פרוטוקול זה משווה בין שתי טכניקות פיזור ראמאן הקוהרנטיות ההיפר-ספקטרליות הנפוצות ביותר, כולל פיזור רמאן קוהרנטי נגד סטוקס ותהליכי פיזור ראמאן המגורים, וזה מאפשר לביולוגים לבחור את שיטת ההדמיה הטובה ביותר עבור היישומים הביולוגיים שלהם. באמצעות חתימות הרטט הפנימיות, ספקטרוסקופיית ראמאן קוהרנטית מסוגלת למפות מידע כימי ודגימות ביולוגיות ללא צורך בתיוג אקסוגני. מיקרוסקופיית ראמאן קוהרנטית הרחיבה את הבנתנו לגבי חילוף החומרים התאי, מיפוי, התפלגות תרופות, אבחון מחלות וכימות שינויים כימיים.
זוהי טכניקה הדורשת הכשרה מספקת הן באופטיקה והן בספקטרוסקופיה. הייתי ממליץ לקרוא כמה מאמרי ביקורת ולהיות מאומן על ידי מומחה לפני השימוש בטכניקה זו. כדי להתחיל, הכינו את שקופיות ההדמיה על ידי הנחת פיסת סרט דו-צדדי על פתק כיסוי וחתכו צורה מלבנית קטנה של הקלטת מאמצע הקלטת כדי ליצור שטח פתוח להנחת הדגימה.
פיפטה 1 עד 2 מיקרוליטרים של DMSO טהור ולחלק את הטיפה במרכז הפנוי. הניחו בזהירות את החלקת הכיסוי העליונה והניחו בעדינות את קצוות החלקות הכיסוי כדי לאטום את התא תוך הקפדה על כך שדגימת ה-DMSO אינה יוצרת קשר עם קצות הקלטת. לניסויים ברגישות, הכינו דילולים סדרתיים של DMSO בתחמוצת דאוטריום כדי לתת טווח ריכוזים של 50 עד 0% קחו 1 עד 2 מיקרוליטרים של כל תמיסה והכינו דגימות לחוצות כפי שהוכח קודם לכן.
הניחו את הדגימה על במת המיקרוסקופ והוסיפו מים או שמן טבילה במידת הצורך לעדשה או למעבה האובייקטיביים. הזיזו כראוי את קצה טיפת ה-DMSO בשדה הראייה והתאימו את העדשה האובייקטיבית למיקוד הטוב ביותר, ואז מרכזו את המעבה בשיטת התאורה של קולר ופתחו את הסרעפת במלואה על המעבה. לאחר מכן, כוונן את אורך הגל של קרן המשאבה ל-800 ננומטר כדי לכוון לשיא CH3 של מספר הגלים 2913 והגדר את ההספק של המשאבה ושל קרן סטוקס לכ-30 מילי-וואט לפני המיקרוסקופ על-ידי התאמת לוחית חצי הגל.
עבור SRS, הגדר את רווח מגבר הנעילה לכ- 10 עם קבוע זמן של 7 מיקרו-שניות, מה שמבטיח שקבוע הזמן קטן מזמן השהייה של הפיקסלים. הגדר את הפרמטרים של רכישת התמונה ואת תוכנת הרכישה באמצעות מספר פיקסלים של 200 על 200 עם גודל סריקה של כ- 100 על 100 מיקרומטרים רבועים, וודא שהתמונה מכילה גם את טיפת ה- DMSO וגם שטח ריק, ולאחר מכן סרוק את הדגימה ובדוק את התמונה על מסך המחשב. לאחר מכן, סרוק את תמונת ההשהיה הממונעת בקרן המשאבה של סטוקס תוך ניטור התמונות בזמן אמת וסרוק את ההשהיה עד למקסימום האות.
הזז את טיפת ה- DMSO כדי לכסות את כל שדה הראייה ובדוק אם אות ה- DC המרבי ממורכז בתמונה מכיוון שהאות תלוי בקרן משאבה. התאם את מיקום אלומת המשאבה באמצעות מראה או את היסט המתח בתוכנת ההדמיה. לאחר אופטימיזציה של DC, התאם את מראות הקרן של סטוקס עד למקסימום אות AC על ידי התאמת ערך הסף כך שיציג כ-50% רוויה תוך בדיקה שהרוויה ממורכזת בתמונה.
אם לא, כוונו את המראות רק בקרן סטוקס ונטרו את האות במהלך היישור כמשוב בזמן אמת על איכות היישור. לניתוח SNR, פתח את תוכנת ImageJ ויבא את קובץ הטקסט לדוגמה DMSO שנשמר על-ידי לחיצה על קובץ, ולאחר מכן ייבוא, ואחריו על תמונות טקסט ופתח אפשרויות מהתפריט הנפתח. לאחר ייבוא התמונה, לחץ על Control Shift C כדי להציג את הפונקציה בהירות וניגודיות, ולאחר מכן לחץ על לחצן אוטומטי בפונקציה בהירות וניגודיות עד שהאזור של דוגמת DMSO ייראה רווי כדי למצוא את אות הדגימה המרבי.
לאחר מכן, לחץ על כלי הבחירה הסגלגל בממשק ImageJ והסמן אזור קטן באזור DMSO הרווי. לאחר הסימון, הקש M כדי למדוד את הממוצע וסטיית התקן של האזור שנבחר. למדידת הרקע, התאם את הסרגלים בפונקציה בהירות וניגודיות עד שניתן יהיה להבחין באות האזור הריק, ולאחר מכן לחץ על הבחירה הסגלגלה והדגש אזור ברקע, כדי להבטיח שהאזור שנבחר אינו מכיל DMSO.
לאחר מכן, לחץ על M כדי למדוד את הנתונים הסטטיסטיים של האזור שנבחר. לאחר מכן, חשב את ה- SNR כפי שהודגם קודם לכן על ידי מדידת ערך ממוצע הרעש והערך הממוצע לאות יחד עם סטיית התקן. כדי לעבד את תמונות ה- CRS ההיפרספקטרליות, יבא את קובץ הטקסט על-ידי לחיצה על קובץ ולאחר מכן ייבוא, תמונת טקסט והאפשרות פתיחה מהתפריט הנפתח.
לאחר הייבוא, לחץ על תמונה, לאחר מכן על מחסניות, ולאחר מכן על כלים ומונטאז' כדי לעדכן אפשרויות כדי להמיר את הקובץ לערימת תמונות, ולאחר מכן גלול במונטאז' עד שפסגת ה- DMSO הראשונה תהיה גלויה. בחר אזור ב- DMSO ולחץ על תמונה, ואחריו אפשרויות פרופיל של ציר מחסנית ו- Plot Z כדי להתוות את העוצמה לעומת ספקטרום מספרי המסגרות. לאחר מכן, לחץ על רשימה והעתק את נתוני הפרופיל כדי לחלץ את הנתונים הספקטרליים הגולמיים.
כדי להמיר את הספקטרום המשוחזר ליחידות תדרים, בצע רגרסיה ליניארית באמצעות CH סימטרי ואסימטרי הנמתח מ- DMSO ומספרי המסגרות המתאימים להם. הרזולוציה הספקטרלית של ה-DMSO נמדדה באמצעות מיקרוסקופיה היפרספקטרלית של SRS ו-CARS, המציגה רזולוציה של 14.6 ו-17.1 מספר גלים בהתאמה, מה שמצביע על כך של-SRS יש רזולוציה ספקטרלית טובה יותר. ספקטרום DMSO SRS הושג בריכוזים של 0.1 ו-0.01%, בהם ניתן לפתור את השיא במספר הגלים 2913 בראשון, אך לא באחרון, מה שמצביע על כך שמגבלת הגילוי היא בין 0.1 ל-0.01% DMSO.
ספקטרום המכוניות המוחזרות פאזה מראה כי ניתן לפתור בבירור את שיא מספר הגלים DMSO 2913 עבור 0.1% DMSO, אך לא את 0.01% המציין מגבלת זיהוי בין שני ריכוזים אלה. פרופילי עוצמת SRS ו-CARS של תא MIA PaCA-2 הראו כי אות ה-SRS נתן רזולוציה של 398.6 ננומטר, בעוד שאות CARS נתן רזולוציה טובה פי 1.2 של 330.3 ננומטר. תמונות ה-SRS וה-CARS מתאי MIA PaCa-2 במיקומי השהיה אופטיים שונים מציגות את האותות החזקים ביותר עם טיפות שומנים כנקודות בהירות עבור SRS, בעוד של-CARS יש ניגודים מופחתים בהרבה.
עם זאת, תזוזה אדומה של 37 גלים במיקוד הספקטרלי שיפרה את ניגודי השומנים הן עבור SRS והן עבור CARS. ספקטרום ה-SRS מראה אות חזק בהרבה ב-2850 wavenumber עבור טיפות שומנים מאשר אברונים אחרים, בעוד שספקטרום ה-CARS מראה תזוזה אדומה קטנה. כדי לייעל את אות הפיזור הקוהרנטי של ראמאן, תחילה מצא את מוקד הדגימה, לאחר מכן כוונן את ההשהיה האופטית, ולבסוף, כוונן את המראות עד להשגת מקסימום.
טכנולוגיות אחרות של משאבה-בדיקה, כגון ספיגה חולפת, משולבות מטבען בפלטפורמת CRS. טכנולוגיה זו חזקה מאוד למדידת קינטיקה של קליטה של אור חזק הקולע מולקולות שאינן פלואורסצנטיות. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לראות מולקולות קטנות באופן נטול תוויות עם פעילות גבוהה של תאים כימיים.
הוא גם מאפשר לחוקרים לראות שינויים בחילוף החומרים של השומנים, בדינמיקה התוך-תאית ובהפצת התרופות.
