L'obiettivo di questa procedura è misurare l'attività enzimatica dei singoli membri della famiglia delle proteine arginina metiltransferasi nelle cellule. L'attività viene misurata determinando i loro livelli di metilazione dell'arginina e i livelli totali di proteina bio-marcatore utilizzando l'assorbimento occidentale fluorescente quantitativo. Il vantaggio del metodo descritto è la semplice performance in qualsiasi laboratorio con coltura cellulare e capacità fluorescenti western blot.
Le linee guida dettagliate riguardanti bio-marcatori, anticorpi e inibitori due composti sono fornite nell'articolo. E qui abbiamo descritto i passaggi cruciali coinvolti nella procedura sperimentale. E la procedura è mostrata per il formato 24 bene.
In primo luogo, preparare il tampone di lisi, aggiungere benzonasi e cocktail inibitore proteico appena prima dell'uso. Rimuovere tutti i supporti dai pozzi. Lavare con PBS a 100 microlitri e aggiungere al pozzo 60 microlitri di tampone dilisi.
Incubare per un minuto a temperatura ambiente, dondolando le piastre per distribuire il tampone di lisi sulle cellule. Quindi aggiungere tre microlitri del 20%SDS per trovare una concentrazione dell'1% e mescolare con tremori delicati. Trasferire il lysate in tubi Eppendorf e tenerlo sul ghiaccio.
Determinare la concentrazione proteica dei campioni utilizzando il kit di dosaggio delle proteine BCA o utilizzare qualsiasi altro modo che tolleri l'1%SDS in soluzione. Dopo aver regolato la concentrazione proteica con tampone di lysis in modo che sia uguale tra i campioni a 20 microlitri di quattro volte il buffer di carico a 60 microlitri di litolato cellulare e il calore a 95 gradi per cinque minuti. L'aggiunta della benzonasi al tampone di lysis idrolizza rapidamente gli acidi nucleici, che riducono la viscosità del glisato cellulare.
I lussati con benzonasi non sono viscosi. I lisati senza benzonasi hanno un grande glob di DNA gooey che non si pelletterà quando viene filato. Caricare da cinque a 20 microgrammi di llysato cellulare totale per le proteine istone e da 20 a 100 microgrammi per altre proteine in un gel proteico gradiente da quattro a 12 bis-tris.
Intorno alla gelatina in mps come tampone circostante per circa due ore a 100 volt, o fino a quando il colorante di carico blu raggiunge il fondo del gel. Se si esegue un trasferimento a umido, assemblare il sandwich di trasferimento nel tampone di trasferimento tris-glicina ghiacciato. Attivare la membrana PVDF immergendosi in metanolo e gel equilibrato nel tampone di trasferimento per 30 secondi prima dell'assemblaggio.
Posizionare la carta da filtro delle spugne, la membrana PVDF e il gel secondo le istruzioni del produttore. Trasferire le proteine in tampone di trasferimento di tris-glicina a 70 volt per una o una e mezza ora sul ghiaccio. Dopo il trasferimento, incubare la membrana per 30 minuti nel tampone di blocco.
Risciacquare con tampone di lavaggio e incubare con anticorpi primari durante la notte a quattro gradi. Il giorno successivo, lavare la membrana tre volte per cinque minuti con tampone di lavaggio, incubare con anticorpi secondari etichettati fluorescentmente per 30 minuti a temperatura ambiente e lavare tre volte per cinque minuti con tampone di lavaggio. Posizionare la membrana a faccia in giù sulla lastra di vetro dell'imager fluorescente western blot.
Coprire con il foglio di gomma e rimuovere eventuali bolle d'aria. Leggi il segnale a 700 e 800 nanometri. Una volta terminata la scansione, vai all'immagine e regola il segnale a 700 e 800 canali per vedere chiaramente le bande.
Qui il segnale a 700 canali mostrato come rosso rappresenta i livelli proteici totali, e il segnale a 800 canali mostrato come verde rappresenta i livelli di proteina metilata. Passare quindi all'analisi e selezionare la lettura mediana superiore e inferiore. Per misurare l'intensità delle bande, selezionare lo strumento disegno rettangolo e disegnare la forma attorno alle bande che si desidera quantificare.
Vai alle forme in cui trovi intensità di 700 e 800 canali. La colonna chiamata segnale fornisce livelli di intensità con sfondo sottratto. I risultati possono essere copiati direttamente nel file excel.
Ecco l'esempio che mostra l'analisi dell'attività di PRMT1 nelle cellule inibizione con inibitore prmt di tipo uno MS023. L'attività di PRMT1 viene misurata determinando i livelli di dimetilazione asimmetrica dell'istono H4 arginina 3. Qui, i livelli di metilazione, le bande verdi svengono in modo dipendente dalla dose, mentre i livelli totali di istoni le bande rosse rimangono invariate.
Per determinare il composto IC50, tracciare il logaritmo della concentrazione dell'inibitore contro i livelli di dimetilazione asimmetrica dell'istone H4 arginina-3 normalizzati a livelli istoni totali seguiti da un'analisi non lineare della vestibilità. Il metodo descritto consente una doppia rilevazione responsabile e riproducibile dell'attività della proteina metiltransferasi nelle cellule. Il vantaggio del metodo è che utilizza una ben nota metodologia western blotting accessibile per i laboratori accademici e può essere facilmente modificata a seconda delle attrezzature di laboratorio.
I dettagli del saggio, tra cui proteine bio-marcatori, anticorpi e due composti chimici per ogni singolo membro della famiglia PRMT sono forniti nell'articolo.
