Questo protocollo ci consente di creare una complessa struttura 3D che ricorda da vicino il cuore umano in via di sviluppo in un modo semplice ed economico, che è riproducibile attraverso le linee cellulari. Consiste in un unico protocollo con tre fasi di differenziazione, che dà origine a tutti i tipi di cellule del cuore, comprese le camere e una rete vascolare. Questa tecnica ci consente di modellare una vasta gamma di malattie cardiovascolari umane e di selezionare trattamenti farmacologici efficaci.
Grazie alla natura ad alta produttività del suo design. Questo metodo è utile per studiare il cuore umano in via di sviluppo e le malattie comunemente associate ad esso. Uno di questi sono difetti cardiaci congeniti.
Questo protocollo richiede competenze di base per la coltura cellulare. Raccomandiamo un pipettaggio attento e delicato e una manipolazione delicata degli organoidi. Inizia creando corpi embrioidi o EB due giorni prima della differenziazione.
Lavare HPSC subconfluenti con DBPS per almeno 10 secondi. Quindi aspirare il DPBS. Aggiungere un millilitro di ACUTA a temperatura ambiente e picchiettare delicatamente la piastra circa cinque volte al minuto per tre-cinque minuti per indurre il distacco, controllando al microscopio.
Quindi aggiungere un millilitro di mezzo PSC e Thias Avin o Thias per fermare la reazione. Pipettare il mezzo su e giù nel pozzo, due o tre volte per generare una singola sospensione cellulare e raccogliere le cellule. Quindi trasferire la sospensione a cella singola in un tubo centrifuga e girare per cinque minuti a 300 volte G.Aspirare il surnatante e ri-spendere le cellule in un millilitro di mezzo PSC e Thias.
Diluire le cellule in DPBS. Contare le cellule usando un contatore cellulare o un cistometro emodale e diluire le cellule in mezzo PSC con Thias ad una concentrazione di 100.000 cellule per millilitro. Aggiungere 100 microlitri di sospensione di celle diluite a ciascun pozzetto di una piastra a fondo rotondo ultra basso da 96 pozzetti.
Centrifugare la piastra a 100 volte G per tre minuti e incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo 24 ore rimuovere con cura 50 microlitri di mezzo da ciascun pozzetto e aggiungere 200 cucciolate di terreno PSC fresco, caldo a 37 gradi Celsius per un volume di 250 microlitri per pozzetto. Incubare le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Rimuovere 166 microlitri o due terzi del mezzo da un lato di ciascun pozzetto e aggiungere 166 microlitri di RPMI 1640 contenenti integratore B27 senza insulina, sei 990211 di allegria micromolare, 0,875 nanogrammi per millilitro di proteina morfogenetica ossea quattro e 1,5 nanogrammi per millilitro di Activin A.Incubate per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo 24 ore rimuovere 166 microlitri di mezzo da un lato di ciascun pozzetto e aggiungere 166 microlitri di RPMI 1640 fresco con supplemento di B27 senza insulina. Incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Per indurre la specifica del mesoderma cardiaco il secondo giorno, rimuovere 166 microlitri di mezzo da ciascun pozzetto e aggiungere 166 microlitri di RPMI 1640, contenenti integratore B27 senza insulina e tre micromolari Wnt-C59 e continuare l'incubazione per 48 ore. Il quarto giorno, rimuovere 166 microlitri di mezzo da ciascun pozzetto e aggiungere 166 microlitri di RPMI 1640 fresco con integratore di B27 senza insulina, quindi incubare altre 48 ore. Il sesto giorno, rimuovere 166 microlitri di mezzo da ciascun pozzo e aggiungere 166 microlitri di RPMI 1640 con supplemento B27.
Per questo e tutti i successivi cambiamenti dei media, utilizzare il supplemento B27 con insulina, incubare per altre 24 ore. Il settimo giorno, la coltura cellulare è pronta per la differenziazione pro epicardica. Rimuovere 166 microlitri di mezzo da ciascun pozzetto e aggiungere 166 microlitri di RPMI 1640 fresco contenente supplemento B27 e tre cheer micromolari 99021.
Quindi in incubazione per un'ora, dopo un'ora rimuovere la piastra dall'incubatore, rimuovere 166 microlitri di mezzo da un lato di ciascun pozzetto e aggiungere 166 microlitri di RPMI 1640 fresco contenente integratore B27 continuare l'incubazione per altre 48 ore. Ripeti questo processo ogni 48 ore fino al ritiro. Gli organoidi sono pronti per analisi e sperimentazioni il giorno 15 Per trasferire l'intero organoide, tagliare la punta di una pipetta P200, da cinque a 10 millimetri dall'apertura con un diametro di circa due o tre millimetri.
Premere lo stantuffo della pipetta e inserire la punta verticalmente nel pozzetto del fondo rotondo con l'organoide. Assorbire circa 100-200 microlitri di mezzo sufficiente per raccogliere gli organoidi e trasferirli alla destinazione target. Prima che gli EBS di differenziazione appaiano come masse sferiche nere, il processo di differenziazione inizia il giorno zero con l'attivazione di un percorso Wnt e l'aggiunta del fattore di crescita per esattamente 24 ore.
Inoltre la modifica di Wnt C59 il secondo giorno comporta l'allargamento dell'organoide da circa 200 micrometri a un massimo di un millimetro. Gli organoidi cardiaci umani hanno iniziato a battere già il sesto giorno e il 100% degli organoidi ha mostrato un battito visibile entro il giorno 10. Le immagini ad alto ingrandimento dell'organoide del settimo giorno hanno rivelato che la maggior parte delle cellule che esprimono la mano uno erano cardiomiociti in origine e la mano due erano cellule non miosite dal secondo Heartfield, cellule progenitrici.
I trascritti di RNA sia per la mano uno che per la mano due sono stati espressi dal terzo giorno in poi nei dati di sequenziamento dell'RNA. I marcatori FHF sono stati altamente espressi durante i giorni tre e 11 mentre il marcatore SF è stato più altamente espresso dopo il giorno 13. La colorazione di immunofluorescenza ha rivelato la presenza di vari lignaggi di cellule cardiache umane che compongono il cuore umano.
Come il tessuto miocardico ed epicardico, le cellule endocardiche, le cellule endoteliali e i fibroblasti cardiaci. I marcatori che esprimono le linee cellulari di cui sopra sono stati osservati anche nei profili di espressione genica dell'RNA SAC. L'imaging del calcio vivo di singole cellule in organoidi interi è stato utilizzato per misurare la funzione elettrofisiologica degli organoidi.
L'intensità di fluorescenza del fluo-4 variava nel tempo a causa dell'uscita di ingresso del calcio dalla cellula che rivela potenziali d'azione regolari. Le mappe di calore che mostrano le intensità di calcio su una regione ad alto ingrandimento dell'organoide, mostrano una maggiore intensità dovuta ai transitori di calcio e alle singole cellule. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che gli EB e gli organoidi successivi non sono attaccati al fondo della piastra e ci sposteremo con la rimozione oltre ai supporti che richiedono modifiche attente ai supporti.
Gli organoidi possono essere coltivati per periodi di tempo più lunghi introdotti alle tecniche di maturazione, o anche esposti a stimoli esterni, come il condizionamento meccanico o elettrico, e persino fattori di stress come le tossine. Questa tecnica consente l'accesso a stadi di sviluppo del cuore fetale umano che sono altrimenti inaccessibili nella ricerca, aprendo la strada a nuove intuizioni sullo sviluppo del cuore e sull'eziologia della malattia.
