Las imágenes in vivo de tejidos biológicos con resolución subcelular y especificidad química son una herramienta poderosa para comprender los procesos dinámicos involucrados en el metabolismo celular, la respuesta inmune y la remodelación de tejidos. Con la fluorescencia combinada de dos fotones y la microscopía de dispersión Raman estimulada, la información bioquímica y biofísica crítica de los tejidos biológicos se puede adquirir desde múltiples perspectivas con resolución subcelular. Específicamente, esta microscopía de doble modal se puede utilizar para obtener imágenes de la dinámica celular y las interacciones en la médula espinal del ratón para estudiar la progresión de las enfermedades neurodegenerativas y la lesión de la médula espinal.
Para comenzar, encienda el láser de zafiro de titanio cambiando el interruptor de la tecla de la posición de espera a la de encendido y espere 30 minutos para que el láser se caliente. Luego encienda el OPO haciendo clic en el botón de inicio en el panel de control de OPO y espere 20 minutos para que el láser se caliente. Después de que el láser de picosegundos se caliente, verifique la profundidad de modulación del haz stokes reduciendo la potencia del haz Stokes a aproximadamente 20 milivatios, abriendo el obturador láser para el haz Stokes y colocando un fotodetector de alta velocidad en la salida OPO para detectar el haz.
A continuación, conecte el puerto de salida del fotodetector al puerto de entrada de un osciloscopio utilizando un cable coaxial con un conector BNC para monitorear el pulso láser. Luego abra la ventana de control de EOM en el software de control OPO y ajuste la potencia y la fase de EOM de acuerdo con el diagrama de intensidad de pulso que se muestra en el osciloscopio para lograr la profundidad máxima de modulación a 20 megahercios. En el software de control OPO, abra el obturador láser de la bomba mientras detiene la salida de Stokes.
A continuación, haga clic en el cuadro de configuración de señal para establecer la longitud de onda del haz de la bomba en 796 nanómetros, luego haga clic en el cuadro de potencia OPO establecido e ingrese 20 para establecer su potencia al mínimo para la alineación óptica. A continuación, coloque la placa de alineación P1 detrás del divisor de haz polarizador a unos 10 centímetros y coloque la placa P2 detrás de P1 a unos 30 centímetros en la trayectoria óptica. Después de abrir el obturador del microscopio para el rayo láser de picosegundos, ajuste el espejo M1 para ubicar el centro del rayo láser de picosegundos en el orificio pasante de P1. Utilice un visor infrarrojo para observar la posición del punto del haz en P1 al ajustar el espejo M1. Del mismo modo, ajuste el espejo M2 para ubicar el centro del rayo láser de picosegundos en el orificio pasante de P2. Utilice el visor infrarrojo para observar la posición del punto del haz en P2 al ajustar el espejo M2. Después de ajustar los espejos hasta que el centro del haz de picosegundos se localice en el orificio pasante de ambas placas de alineación, cierre el obturador del haz de picosegundos en el software de control del microscopio.
A continuación, abra el obturador del microscopio para el rayo láser de femtosegundo. Ajuste el espejo M3 para ubicar el centro del punto de haz láser de femtosegundo en el orificio pasante de P1, luego ajuste el espejo M4 para ubicar el centro del punto de haz láser de femtosegundo en el orificio pasante de P2. Después de ajustar los espejos hasta que el centro del rayo láser de femtosegundos se localice en los orificios pasantes de las dos placas de alineación, cierre el obturador del microscopio para el haz de femtosegundos. A continuación, coloque una cámara en la posición del objetivo para visualizar la ubicación de los dos puntos de haz y marque la posición del haz de la bomba en la pantalla de la cámara como referencia.
Luego coloque una placa de alineación P0 antes de la lente L3 y ajuste el espejo óptico usando una llave hexagonal para que el centro del haz stokes pase el orificio pasante de la placa de alineación en el puerto de salida láser. Utilice el visor infrarrojo para confirmar la posición del punto del haz en P0 durante el ajuste. A continuación, retire la placa de alineación P0 y use la tecla hexagonal para ajustar el espejo óptico dos para que el centro del haz stokes se colocalice con la marca de referencia del haz de la bomba en la cámara.
Siga ajustando los espejos hasta que el haz de Stokes se superponga estrictamente con el haz de la bomba tanto en P0 como en los planos de la cámara. Abra el software de control del amplificador de bloqueo y ajuste la longitud de onda del láser de la bomba a 796 nanómetros y la potencia de la bomba y el haz stokes a 50 y 70 milivatios correspondientes a 15 y 25 milivatios en la muestra, respectivamente. Luego use aceite de oliva para la optimización de la fase del amplificador de bloqueo.
El aceite de oliva se sella en un portaobjetos con papel de seda unido a la parte inferior para mejorar la dispersión de la señal o la detección EPI-SRS. Coloque la muestra de aceite de oliva en el escenario y ajuste el enfoque del objetivo 25X en la muestra. Usando el software de control del microscopio, establezca los parámetros de imagen como se menciona en el manuscrito de texto.
Luego, utilizando el software de control del amplificador de bloqueo, establezca el valor de la constante de tiempo en 10 microsegundos. A continuación, escanee el rayo láser sobre la muestra, ajustando la fase con un tamaño de paso de 22,5 grados hasta que la intensidad de la señal SRS alcance el máximo. Luego escanee la muestra con el obturador láser cerrado, ajustando el valor de desplazamiento con un tamaño de paso de un milivoltio hasta que la señal SRS promedio esté cerca de cero.
A continuación, abra el cuadro de diálogo del administrador de retrasos en el software de control OPO y escanee el aceite de oliva, ajustando la etapa de retraso hasta que la señal SRS del aceite de oliva alcance su máximo. Luego detenga el escaneo y haga clic en el botón Agregar datos en el cuadro de diálogo del administrador de retrasos para registrar los datos de retraso actuales. Después de adquirir datos de retardo de manera similar en diferentes turnos Raman mediante la obtención de imágenes de varias muestras químicas, seleccione el ajuste de datos en el orden cinco en el cuadro de diálogo del administrador de retardo para ajustar los puntos de datos actuales con la función polinómica de quinto orden.
Luego aplique los datos ajustados haciendo clic en el botón usar como personalizado y marcando la casilla de verificación. La etapa de retardo se ajusta automáticamente a diferentes longitudes de onda de acuerdo con la curva de retardo ajustada. Para obtener imágenes in vivo, fije el ratón en la etapa de estabilización con su médula espinal expuesta e inmersa en solución salina.
Ahora monte la etapa de estabilización en una etapa de cinco ejes debajo del microscopio TPEF-SRS. Luego asegure la cabeza del mouse con dos barras de cabeza y baje la placa de sujeción para ofrecer suficiente espacio para el movimiento del pecho durante la respiración, aliviando los artefactos de movimiento. A continuación, ajuste la etapa de traducción Z para ajustar el enfoque hasta que la imagen de Brightfield de la vasculatura de la médula espinal se pueda observar bajo un objetivo 10X.
Localice la vena dorsal de la médula espinal en el centro del campo de visión ajustando la etapa de traslación de dos ejes de la etapa de cinco ejes. A continuación, ajuste los ángulos de balanceo y cabeceo de la etapa de cinco ejes para ajustar la superficie dorsal de la médula espinal perpendicular al eje objetivo en función de la imagen de Brightfield. Luego reemplace el 10X con un objetivo de inmersión en agua 25X para imágenes TPEF-SRS.
Para obtener imágenes SRS, seleccione el divisor de haz polarizador sobre el objetivo presionando el botón del interruptor conectado a la aleta motorizada. Para las imágenes TPEF, seleccione el espejo dicroico D2 sobre el objetivo presionando el botón del interruptor conectado a la aleta motorizada. Finalmente, establezca los parámetros de imagen como se describe en el manuscrito de texto y comience a escanear la muestra.
Las imágenes dual-modales in vivo de axones YFP escasamente marcados y vainas de mielina en la médula espinal del ratón revelaron que los axones están estrechamente envueltos por una gruesa capa de vainas de mielina. Como se puede ver en la imagen de la médula espinal TPEF-SRS, los ganglios de Ranvier han disminuido el diámetro axonal y la axilemma está directamente expuesta a la matriz extracelular. Combinado con nuevas sondas para fluorescencia y srS de imágenes de dos fotones excitados la microscopía SRS puede lograr imágenes estructurales y funcionales simultáneas de varias biomoléculas, facilitando nuestra comprensión de procesos biológicos complejos.
