Le malattie cardiovascolari rimangono la prima causa di morte in tutto il mondo. I modelli tradizionali in vitro si basano sulla coltura monostrato. Tuttavia, il cuore, in particolare il muscolo cardiaco o il miocardio, è complesso nella sua anisotropia 3D e nella composizione cellulare.
Pertanto, è fondamentale migliorare la complessità della composizione tissutale all'interno dei modelli in vitro per imitare meglio sia i costituenti cellulari che la struttura del miocardio. Qui in questo lavoro, dimostriamo un protocollo per lo sviluppo di un tessuto cardiaco umano derivato da cellule staminali mature 3D all'interno di un nuovo dispositivo microfluidico. Questo dispositivo incorpora un canale tissutale principale 3D con micropost ellittici innati che inducono alti gradi di allineamento delle cellule cardiache incapsulate idrogel circostanti.
Il canale principale è affiancato da canali multimediali con porte di iniezione che consentono una diffusione dei nutrienti in tutto il tessuto. A causa della cura necessaria nella gestione dei dispositivi microfluidici, la rappresentazione visiva di questo protocollo è utile per stabilire correttamente il tessuto cardiaco 3D all'interno di un dispositivo microfluidico con micropost incorporati per un migliore allineamento dei tessuti. Per dissociare il fibroblasto cardiaco umano, estraere prima il pallone dall'incubatrice.
Mettere all'interno dell'armadio di biosicurezza e iniziare ad aspirare i supporti spesi dal pallone. Quindi prendere tre ML di PBS 1X per lavare il pallone. Chiudere il cappuccio e ruotare il pallone in modo che il fondo sia rivestito correttamente in PBS.
Aspirare il PBS. Prendere tre ML di tripina di 37 gradi e aggiungere al pallone. Quindi inclinare il pallone e ruotare in modo che il fondo sia interamente rivestito.
Quindi mettere nell'incubatrice per quattro o sei minuti. Neutralizzare la tripina con FGM3 prendendo tre LMR e aggiungendolo al pallone. Pipettare la soluzione su e giù per spostare tutte le cellule che rimangono sul retro del pallone.
Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo Falcon da 15 ML. Prendi 10 microlitri della sospensione cellulare e dispensa in un emocitometro per contare le cellule con un microscopio. Centrifugare la sospensione cellulare a 250 G per quattro minuti.
Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante facendo attenzione a non disturbare il pellet cellulare. Rimorsi il pellet di cellule con FGM3 fresco per realizzare i 75 milioni di celle desiderati per sospensione ML. Rimorsi le celle, quindi impostare il tubo verso il basso con un cappuccio liberamente montato.
Per dissociare i cardiomiociti, estraere il piatto dall'incubatrice e aspirare il supporto. Prendi sei ML di PBS e lava i pozzi in modo che ci sia una ML di PBS in ogni pozzo. Aspirare il PBS, facendo attenzione a non disturbare le cellule attaccate alla piastra.
Aggiungere sei ML di trypLE Express riscaldato in modo che ci sia una ML in ogni pozzo di una piastra a sei po pozza. Incubare le cellule con il tripLE per 10 minuti. Dopo 10 minuti, neutralizza il trypLE con sei ML di RPMI più B27 più insulina in modo da aggiungere una ML di RMPI a ciascun pozzo.
Utilizzare una pipetta ML per raccogliere la soluzione e colpirla contro la parte posteriore dei pozzi per assicurarsi che tutte le celle siano tolte. Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo Falcon da 15 ML. Centrifugare il tubo a 300 G per tre minuti.
Dopo la centrifugazione, aspirare il supporto e il triplo. Questo passaggio è importante per lavare i cardiomiociti sensibili. Questo passaggio assicura che tutto il triplo sia sparito nella formazione di tessuto cardiaco 3D.
Rimossare il pellet cellulare in cinque ML di RPMI più B27 più insulina. Utilizzare una pipetta ML per pipettare la soluzione su e giù per garantire una sospensione cellulare omogenea. Prendi 10 microlitri della sospensione cellulare per il conteggio con l'emocitometro.
Centrifugare le cellule a 300 G per tre minuti. Aspirare i supporti dopo la centrifugazione per la seconda volta. Aggiungere la quantità appropriata di RPMI più B27 più insulina per ottenere 75 milioni di cellule per sospensione ML, quindi rimorsi.
Per preparare la soluzione di collagene per l'incapsulamento, avere tutti i reagenti su una ghiacciaia nel cappuccio. Quindi prendi 75 microlitri del collagene stock. Il collagene è molto viscoso, quindi lentamente assorbimento con la pipetta, quindi erogare in un tubo di microcentrifugo sul ghiaccio.
Assumere 13,85 microlitri di RPMI e aggiungere al collagene nel tubo Falcon. Quindi prendere 10 microlitri di rosso fenolo e aggiungere alla miscela su ghiaccio e resuspend. Infine, prendere 1,15 microlitri di un naoh normale e aggiungere alla sospensione per neutralizzare.
Quindi prendere una punta di pipetta da 200 microliter e rimodere la sospensione. Il prossimo passo è l'incapsulamento delle cellule all'interno del metrogel di collagene. Quindi prendere un'aliquota di otto microlitri di MACCHINE e aggiungere a un tubo Falcon fresco sul ghiaccio.
Quindi prendere due microlitri di CS e aggiungere a quella miscela cellulare. Rimosi la sospensione cellulare e afferra 5,6 microlitri della sospensione cellulare e metti in un tubo Falcon fresco. Quindi prendi il collagene che hai appena preparato, prendi quattro microlitri del collagene, quindi prendi 2,4 microlitri di metrogel.
Pipettare la miscela su e giù per garantire una distribuzione omogenea della sospensione dell'idrogel cellulare. Una volta preparata l'iniezione di gel, è possibile inserire nei dispositivi. Prendi un nuovo consiglio e resuspend.
Prendi la piastra di Petri dei dispositivi, inserisci la punta nella porta di iniezione e inietta lentamente e costantemente. Vedrai come il canale del dispositivo si riempie con la sospensione dell'idrogel cellulare. Una volta riempita l'altra porta, interrompere l'iniezione e rimuovere la punta.
Dopo l'iniezione, capovolgere i dispositivi con una pinzetta e posizionare all'interno della piastra di Petri più grande con acqua nell'incubatrice per nove minuti. Dopo nove minuti, eserti i dispositivi dall'incubatore e capovolgere in posizione verticale, quindi riposizionare nell'incubatore per altri nove minuti per completare la polimerizzazione dell'idrogel. Ora è il momento di aggiungere i media.
Quindi, prendi RMPI più B27 e inserisci la punta nella porta multimediale e inizia a spingere lentamente. Quindi fallo sulla porta multimediale opposta. Potresti scoprire che il supporto non sta iniettando, quindi puoi mettere una goccia di supporto sopra la porta e quindi prendere la pipetta e usare la pressione negativa per tirare il supporto dall'altro lato.
Quindi vedrai come i media iniziano a essere tirati attraverso il canale. Una volta che i supporti sono stati aggiunti a tutti i canali multimediali, i dispositivi verranno rimetteti nell'incubatore a 37 gradi. Il dispositivo microfluidico è mostrato nell'angolo in alto a sinistra.
Ai giorni uno, sette e 14 della cultura viene mostrata questa immagine. Dopo 14 giorni di coltura, le cellule dovrebbero condensarsi in strutture altamente allineate che si formano intorno ai micropost. Tracce del giorno 14 sono mostrate qui in C di contrazione spontanea, così come immagini immunofluorescenti di actina macchiata e tessuti macchiati di marcatori cardiaci.
Ciò che dovrebbe essere visto sono fibre di actina altamente allineate che si formano dopo 14 giorni in coltura, così come sarcomeres maturi striati paralleli e giunzioni gap localizzate. Durante questa procedura, è fondamentale mantenere tutti i materiali a basse temperature sul ghiaccio durante l'iniezione di idrogel cellulare per prevenire la polimerizzazione prematura. I dispositivi microfluidici devono essere maneggiati con cura, sia durante la fabbricazione, l'iniezione, sia la coltura estesa dei tessuti.
Le iniezioni cellulari dovrebbero essere un processo costante per garantire che l'intero canale si sia riempito mentre viene eseguito rapidamente per prevenire la polimerizzazione prematura o l'essiccazione dell'idrogel prima dell'aggiunta del supporto.
