Questo studio descrive l'isolamento dell'arteria intrapolmonare del ratto e delle cellule muscolari lisce vascolari. Sono stati impiegati diversi protocolli sperimentali, come l'uso della tecnica del bagno d'organo per studiare la risposta vascolare dell'arteria intrapolmonare. Le arterie intrapolmonari e le cellule muscolari lisce vascolari sono modelli eccellenti per studiare la fisiologia vascolare e la fisiopatologia.
Gli adattamenti di questa tecnica potrebbero valutare le risposte vascolari di qualsiasi farmaco, estratto o fitochimico. Il montaggio dell'anello arterioso intrapolmonare isolato in un bagno d'organo consente l'uso di arterie intrapolmonari isolate per valutare il ruolo di un farmaco nella modulazione di varie malattie, tra cui l'ipertensione polmonare. I protocolli sperimentali sono tecnicamente fattibili, ma i passaggi cruciali sono complicati ed essenziali per il successo, quindi avere una dimostrazione visiva lo rende più facile da capire e seguire.
A dimostrare la procedura sarà Kittiwoot To-on, uno studente di master in fisiologia del Laboratorio dell'Unità di Ricerca Cardiovascolare, Dipartimento di Fisiologia, Facoltà di Scienze Mediche, Naresuan University. Inizia tagliando un singolo lobo del polmone con forbici da 11 centimetri e posizionandolo su una piastra di Petri di nove centimetri con il lato mediale, o radice del polmone, rivolto verso l'alto. Osservare e identificare l'allineamento della vena, dei bronchi e dell'arteria dall'alto verso il basso.
Tagliare il bronco longitudinalmente con le forbici. Quindi usa la pinza da 11 centimetri per afferrare la punta del bronco. Sezionare delicatamente e rimuovere i bronchi e le vene dal polmone.
Utilizzare la pinza per afferrare la punta dell'arteria intrapolmonare e sezionarla attentamente dal tessuto polmonare con le forbici. Mantenere l'arteria intrapolmonare isolata in soluzione fredda di Krebs fino a quando non viene impostato il gruppo del bagno dell'organo. Dopo aver isolato l'arteria intrapolmonare, tagliare longitudinalmente il ramo principale dell'arteria intrapolmonare con le forbici da 11 centimetri e tagliare a strisce di due millimetri.
Immergere le strisce dell'arteria intrapolmonare in DM, quindi incubare le strisce per un'ora a quattro gradi Celsius in DM contenenti un milligrammo per millilitro di papaina, 0,04% BSA e 0,4 millimolare DTT. Quindi incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Aggiungere un milligrammo per millilitro di collagenasi di tipo IA nel DM e nuovamente incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti.
Trasferire i tessuti in DM fresco e disperderli mediante triturazione delicata con una pipetta Pasteur di vetro. Continuare a triturare fino a quando le cellule muscolari lisce vascolari isolate diventano visibili nella soluzione di bagno al microscopio. Isolare l'arteria intrapolmonare come dimostrato in precedenza e tagliare il ramo principale dell'arteria intrapolmonare in anelli di circa due millimetri di lunghezza.
Fissare gli anelli delle arterie intrapolmonari nelle camere da bagno degli organi infilandoli su due fili di acciaio inossidabile di 40 micrometri di diametro. Collegare fili di acciaio inox montati con anelli di arterie intrapolmonari ai trasduttori di forza isometrici collegati al dispositivo di acquisizione dati e al sistema informatico installato con l'idoneo software fisiologico per la registrazione e l'analisi dei dati. Quindi aumentare delicatamente la tensione dell'anello dell'arteria intrapolmonare a un grammo.
Lasciare che i segmenti del vaso si bilancino per circa 45 minuti a una tensione di riposo di un grammo. Durante il periodo di equilibrio, assicurarsi che la soluzione di Krebs venga cambiata regolarmente ogni 15 minuti. Dopo l'equilibrazione, testare la vitalità dei vasi misurando la loro vasocostrizione a soluzione di potassio extracellulare elevata.
Valutare la presenza o l'assenza di endotelio calcolando la risposta di rilassamento all'acetilcolina in anelli precontratti con PE. Rimuovere meccanicamente l'endotelio strofinando delicatamente l'interno del vaso con un piccolo filo per indurre la denudazione. Quindi equilibrare gli anelli arteriosi per 30 minuti prima dell'inizio degli esperimenti di prova. Studiare l'effetto rilassante dell'estratto vegetale precontraendo gli anelli dell'arteria intrapolmonare con PE. Quindi aggiungere con attenzione da 0,1 a 1000 microgrammi per millilitri di estratto vegetale cumulativamente agli anelli intatti dell'endotelio e agli anelli denudati con endotelio per indurre vasorilassamento e acquisire una curva di risposta dipendente dalla concentrazione.
Assicurarsi che anche il DMSO efficace utilizzato come solvente sia valutato in modo simile per fungere da controllo negativo. Valutare il meccanismo d'azione vasorilassante dell'estratto vegetale come menzionato nel testo manoscritto. Quindi, dopo che le contrazioni per stabilizzare il PE, aggiungere concentrazioni cumulative dell'estratto vegetale.
Presentare gli effetti dell'estratto vegetale come rilassamento percentuale degli anelli dell'arteria intrapolmonare in presenza di inibitori rispetto alla risposta degli anelli dell'arteria intrapolmonare senza inibitori e costruire la curva di risposta alla concentrazione. Nell'arteria intrapolmonare intatta dell'endotelio, l'estratto vegetale ha suscitato una risposta di vasorilassamento dipendente dalla concentrazione. L'eradicazione dell'endotelio ha ridotto profondamente la vasorilassazione indotta dall'estratto vegetale come riflesso dall'aumento della CE50 di 2,2 volte, l'inibizione di eNOS e EDHF ha evidentemente diminuito la risposta vasorilassante all'estratto vegetale.
Ciò ha spostato la curva di risposta alla concentrazione verso destra e aumentato l'EC50 senza alterare i valori E max. Al contrario, l'indometacina non ha mostrato alcun effetto sulla risposta vasorilassante all'estratto vegetale. Negli anelli dell'arteria intrapolmonare denudati dall'endotelio, i bloccanti dei canali del potassio attivati dal calcio hanno diminuito la risposta vasorilassante all'estratto vegetale.
Mentre i bloccanti dei canali del potassio voltaggio-dipendenti o sensibili all'ATP non hanno mostrato alcuna deviazione. La preincubazione con l'estratto vegetale ha inibito la contrazione indotta dal cloruro di calcio. Gli anelli dell'arteria intrapolmonare denudati dall'endotelio preincubati con soluzione di Krebs priva di calcio e PE hanno reso una contrazione transitoria.
Rispetto al veicolo, gli estratti vegetali hanno ridotto significativamente la contrazione indotta dall'EP. Durante la procedura, è necessario identificare chiaramente la vena, i bronchi e l'arteria nella fase iniziale. Tagliare o danneggiare l'arteria ridurrà la sua lunghezza e influenzerà le risposte vascolari. Questa tecnica può essere adattata per studiare composti che potrebbero servire come prototipi per il trattamento delle malattie vascolari polmonari come l'ipertensione arteriosa polmonare.
