L'imaging in vivo di tessuti biologici con risoluzione subcellulare e specificità chimica è un potente strumento per comprendere i processi dinamici coinvolti nel metabolismo cellulare, nella risposta immunitaria e nel rimodellamento dei tessuti. Con la fluorescenza combinata a due fotoni e la microscopia a dispersione Raman stimolata, le informazioni biochimiche e biofisiche critiche dei tessuti biologici possono essere acquisite da più prospettive con risoluzione subcellulare. In particolare, questa microscopia dual-modale può essere utilizzata per visualizzare le dinamiche cellulari e le interazioni nel midollo spinale del topo per studiare la progressione delle malattie neurodegenerative e delle lesioni del midollo spinale.
Per iniziare, accendere il laser zaffiro in titanio commutando l'interruttore a chiave dalla posizione standby a quella on e attendere 30 minuti affinché il laser si riscaldi. Quindi accendere l'OPO facendo clic sul pulsante start sul pannello di controllo OPO e attendere 20 minuti affinché il laser si riscaldi. Dopo che il laser a picosecondi si è riscaldato, controllare la profondità di modulazione del raggio di Stokes abbassando la potenza del raggio di Stokes a circa 20 milliwatt, aprendo l'otturatore laser per il raggio di Stokes e posizionando un rilevatore di foto ad alta velocità all'uscita OPO per rilevare il raggio.
Quindi, collegare la porta di uscita del fotorivelatore alla porta di ingresso di un oscilloscopio utilizzando un cavo coassiale con un connettore BNC per monitorare l'impulso laser. Quindi aprire la finestra di controllo EOM nel software di controllo OPO e regolare la potenza e la fase EOM in base al diagramma di intensità dell'impulso mostrato sull'oscilloscopio per ottenere la massima profondità di modulazione a 20 megahertz. Nel software di controllo OPO, aprire l'otturatore laser della pompa mentre si arresta l'uscita Stokes.
Quindi, fare clic sulla casella del segnale impostato per impostare la lunghezza d'onda del fascio della pompa su 796 nanometri, quindi fare clic sulla casella di alimentazione OPO impostata e immettere 20 per impostare la potenza al minimo per l'allineamento ottico. Quindi, posizionare la piastra di allineamento P1 dietro lo splitter del fascio polarizzante a circa 10 centimetri e posizionare la piastra P2 dietro P1 a circa 30 centimetri sul percorso ottico. Dopo aver aperto l'otturatore del microscopio per il raggio laser a picosecondi, regolare lo specchio M1 per individuare il centro del raggio laser a picosecondi nel foro passante di P1. Utilizzare un telescopio a infrarossi per osservare la posizione del punto del fascio a P1 quando si regola lo specchio M1. Allo stesso modo, regolare lo specchio M2 per posizionare il centro del raggio laser a picosecondi nel foro passante di P2. Utilizzare il telescopio a infrarossi per osservare la posizione del punto del fascio a P2 quando si regola lo specchio M2. Dopo aver regolato gli specchi fino a quando il centro del fascio di picosecondi non si trova nel foro passante di entrambe le piastre di allineamento, chiudere l'otturatore del fascio di picosecondi nel software di controllo del microscopio.
Quindi, aprire l'otturatore del microscopio per il raggio laser a femtosecondi. Regolare lo specchio M3 per posizionare il centro spot del raggio laser a femtosecondi nel foro passante di P1, quindi regolare lo specchio M4 per individuare il centro spot del raggio laser a femtosecondi nel foro passante di P2. Dopo aver regolato gli specchi fino a quando il centro del raggio laser a femtosecondi non si trova nei fori passanti delle due piastre di allineamento, chiudere l'otturatore del microscopio per il raggio di femtosecondi. Quindi, posizionare una telecamera nella posizione dell'obiettivo per visualizzare la posizione dei due punti del fascio e contrassegnare la posizione del raggio della pompa sullo schermo della telecamera come riferimento.
Quindi posizionare una piastra di allineamento P0 prima dell'obiettivo L3 e regolare quella dello specchio ottico utilizzando una chiave esagonale in modo che il centro del fascio di Stokes passi il foro passante della piastra di allineamento alla porta di uscita laser. Utilizzare il telescopio a infrarossi per confermare la posizione del punto del fascio a P0 durante la regolazione. Quindi, rimuovere la piastra di allineamento P0 e utilizzare il tasto esadecimale per regolare lo specchio ottico due in modo che il centro del raggio di Stokes co-localizzi con il segno di riferimento del fascio della pompa sulla telecamera.
Continuare a regolare gli specchi fino a quando il raggio di Stokes non si sovrappone rigorosamente al fascio della pompa sia al piano P0 che a quello della telecamera. Aprire il software di controllo dell'amplificatore lock-in e impostare la lunghezza d'onda del laser della pompa a 796 nanometri e la potenza della pompa e del fascio di Stokes a 50 e 70 milliwatt corrispondenti rispettivamente a 15 e 25 milliwatt sul campione. Quindi utilizzare l'olio d'oliva per l'ottimizzazione della fase dell'amplificatore lock-in.
L'olio d'oliva è sigillato in un vetrino con carta velina attaccata al fondo per migliorare la diffusione del segnale posteriore o il rilevamento EPI-SRS. Posiziona il campione di olio d'oliva sul palco e regola la messa a fuoco dell'obiettivo 25X sul campione. Utilizzando il software di controllo del microscopio, impostare i parametri di imaging come menzionato nel manoscritto di testo.
Quindi, utilizzando il software di controllo dell'amplificatore lock-in, impostare il valore della costante di tempo su 10 microsecondi. Quindi, scansiona il raggio laser sul campione, sintonizzando la fase con una dimensione del passo di 22,5 gradi fino a quando l'intensità del segnale SRS raggiunge il massimo. Quindi eseguire la scansione del campione con l'otturatore laser chiuso, regolando il valore di offset con una dimensione del passo di un millivolt fino a quando il segnale SRS medio è vicino allo zero.
Quindi, apri la finestra di dialogo di gestione dei ritardi nel software di controllo OPO e scansiona l'olio d'oliva, ottimizzando la fase di ritardo fino a quando il segnale SRS dell'olio d'oliva raggiunge il suo massimo. Quindi interrompere la scansione e fare clic sul pulsante Aggiungi dati nella finestra di dialogo di gestione dei ritardi per registrare i dati di ritardo correnti. Dopo aver acquisito in modo simile i dati di ritardo a diversi spostamenti Raman mediante l'imaging di vari campioni chimici, selezionare l'adattamento dei dati nell'ordine cinque nella finestra di dialogo del gestore dei ritardi per adattare i punti dati correnti con la funzione polinomica del quinto ordine.
Quindi applicare i dati adattati facendo clic sul pulsante Usa come personalizzato e selezionando la casella di controllo. Lo stadio di ritardo viene regolato automaticamente a diverse lunghezze d'onda in base alla curva di ritardo montata. Per l'imaging in vivo, fissare il mouse in fase di stabilizzazione con il midollo spinale esposto e immerso in soluzione salina.
Ora montare lo stadio di stabilizzazione su uno stadio a cinque assi sotto il microscopio TPEF-SRS. Quindi fissare la testa del mouse con due barre della testa e abbassare la piastra di tenuta per offrire spazio sufficiente per il movimento del torace durante la respirazione, alleviando gli artefatti di movimento. Quindi, regolare lo stadio di traduzione Z per regolare la messa a fuoco fino a quando l'immagine Brightfield della vascolarizzazione del midollo spinale può essere osservata con un obiettivo 10X.
Individuare la vena dorsale del midollo spinale al centro del campo visivo regolando lo stadio traslazionale a due assi dello stadio a cinque assi. Quindi, sintonizzare gli angoli di rollio e beccheggio dello stadio a cinque assi per regolare la superficie dorsale del midollo spinale perpendicolare all'asse obiettivo in base all'immagine Brightfield. Quindi sostituire il 10X con un obiettivo di immersione in acqua 25X per l'imaging TPEF-SRS.
Per l'imaging SRS, selezionare lo splitter del fascio polarizzatore sopra l'obiettivo premendo il pulsante di commutazione collegato alla pinna motorizzata. Per l'imaging TPEF, selezionare lo specchio dicroico D2 sopra l'obiettivo premendo il pulsante di commutazione collegato alla pinna motorizzata. Infine, impostare i parametri di imaging come descritto nel manoscritto di testo e iniziare la scansione del campione.
L'imaging dual-modale in vivo di assoni YFP scarsamente marcati e guaine mieliniche nel midollo spinale del topo ha rivelato che gli assoni sono strettamente avvolti da uno spesso strato di guaine mieliniche. Come si può vedere nell'immagine del midollo spinale TPEF-SRS, i nodi di Ranvier hanno un diametro assonale ridotto e l'assilome è direttamente esposto alla matrice extracellulare. In combinazione con le nuove sonde per la fluorescenza e l'imaging SRS a fluorescenza eccitata a due fotoni, la microscopia SRS può ottenere l'imaging strutturale e funzionale simultaneo di varie biomolecole, facilitando la nostra comprensione di processi biologici complessi.
