ejemplo, estudios sobre pulmones, esófago y corazón durante este período.
