La vitrificazione degli ovociti e le procedure di riscaldamento sono essenziali per la conservazione della fertilità. Seguire questo protocollo come dimostrato consente a un utente di massimizzare l'efficacia di queste procedure. La conservazione della fertilità per la vitrificazione degli ovociti è oggi un approccio consolidato ed eticamente accettabile.
Permette di raggiungere risultati clinici efficaci e coerenti e superare la limitazione morale e legale associata alla crioconservazione degli embrioni. Per raggiungere la competenza con il processo di vitrificazione, è importante acquisire familiarità con tutti i punti critici del protocollo, prestando particolare attenzione al tempo di esposizione dei campioni ai crioprotezionanti. Entro 38 ore dal recupero e subito dopo la denudazione, etichettare tutti i materiali di plastica con il nome, l'ID e il tipo di soluzione del paziente e chiedere a un testimone di confermare le informazioni del paziente sul dispositivo crio.
Quando tutte le forniture sono state etichettate, invertire con attenzione ogni flaconcino di ovociti più volte per mescolare e posizionare una goccia di 30 microlitteri di mezzo tampone HEPES integrata con albumina sierica umana e una goccia adiacente di soluzione di equilibrio da 30 microlitteri su una capsula di Petri. Utilizzare la pipetta stripper per posizionare gli ovociti nella prima goccia e creare un ponte di mezzo a una goccia di 30 microlitter di soluzione di equilibrio per ottenere un graduale aumento della concentrazione dei crioprotezionanti. Dopo tre minuti, aggiungere una seconda goccia di soluzione di equilibrio da 30 microlitter alla piastra e utilizzare la pipetta per creare un ponte medio tra le gocce di soluzione.
Mentre gli ovociti si equilibrano, aggiungere una goccia di 30 microlitteri di soluzione di equilibratura per ogni criodro da utilizzare sulla piastra. Dopo tre minuti, spostare gli ovociti nella soluzione di equilibrio puro per sei-nove minuti per consentire agli ovociti di tornare alle loro dimensioni iniziali. Quando gli ovociti si sono ripresi, preparare un piatto di fecondazione in vitro a pozzo centrale contenente un millilitro di soluzione di vetrificazione.
Trasferire gli ovociti nel piatto nel minor mezzo possibile e spostarli con cura per rimuovere qualsiasi soluzione di equilibrio in eccesso. Circa 10 secondi prima della fine dell'incubazione, posizionare un dispositivo criografico etichettato con le informazioni del paziente sotto il microscopio e regolare la messa a fuoco sulla punta del dispositivo crio. Posizionare gli ovociti sul criodatore accanto alla punta nella quantità minima di soluzione di vitrificazione e spostare la pipetta stripper lontano dagli ovociti per rimuovere qualsiasi soluzione di vitrificazione in eccesso, lasciando gli ovociti coperti da un sottile strato di mezzo.
Immergere rapidamente il dispositivo crio in azoto liquido e scuotere rapidamente il dispositivo per rimuovere eventuali bolle d'aria dalla sua superficie. Tenendo il cappuccio protettivo del criodo dispositivo con una pinzetta, riempire il cappuccio con azoto liquido prima di inserire il dispositivo nel cappuccio mantenendo le strisce di propilene in azoto liquido. Quindi conservare il dispositivo crio in un visotubo etichettato con le informazioni del paziente e aggiornare il foglio di laboratorio.
Per il riscaldamento degli ovociti, invertire con attenzione ogni flaconcino di soluzione di scongelamento, diluizione e lavaggio riscaldata a temperatura ambiente e aggiungere un millilitro di soluzione di scongelamento al pozzo centrale di una capsula di Petri per un'incubazione di almeno un'ora a 37 gradi Celsius. Etichettare tutti i materiali di plastica con il nome e l'ID del paziente e il tipo di soluzione e chiedere a un testimone di confermare le informazioni del paziente sul dispositivo crio. Per ogni dispositivo da riscaldare, aggiungere 200 microlitri di soluzione di diluizione al primo pozzo di una piastra a sei pozzetti e aggiungere un volume uguale di soluzione di lavaggio al secondo e al terzo pozzetti della piastra.
Aggiungere PBS all'area all'esterno dei pozzi per evitare l'evaporazione della soluzione. Posizionare il piatto di soluzione di scongelamento sotto lo stereomicroscopio e regolare la messa a fuoco al centro del piatto. Ruotare con attenzione per rimuovere il cappuccio protettivo di un dispositivo crio mantenendo le strisce di propilene in azoto liquido e trasferire il dispositivo crio dall'azoto liquido alla soluzione di scongelamento il più rapidamente possibile per evitare il rischio di devitrificazione.
Dopo un minuto, concentrati sulla punta del dispositivo crio per localizzare gli ovociti e alla fine usa una pipetta stripper per rilasciare delicatamente gli ovociti dal dispositivo. Utilizzare una pipetta stripper da 170 micron di diametro per trasferire gli ovociti e un piccolo volume di soluzione di scongelamento nella soluzione di diluizione nel primo pozzetti della piastra a sei pozzetti. Dopo tre minuti, spostare gli ovociti nel primo pozzo di soluzione di lavaggio per cinque minuti.
Alla fine dell'incubazione, trasferire gli ovociti al secondo pozzetaggio della soluzione di lavaggio e incubare a 37 gradi Celsius per un minuto prima di trasferire gli ovociti in un volume appropriato di terreno di coltura IVF pre-equilibrato per un'ora e aggiornare il foglio di laboratorio. In un periodo di 12 anni, 285 donne sono state sottoposte ad almeno un prelievo di ovociti che ha comportato la vitrificazione dell'intera coorte di uova mature raccolte. La maggior parte di queste donne ha subito un singolo recupero.
35 sono stati sottoposti a più recuperi. Le ragioni per sottoporsi al prelievo di ovociti per la vitrificazione degli ovuli erano generalmente caratterizzate come mediche diverse dal cancro, dal cancro, non mediche e altro. I pazienti con un motivo medico per la vitrificazione dell'uovo e i pazienti sottoposti a conservazione della fertilità a causa del cancro erano più giovani e mostravano un numero follicolare antrale più elevato rispetto ai pazienti con motivi non medici o di altro tipo.
Tuttavia, poiché i tassi medi di maturazione erano leggermente inferiori nei pazienti con motivi medici, il numero di ovociti vitrificati in media era simile tra i gruppi. Circa la metà dei pazienti con motivi medici diversi dal cancro e la maggior parte dei pazienti con altri motivi per la vitrificazione dell'uovo sono effettivamente tornati per il riscaldamento. Al contrario, pochissimi pazienti sottoposti a conservazione della fertilità per cancro o motivi non medici hanno usato i loro ovociti vetrificati per la fecondazione in vitro.
Nonostante le differenze nel tempo trascorso tra vitrificazione e riscaldamento, il tasso di sopravvivenza degli ovociti è stato simile tra i gruppi di pazienti, confermando l'efficacia e la sicurezza dei protocolli di vitrificazione e riscaldamento degli ovociti. Inoltre, il tasso di sopravvivenza era indipendente dall'esperienza dell'operatore di vetrificazione e riscaldamento. I passaggi più cruciali che possono influenzare la coerenza dei risultati sono quelli relativi al riscaldamento.
Pertanto, è davvero importante controllare attentamente il volume e la temperatura delle soluzioni di scongelamento. La crioconservazione del tessuto ovarico è l'unica strategia attualmente in fase di studio come opzione per le pazienti pre-puberali. Sebbene promettente, questo approccio ha importanti limitazioni che ne limitano l'applicazione.
