Le but de cette procédure est de mesurer l’activité enzymatique des membres individuels de la famille de la protéine Arginine Methyltransferase dans les cellules. L’activité est mesurée en déterminant leurs niveaux de méthylation de l’arginine et les niveaux totaux de protéines bio-marqueurs à l’aide de buvards occidentaux fluorescents quantitatifs. L’avantage de la méthode décrite est la performance simple dans n’importe quel laboratoire avec des capacités de culture cellulaire et de transfert western fluorescent.
Les directives détaillées concernant les biomarqueurs, les anticorps et les inhibiteurs de deux composés sont fournies dans l’article. Et nous avons décrit ici les étapes cruciales de la procédure expérimentale. Et la procédure est affichée pour le format 24 puits.
Tout d’abord, préparez le tampon de lyse, ajoutez fraîchement le cocktail benzonase et inhibiteur de protéines avant utilisation. Retirez tous les supports des puits. Laver avec 100 microlitres PBS et ajouter 60 microlitres de tampon de lyse au puits.
Incuber pendant une minute à température ambiante, en berçant les plaques pour répartir le tampon de lyse sur les cellules. Ajoutez ensuite trois microlitres de 20% SDS pour trouver une concentration de 1% et mélangez par une légère secousse. Transférer le lysat dans des tubes Eppendorf et le garder sur la glace.
Déterminez la concentration en protéines de vos échantillons à l’aide du kit d’analyse des protéines BCA, ou utilisez toute autre méthode qui tolère 1% SDS en solution. Après avoir ajusté la concentration de protéines avec le tampon de lyse pour être égale à travers les échantillons à 20 microlitres de tampon de chargement quatre fois à 60 microlitres de lysat cellulaire, et chauffer à 95 degrés pendant cinq minutes. L’ajout de benzonase au tampon de lyse hydrolyse rapidement les acides nucléiques, ce qui réduit la viscosité du lysat cellulaire.
Les lysats avec de la benzonase ne sont pas visqueux. Les lysats sans benzonase ont un gros globule d’ADN gluant qui ne se granulera pas lorsqu’il est filé. Charge à cinq à 20 microgrammes de lysat cellulaire total pour les protéines histones, et 20 à 100 microgrammes pour d’autres protéines dans un gel de protéines gradient de quatre à 12 bis-tris.
Autour de la gelée dans des vadrouilles comme tampon environnant pendant environ deux heures à 100 volts, ou jusqu’à ce que le colorant de chargement bleu atteigne le fond du gel. Si vous effectuez un transfert humide, assemblez le sandwich de transfert dans un tampon de transfert de tris-glycine glacé. Activer la membrane PVDF en trempant dans le méthanol et équilibrer le gel dans le tampon de transfert pendant 30 secondes avant l’assemblage.
Placez le papier filtre éponge, la membrane PVDF et le gel selon les instructions du fabricant. Transférer les protéines dans le tampon de transfert de tris-glycine à 70 volts pendant une heure à une heure et demie sur la glace. Après le transfert, incuber la membrane pendant 30 minutes dans un tampon de blocage.
Rincer avec un tampon de lavage et incuber avec des anticorps primaires pendant la nuit à quatre degrés. Le lendemain, laver la membrane trois fois pendant cinq minutes avec un tampon de lavage, incuber avec des anticorps secondaires marqués par fluorescence pendant 30 minutes à température ambiante et laver trois fois pendant cinq minutes avec un tampon de lavage. Placez la membrane face vers le bas sur la plaque de verre de l’imageur western fluorescent.
Couvrir avec la feuille de caoutchouc et enlever les bulles d’air. Lisez le signal à 700 et 800 nanomètres. Une fois le balayage terminé, allez à l’image et ajustez le signal des canaux 700 et 800 pour voir clairement les bandes.
Ici, le signal de 700 canaux indiqué en rouge représente les niveaux totaux de protéines, et le signal de canal 800 affiché en vert représente les niveaux de protéines méthylées. Ensuite, accédez à l’analyse et sélectionnez la lecture médiane supérieure et inférieure. Pour mesurer l’intensité des bandes, sélectionnez l’outil Dessiner un rectangle et dessinez la forme autour des bandes que vous souhaitez quantifier.
Accédez à des formes où vous trouvez des intensités de 700 et 800 canaux. La colonne appelée signal fournit des niveaux d’intensité avec l’arrière-plan soustrait. Les résultats peuvent être copiés directement dans le fichier Excel.
Voici l’exemple montrant l’analyse de l’activité PRMT1 dans les cellules lors de l’inhibition avec l’inhibiteur de type UN de PRMT MS023. L’activité PRMT1 est mesurée en déterminant les niveaux asymétriques de diméthylation asymétrique de l’histone H4 arginine 3. Ici, les niveaux de méthylation, les bandes vertes descendent d’une manière dépendante de la dose, tandis que les niveaux totaux d’histones bandes rouges restent inchangés.
Pour déterminer le composé IC50, tracer le logarithme de la concentration d’inhibiteur contre les niveaux de diméthylation asymétrique de l’histone H4 arginine-3 normalisés aux niveaux totaux d’histone suivis d’une analyse d’ajustement non linéaire. La méthode décrite permet une double détection responsable et reproductible de l’activité de la protéine méthyltransférase dans les cellules. L’avantage de la méthode est qu’elle utilise une méthodologie western bien connue qui est accessible aux laboratoires universitaires et peut être facilement modifiée en fonction de l’équipement de laboratoire.
Les détails de l’essai, y compris les protéines biomarqueuse, les anticorps et deux composés chimiques pour chaque membre individuel de la famille PRMT, sont fournis dans l’article.
