Name: preparation, administration, and assessment of in vivo tissue-specific cellular uptake of fluorescent dye-labeled liposomes
Uploaded: 2020-07-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
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Gli autori desiderano ringraziare Michael Solga e il resto dello staff del Flow Cytometry Core per aver fornito formazione e servizi di citometria a flusso. Gli autori desiderano anche riconoscere Shiva Sai Krishna Dasa, Dustin K. Bauknight, Melissa A. Marshall, James C. Garmey, Chantel McSkimming, Aditi Upadhye e Prasad Srikakulapu per la loro assistenza nella preparazione dei liposomi (SSKD, DKB), nella raccolta dei tessuti (MAM, JCG), nella colorazione con citometria a flusso e nell'acquisizione del campione (AU, PS, CM). Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni AstraZeneca, R01HL 136098, R01HL 141123 e R01HL 148109, AHA 16PRE30770007 e T32 HL007284.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui descriviamo un protocollo in tre parti per (i) preparare liposomi etichettati con un colorante lipidico fluorescente e caricati con un composto antidiabetico, tesaglitazar, (ii) somministrare liposomi a un topo tramite iniezione retro-orbitale e (iii) raccogliere, elaborare e colorare i tessuti per rilevare l'assorbimento dei liposomi a livello cellulare mediante citometria a flusso. Questo protocollo esamina la preparazione di circa 150 μm liposomi e la valutazione dell'assorbimento in adiposo, sangue e milza. La preparazione del liposoma è scalabile, eseguita principalmente a temperatura ambiente e utilizza l'evaporazione a fase inversa per massimizzare il carico del farmaco e la rimozione dei solventi organici. Utilizzando questo protocollo, è possibile ottenere fino a 2 mg/ml di concentrazione di tesaglitazar nel campione di liposoma purificato. I liposomi preparati possono essere conservati in tampone HEPES a 4 °C per oltre un anno. Nella nostra esperienza, hanno dimostrato una variazione minima della dimensione media delle particelle. Meno del 10% della perdita di contenuto di farmaco è stata dimostrata spettrofotometricamente, dopo la separazione per ultrafiltrazione dei liposomi dal farmaco esterno con un filtro centrifugo da 10 kDa.
Durante la preparazione dei liposomi, ci sono alcuni passaggi critici e fattori da considerare. Innanzitutto, l'ordine dei passaggi del protocollo è importante e deve essere rispettato. In secondo luogo, il pH della soluzione utilizzata durante il caricamento di tesaglitazar deve essere mantenuto a 7,4 per massimizzare la solubilità e il carico efficace. In terzo luogo, il corretto assemblaggio di apparecchiature e filtri garantisce che l'output di ogni passaggio sia delle dimensioni e della purezza adeguate. Ad esempio, se i filtri da 100 e 200 nm non sono assemblati correttamente, può verificarsi un lotto di liposomi più eterogeneo e di dimensioni improprie. In quarto luogo, è necessaria la rimozione completa di Ca-acetato prima del carico del farmaco per massimizzare il trasferimento di tesaglitazar nei liposomi. Per testare la rimozione completa del Ca-acetato, utilizzare la sedimentazione ad alta velocità per rimuovere i liposomi e quindi misurare i livelli di Ca-acetato nella soluzione non liposomiale. In quinto luogo, è importante pesare e registrare la massa di tutti i materiali aggiunti alla preparazione del liposoma in ogni fase. Ciò garantisce che possano essere calcolate le concentrazioni corrette e che vengano mantenuti i rapporti necessari dei materiali. Infine, se la tecnica non viene eseguita correttamente, potrebbe esserci un livello indesiderato di eterogeneità. È importante controllare accuratamente questo parametro utilizzando DLS e altri approcci come la microscopia elettronica. Per migliorare l'omogeneità, è consigliabile regolare la dimensione del filtro selezionato o impilare due filtri.
Inoltre, è fondamentale che i controlli e un pannello anticorpale per la citometria a flusso siano pianificati e ottimizzati prima di condurre questo protocollo in modo completo (Tabella 1, Tabella 3). Gli anticorpi devono essere testati per garantire che vengano utilizzate concentrazioni adeguate per la colorazione e che la sovrapposizione tra i fluorofori sia minima. Anche l'eccitazione e l'emissione del colorante utilizzato durante la preparazione dei liposomi devono essere prese in considerazione nella pianificazione del pannello. Nei nostri risultati, abbiamo utilizzato DiD, che ha un'eccitazione ed emissione simili ai fluorofori come l'alloficocianina (APC) e AlexaFluor 647. Pertanto, non abbiamo selezionato anticorpi coniugati a questi fluorofori nel nostro pannello di anticorpi. Inoltre, i controlli isotype non sono inclusi in questo protocollo. Questo perché gli anticorpi selezionati per questo protocollo sono anticorpi ben convalidati e disponibili in commercio. Tuttavia, se interessati a utilizzare un anticorpo che non è stato ottimizzato in precedenza, si prega di considerare di testare l'anticorpo contro un controllo isotipo sui tessuti di interesse prima di condurre l'esperimento completo.
Mentre questo protocollo dimostra come estrarre ed elaborare il sangue, la milza, il tessuto adiposo inguinale e l'epididimo dal topo dopo il trattamento, questo approccio generale può essere applicato ad altri tessuti. A seconda del tessuto di interesse, potrebbe essere necessario modificare i protocolli di elaborazione e digestione come pubblicato per i seguenti tessuti: polmone21, fegato22, cavità peritoneale 3, midollo osseo3,23, cervello24.
Un'importante limitazione di questo metodo da considerare è che l'assorbimento può essere valutato solo in un punto temporale per animale. Pertanto, può essere vantaggioso accoppiare questo protocollo con altre tecniche di imaging non invasive o pianificare di conseguenza per garantire risorse sufficienti per condurre la valutazione. I tempi di assorbimento cellulare e il turn over cellulare sono fattori importanti da considerare: i liposomi circoleranno in tutto il corpo nelle prime 24 ore e, a seconda della durata della vita delle cellule che assorbono i liposomi o di come rispondono all'assorbimento, può verificarsi la morte cellulare o un'ulteriore fagocitosi. Il nostro studio precedente ha dimostrato cambiamenti nelle caratteristiche della popolazione delle popolazioni DiD + in diversi punti temporali3. Per questo motivo, è importante valutare l'assorbimento in punti temporali precedenti o punti temporali più rilevanti per la biologia del meccanismo di interesse. Inoltre, mentre la quantificazione dell'assorbimento cellulare nell'intero tessuto può essere eseguita con questo protocollo, la citometria a flusso non può rivelare la localizzazione tissutale. L'accoppiamento di questo approccio con metodi istologici può aiutare ad affrontare questa limitazione.
In generale, questo protocollo integra la metodologia esistente come l'istologia e l'imaging a fluorescenza di tutto il corpo. Con i continui progressi negli strumenti e nei metodi di citometria a flusso, diventerà possibile lo sviluppo di pannelli più grandi per popolazioni cellulari sempre più specifiche. Suggeriamo che questo protocollo venga utilizzato in aggiunta ai metodi sopra menzionati in quanto ciò migliorerà la valutazione dell'assorbimento cellulare e fornirà anche l'opportunità di convalidare i risultati osservati dalla citometria a flusso. Ad esempio, si dovesse scoprire che la maggior parte delle particelle nel tessuto adiposo sono state assorbite dai macrofagi mediante citometria a flusso. L'immunofluorescenza di un'aliquota aggiuntiva dello stesso tessuto adiposo potrebbe essere salvata, fissata, sezionata e colorata per i marcatori macrofagici per verificare che il tipo di cellula assorba effettivamente i liposomi. Questo approccio dovrebbe aggiungere rigore ai saggi di biodistribuzione delle nanoparticelle condotti: convalidare il targeting specifico delle cellule, quantificare l'assorbimento cellulare, identificare l'assorbimento off-target e, si spera, fornire informazioni per generare ipotesi meccanicistiche per i risultati terapeutici osservati. Questo protocollo può anche essere adattato per studi futuri utilizzando diversi liposomi, studiando l'assorbimento in altri tessuti e testando nuovi composti nel contesto dell'obesità e del dismetabolismo o di qualsiasi altra malattia in cui la consegna di nanoparticelle è un'opzione terapeutica fattibile.

Con l'aumento dell'interesse per lo sviluppo di terapie che utilizzano la somministrazione di farmaci con nanoparticelle, i metodi per preparare e valutare la distribuzione e l'assorbimento delle particelle devono continuare a progredire, espandersi ed essere accessibili alla comunità di ricerca 1,2. Questo protocollo è stato sviluppato per valutare i tipi esatti di cellule che hanno assorbito liposomi in vivo a seguito di un trattamento con liposomi marcati con DiD caricati con tesaglitazar, unagonista 3,4 del recettore attivato dal proliferatore dei perossisomi (PPAR)-α/γ. In questi studi, siamo stati in grado di valutare quali tipi di cellule sono stati direttamente influenzati dal trattamento liposomiale con tesaglitazar, l'efficacia delle frazioni mirate e generare ipotesi per spiegare i risultati del trattamento che abbiamo osservato. Inoltre, le funzioni biologiche stabilite in una varietà di tipi di cellule suggeriscono che le cellule fagocitiche come i macrofagi, le cellule dendritiche e le cellule di Kupffer specifiche del fegato assorbono la maggior parte dei liposomi 5,6,7. Utilizzando questo protocollo, abbiamo dimostrato che anche i fagociti non classici potrebbero assorbire i liposomi 3,4.
Questo protocollo presenta un metodo ottimizzato per solubilizzare tesaglitazar, preparare liposomi mediante evaporazione a fase inversa e utilizzare l'acetato di calcio come attrattivo per il carico remoto del farmaco. I metodi presentati sono accessibili a molti laboratori e mancano di materiali difficili da acquisire e passaggi che richiedono alte temperature. Il protocollo produce liposomi di dimensioni ottimali per una maggiore circolazione in vivo8. Inoltre, come riassunto da Su et al., ad oggi, sono stati studiati e testati in profondità9 metodi per valutare la distribuzione dei liposomi in vivo e l'assorbimento tissutale. I metodi di tomografia ad emissione di positroni (PET), risonanza magnetica (MRI) e tomografia molecolare a fluorescenza (FMT) vengono applicati per quantificare la biodistribuzione e l'assorbimento tessuto-specifici 9,10,11. Mentre questi metodi sono stati ottimizzati per massimizzare il rilevamento in vivo, mancano ancora della capacità di quantificare l'assorbimento dei liposomi in vivo alla risoluzione cellulare. Il protocollo qui presentato mira a soddisfare questa esigenza attraverso l'uso della citometria a flusso. Infine, per questo protocollo, l'assorbimento cellulare è stato ristretto a pochi tessuti, incluso il tessuto adiposo. C'è un crescente corpo di letteratura che studia il potenziale per l'uso di nanoparticelle per fornire terapie nel contesto di obesità, dismetabolismo e infiammazione 12,13,14,15,16,17. Pertanto, abbiamo ritenuto importante condividere un protocollo con metodi efficaci per l'elaborazione e l'analisi del tessuto adiposo, uno dei tessuti che svolge un ruolo importante in queste patologie.

<table><tbody><tr><td>1-mL syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10-mL syringe</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>25-gauge needle, sterile for retro-orbital injection</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>27-gauge needle, sterile for retro-orbital injection</td><td>BD</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse B220 BV421</td><td>Biolegend</td><td>103251</td><td>Clone RA3-6B2</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD115 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-1152-82</td><td>Clone AFS98</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11b PerCP Cy5.5 antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>550993</td><td>Clone M1/70</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11c APC ef780 antibody</td><td>eBioscience</td><td>47-0114-82</td><td>Clone N418</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD19 PE CF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562291</td><td>Clone 1D3</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD3 FITC antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>553061</td><td>Clone 145-2C11</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD31 BV605</td><td>Biolegend</td><td>102427</td><td>Clone 390</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 PerCP</td><td>BD Biosciences</td><td>557235</td><td>Clone 30-F11</td></tr><tr><td>Anti-mouse F4/80 PE Cy7</td><td>Biolegend</td><td>123114</td><td>Clone BM8</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Gemini Bio-products</td><td>700-107P</td><td></td></tr><tr><td>Desalting spin-column</td><td>ThermoFisher</td><td>89889, 89890</td><td>Zeba spin column</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dynamic Light Scattering, Nicomp 370</td><td>Particle Sizing System, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIX &amp;amp; PERM Cell Permeabilization Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>GAS004</td><td></td></tr><tr><td>Gauze sponges</td><td>Dermacea</td><td>441211</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>3393-1MU</td><td></td></tr><tr><td>Liposome extruder</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z373400</td><td>LiposoFast</td></tr><tr><td>Live/Dead Aqua</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic lubricant</td><td>Optixcare</td><td></td><td>20g/70 oz Sterile</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free</td><td>Alfa Aesar</td><td>433689L</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene vial for mincing</td><td>Wheaton</td><td>986701</td><td></td></tr><tr><td>Rotary evaporator</td><td>Buchi</td><td>Re111</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Misonix</td><td>XL2020</td><td></td></tr><tr><td>T/Pump Heat therapy pump and pad</td><td>Gaymer Industries</td><td>TP-500</td><td></td></tr><tr><td>Tesaglitazar</td><td>Tocris</td><td>3965</td><td></td></tr><tr><td>Track-etched polycarbonate membranes</td><td>Thomas Scientific</td><td>1141Z**</td><td>Whatman, Nuclepore Polycarbonate hydrophilic membranes</td></tr><tr><td>ZetaSizer/DLS-ELS system</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation, administration, and assessment of in vivo tissue-specific cellular uptake of fluorescent dye-labeled liposomes

C'è un crescente interesse nell'uso dei liposomi per fornire composti in vivo, in particolare per approcci terapeutici mirati. A seconda della formulazione del liposoma, i liposomi possono essere assorbiti preferenzialmente da diversi tipi di cellule nel corpo. Ciò può influenzare l'efficacia della particella terapeutica poiché la progressione di diverse malattie è specifica del tipo di tessuto e della cellula. In questo protocollo, presentiamo un metodo per sintetizzare e marcare fluorescentmente i liposomi usando DSPC, colesterolo e DSPE PEG-2000 e il colorante lipidico DiD come etichetta fluorescente. Questo protocollo presenta anche un approccio per la somministrazione di liposomi in vivo e la valutazione dell'assorbimento cellulo-specifico dei liposomi utilizzando la citometria a flusso. Questo approccio può essere utilizzato per determinare i tipi di cellule che assorbono i liposomi e quantificare la distribuzione e la proporzione di assorbimento dei liposomi tra i tipi di cellule e i tessuti. Sebbene non menzionati in questo protocollo, ulteriori test come l'immunofluorescenza e l'imaging a fluorescenza a singola cellula su un citometro rafforzeranno qualsiasi risultato o conclusione fatta in quanto consentono la valutazione della colorazione intracellulare. I protocolli possono anche dover essere adattati a seconda del tessuto o dei tessuti di interesse.

Produzione di liposomi
I risultati pubblicati qui sono simili a quelli del nostro lavoro pubblicato in precedenza 3,4,20. Utilizzando il protocollo qui presentato, ci aspettiamo di produrre liposomi di circa 150-160 nm. DLS rivela un diametro medio del liposoma di 163,2 nm e un potenziale zeta di -19,2 mV (Figura 1A). L'imaging criogenico al microscopio elettronico (crio-EM) rivela liposomi circolari (Figura 1B) e il diagramma DLS rivela una deviazione standard relativamente piccola dal diametro medio (Figura 1C).
Il legame positivo dei liposomi richiede un controllo trattato con PBS
Studi precedenti del nostro gruppo che impiegano questo protocollo hanno studiato quali sottogruppi cellulari in SVF adiposo, milza e sangue legato ai liposomi dopo una settimana di somministrazione in vivo 3,4. Utilizzando un topo trattato con PBS, la cavità peritoneale e le cellule della milza sono state colorate con lo stesso pannello anticorpale utilizzato su campioni di topi trattati con liposomi. I tessuti sono stati raccolti dopo una settimana di trattamenti (Figura 2A). I campioni del mouse trattato con PBS sono serviti come FMO DiD con cui creare porte DiD positive (Figura 2B,C). Un gate positivo può essere creato usando il segnale DiD-positivo, ma i campioni privi di segnale DiD devono essere utilizzati anche per verificare che il gate positivo non includa campioni DiD-negativi.
Le titolazioni sono necessarie per ottimizzare i segnali di fluorescenza
Prima di eseguire un esperimento completo, devono essere ottimizzate varie condizioni, tra cui la concentrazione di anticorpi coniugati fluorescentmente utilizzati durante la colorazione cellulare e di colorante lipidico utilizzato durante la preparazione dei liposomi. I citometri a flusso hanno un limite superiore di rilevazione per l'intensità della fluorescenza, quindi troppo colorante incorporato nei liposomi porterà a livelli non quantificabili di segnale DiD nei campioni attraversati dal citometro. Inoltre, troppo DiD nei liposomi può portare ad alti livelli di trasferimento di coloranti non specifici, che potrebbero distorcere i risultati dell'assorbimento cellulare. La figura 3 riporta i risultati di un esperimento in cui le concentrazioni di colorante lipidico sono state titolate per identificare la concentrazione che produrrebbe un segnale ottimale all'interno dell'intervallo di rilevamento del citometro a flusso utilizzato. Questo è stato condotto sui tessuti di interesse per l'esperimento finale: sangue (Figura 3A), SVF adiposo inguinale (Figura 3B) e SVF adiposo epididimo (Figura 3C). Le concentrazioni selezionate per il test erano 10 mg di DiD (alto, rosso), 1 mg di DiD (medio, blu) o 0,1 mg di DiD (basso, grigio) per 1 ml di liposomi. La concentrazione più alta utilizzata nei liposomi era troppo alta e superava l'intervallo quantificabile del citometro in tutti e tre i tessuti (Figura 3A\u2012C, rosso). La concentrazione più bassa di DiD ha mostrato qualche segnale (Figura 3 A\u2012C, grigio), ma non è stata osservata una popolazione chiara oltre le cellule trattate con PBS (Figura 3A\u2012C, nero). Quando quantificata, la media aritmetica della MFI DiD per ciascun tessuto e concentrazione ha dimostrato una chiara distinzione tra i controlli PBS e la concentrazione media di DiD (Figura 3D). Pertanto, come indicato nel protocollo, abbiamo selezionato la concentrazione media (Figura 3, blu) da utilizzare nella nostra preparazione dei liposomi.
L'uso del pannello multi-anticorpo consente l'identificazione dell'assorbimento dei liposomi da parte di diversi sottogruppi cellulari
Utilizzando il pannello delineato nella Tabella 3, le cellule sono state colorate con anticorpi contro marcatori per macrofagi a, cellule B, cellule T, cellule dendritiche, monociti e cellule endoteliali (Figura 4). Sono necessarie strategie di gating leggermente diverse per ogni tipo di tessuto, ma la maggior parte degli stessi tipi di cellule può essere identificata in ciascuno. Alcune eccezioni includono le cellule endoteliali, che normalmente non si trovano nel sangue, e i monociti, che sono tipicamente a più alta frequenza nel sangue rispetto ad altri tessuti. Una volta identificate le popolazioni, è possibile quantificare la dimensione totale di ciascuna popolazione cellulare e la frequenza con cui sono DiD+. Ulteriori calcoli possono essere eseguiti per caratterizzare la popolazione DiD +: quale percentuale di cellule DiD + sono macrofagi, cellule endoteliali, ecc. Si prega di notare che queste sono strategie di gating di esempio, ma non l'unico modo per analizzare i campioni. L'analisi sarà dettata dal pannello selezionato e dal citometro a flusso disponibili.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig01.jpg"> Figura 1: Caratteristiche di esempio dei liposomi preparati. (A) Le dimensioni e il potenziale zeta sono stati misurati come descritto sopra e sono stati riportati sotto forma di tabella. Ogni parametro è presentato come media ± deviazione standard. (B) Cryo-EM è stato utilizzato per visualizzare i liposomi preparati. La barra della scala bianca è lunga 50 nm. (C) DLS è stato utilizzato per generare un istogramma del diametro dei liposomi in questa preparazione. Questa figura è adattata da Osinski et al.3. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61585/61585fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig02.jpg"> Figura 2: Colorazione rappresentativa di DiD da topi trattati con PBS o Liposomi. (A) Schema sperimentale per trattamenti PBS e liposomiali. PBS o liposomi sono stati iniettati tre volte nel corso di una settimana. I tessuti sono stati raccolti il giorno 8 del trattamento. (B, C) I grafici di flusso rappresentativi rivelano una colorazione DiD positiva nei topi trattati con liposomi (C), ma non trattati con PBS (B). FSC, dispersione in avanti. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61585/61585fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig03.jpg"> Figura 3: Titolazione del DiD nei liposomi. I liposomi sono stati preparati con tre diverse concentrazioni di DiD e iniettati nei topi. Il grigio indica la bassa concentrazione a 0,1 mg di DiD per 1 mL di liposomi, il blu indica la concentrazione media a 1 mg di liposomi DiD/mL e il rosso indica l'alta concentrazione a 10 mg di liposomi DiD/mL. Un mouse trattato con PBS è stato utilizzato come controllo negativo (nero). Il sangue (A, cerchio), l'adiposo inguinale (B, triange) e l'epididimo adiposo (C, quadrato) sono stati raccolti 24 ore dopo l'iniezione e trattati per isolare una sospensione unicellulare. Questi campioni sono stati eseguiti su un citometro a flusso al livello di DiD rilevabile. Vengono presentati istogrammi tessuto-specifici con sovrapposizioni di ciascun gruppo di trattamento per dimostrare l'intensità della fluorescenza per concentrazione (A\u2012C). La media aritmetica di DiD è stata anche quantificata per ciascun tessuto e concentrazione e tracciata (D). SSC = dispersione laterale. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61585/61585fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig04v4.jpg"> Figura 4: Analisi rappresentativa della citometria a flusso di sottogruppi cellulari in SVF adiposo, sangue e milza. (A\u2012C) Rappresentativo schematico della strategia di gating per identificare sottoinsiemi cellulari e cellule DiD+ in SVF adiposo (A), milza (B) e sangue (C). Abbreviazioni: FSC = forward scatter; LD = vivi/morti; L-DC = cellule dendritiche linfoidi; M-DC = cellule dendritiche mieloidi; SSC = dispersione laterale. Questa figura è adattata da Osinski et al.3. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61585/61585fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Controllo</td>
			<td>Scopo</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Mouse trattato con PBS o soluzione salina</td>
			<td>Utilizzare le cellule di questo mouse per i seguenti controlli di citometria a flusso:</td>
		</tr><tr><td>1. Celle non colorate</td>
		</tr><tr><td>2. Macchia singola viva / morta</td>
		</tr><tr><td>3. Cellule colorate con il pannello completo, ma prive della fluorescenza liposomica per determinare il segnale liposomico positivo durante l'analisi</td>
		</tr><tr><td>Questo / questi mouse / topi saranno utilizzati anche per determinare se i liposomi hanno effetti in vivo in quanto si avrà un controllo non liposomico nel vostro esperimento.</td>
		</tr><tr><td>Liposomi scaricati</td>
			<td>Se stai caricando un composto nei tuoi liposomi, una parte del tuo lotto di liposomi dovrebbe essere sintetizzata senza il composto. Questo spiega eventuali effetti in vivo dei soli liposomi.</td>
		</tr><tr><td>DiD da solo</td>
			<td>Poiché il DiD può anche essere assorbito dalle membrane cellulari, allocare alcuni topi per ricevere colorante libero in una quantità pari a quella trovata nei liposomi aiuterà a spiegare qualsiasi colorazione della membrana di fondo.</td>
		</tr><tr><td>Controlli a fluorescenza meno uno (FMO)</td>
			<td>Queste sono cellule colorate con tutti tranne uno degli anticorpi nel tuo pannello. Come #3 nella casella sopra, questo aiuta a determinare il vero segnale positivo per quell'anticorpo durante l'analisi</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Controlli da utilizzare in questo protocollo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Soluzione</td>
			<td>Componenti</td>
			<td>Volume approssimativo necessario per batch/mouse</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Preparazione dei liposomi</td>
		</tr><tr><td>Acetato di calcio</td>
			<td>1 M acetato di calcio in H2O</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>Tampone HEPES</td>
			<td>10 mM HEPES in H2O, pH 7,4</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>Tesaglitazar in HEPES</td>
			<td>in 10 mM HEPES</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Raccolta, lavorazione e colorazione dei tessuti</td>
		</tr><tr><td>Soluzione tamponata fosfato (PBS)</td>
			<td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO4 in H 2O distillato</td>
			<td>2 ml</td>
		</tr><tr><td>PBS-Eparina</td>
			<td>0,1 mM di eparina in PBS</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr><tr><td>Tampone HEPES</td>
			<td>20 mM HEPES in PBS</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>Tampone di digestione</td>
			<td>2 mg/mL di collagenasi di tipo I nel tampone HEPES</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>Tampone di lisi AKC</td>
			<td>0,158 m NH 3 cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na 2 EDTA in ddH 2 O, pH7,2</td>
			<td>15 ml</td>
		</tr><tr><td>Buffer FACS</td>
			<td>1% BSA, 0,05% NaN3 in PBS</td>
			<td>15 ml</td>
		</tr><tr><td>Blocco Fc (diluito)</td>
			<td>Blocco Fc 1:50 nel buffer FACS</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr><tr><td>Buffer di fissazione</td>
			<td>2% paraformaldeide in PBS</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2: Soluzioni da preparare.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Un</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
			<td>D</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Colorazione extracellulare (2x mix di anticorpi)</td>
		</tr><tr><td>Antigene</td>
			<td>Fluoroforo</td>
			<td>Volume Ab per 100 μL di prova</td>
			<td>Volume totale necessario:</td>
		</tr><tr><td>CD45</td>
			<td>PerCP</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>Colonna C x 1,2 x Totale # esempi</td>
		</tr><tr><td>CD11b</td>
			<td>PerCP Cy5.5</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>(0,5 μL/test) x (1,2) x (# campioni)</td>
		</tr><tr><td>F4/80</td>
			<td>PE Cy7</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>(0,25 μL/test) x (1,2) x (# campioni)</td>
		</tr><tr><td>CD19</td>
			<td>PE-CF594</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(0,25 μL/test) x (1,2) x (# campioni)</td>
		</tr><tr><td>CD3</td>
			<td>FITC</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(1,0 μL/test) x (1,2) x (# campioni)</td>
		</tr><tr><td>CD31</td>
			<td>BV605</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>and so on...</td>
		</tr><tr><td>CD11c</td>
			<td>APC ef780</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CD115</td>
			<td>PE</td>
			<td>1,5 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Per creare la tua miscela di anticorpi, combina gli anticorpi calcolati nella colonna D con tampone FACS o tampone colorante viola brillante* per un volume finale di (50 μL x 1,2 x campioni # totali)</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Colorazione viva/morta (1x)</td>
		</tr><tr><td>Vivi/Morti</td>
			<td>Fluoroforo</td>
			<td>Volume L/D per 200 uL test</td>
			<td>Volume totale necessario:</td>
		</tr><tr><td>Vivi/Morti</td>
			<td>Acqua</td>
			<td>0,67 μL</td>
			<td>Colonna C x 1,2 x Totale # esempi</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Colorazione intracellulare (1x)</td>
		</tr><tr><td>Antigene</td>
			<td>Fluoroforo</td>
			<td>Volume Ab per prova da 50 μL</td>
			<td>Volume totale necessario:</td>
		</tr><tr><td>αSMA</td>
			<td>FITC</td>
			<td>0.125</td>
			<td>Colonna C x 1,2 x Totale # esempi</td>
		</tr><tr><td colspan="4">*Il tampone per colorazione viola brillante deve essere utilizzato se nel pannello viene utilizzato più di un anticorpo coniugato a un fluoroforo viola brillante.</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 3: Esempio di pannello anticorpale e calcoli delle miscele di colorazione da utilizzare per la colorazione del flusso.

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Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

L'obiettivo di questo protocollo è sintetizzare liposomi marcati con fluorescenza e utilizzare la citometria a flusso per identificare la localizzazione in vivo dei liposomi a livello cellulare.

Preparazione, somministrazione e valutazione dell'assorbimento cellulare tessuto-specifico in vivo di liposomi marcati con coloranti fluorescenti

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...

preparation-administration-assessment-vivo-tissue-specific-cellular

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.2K Views.  University of Virginia. L'obiettivo di questo protocollo è sintetizzare liposomi marcati con fluorescenza e utilizzare la citometria a flusso per identificare la localizzazione in vivo dei liposomi a livello cellulare.

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A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past decade. However, only a small number of nanomedicines have been approved for clinical use, whereas the majority of nanomedicines under clinical development have produced disappointing results. One major obstacle to the successful clinical translation of new cancer nanomedicines is the lack of an accurate understanding of their in vivo performance. This article features a rigorous procedure to characterize the in vivo behavior of nanomedicines in tumor-bearing mice at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels via the integration of positron emission tomography-computed tomography (PET-CT), radioactivity quantification methods, flow cytometry, and fluorescence microscopy. Using this approach, researchers can accurately evaluate novel nanoscale formulations in relevant mouse models of cancer. These protocols may have the ability to identify the most promising cancer nanomedicines with high translational potential or to aid in the optimization of cancer nanomedicines for future translation.

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

The poor understanding of the in vivo performance of nanomedicines stymies their clinical translation. Procedures to evaluate the in vivo behavior of cancer nanomedicines at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels in tumor-bearing immunocompetent mice are described here. This approach may help researchers to identify promising cancer nanomedicines for clinical translation.

Una procedura completa per valutare il<em&gt; In Vivo</em&gt; Prestazioni del Cancro nanomedicina

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the efficacy of cell persistence and biodistribution of haMSCs in animal models. We demonstrated a method to label the cell membrane of haMSCs with lipophilic fluorescent dye. Subsequently, intra-articular injection of the labeled cells in rats with surgically induced KOA was monitored dynamically by an in vivo imaging system. We employed the lipophilic carbocyanines DiD (DilC18 (5)), a far-red fluorescent Dil (dialkylcarbocyanines) analog, which utilized a red laser to avoid excitation of the natural green autofluorescence from surrounding tissues. Furthermore, the red-shifted emission spectra of DiD allowed deep-tissue imaging in live animals and the labeling procedure caused no cytotoxic effects or functional damage to haMSCs. This approach has been shown to be an efficient tracking method for haMSCs in a rat KOA model. The application of this method could also be used to determine the optimal administration route and dosage of MSCs from other sources in pre-clinical studies.

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

This protocol describes an efficient way to monitor the cell persistence and biodistribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells (haMSCs) by far-red fluorescence labeling in a rat knee osteoarthritis (KOA) model via intra-articular (IA) injection.

In Vivo Rilevamento di umani cellule staminali mesenchimali adiposo-derivate in un modello di osteoartrite del ginocchio di ratto con colorante fluorescente lipofilico membrana

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Biologia dello sviluppo

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluorescenza tempra di un vicino infrarosso Fluoroforo incapsulata all&#39;interno di liposomi come strumento per<em&gt; In Vivo</em&gt; Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Bioingegneria

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located in. Although traditional imaging techniques are useful in identifying protein interactions and morphology in fixed tissue, they are not able to give insight as to how quickly cells are able to bind and uptake proteins, and once activated how their morphology changes in vivo. In the present study, we ask 2 major questions: 1) what is the time-course of fibroblast activation via toll-like receptor-4 (TLR4) and lipopolysaccharide (LPS) interaction and 2) how do these cells behave once activated? Using 2-photon imaging, we have developed a novel technique to assess the ability of LPS-FITC to bind to its cognate receptor, TLR4, expressed on peripheral fibroblasts in the genetic reporter mouse line; FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox&#160;in vivo. This unique approach allows researchers to create in-depth, time-lapse videos and/or pictures of proteins interacting with live cells that allows one to have an increased level of granularity in understanding how proteins can alter cellular behavior.

Morphological changes occur in immune responsive fibroblast cells following activation and promote alterations in cellular recruitment. Utilizing 2-photon imaging in conjunction with a genetically engineered Fibroblast-specific protein 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) mouse line and green fluorescently tagged lipopolysaccharide-FITC, we can illustrate highly specific uptake of lipopolysaccharide in dermal fibroblasts and morphological changes in vivo.

In Vivo a due colori immagini fotone di cellule reporter geneticamente taggate nella pelle

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

Spatial Measurements of Perfusion, Interstitial Fluid Pressure and Liposomes Accumulation in Solid Tumors

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes is a critical determinant of their efficacy. Both the chaotic tumor microcirculation and elevated IFP are linked to the heterogeneous intra-tumoral distribution of nanotechnology-based drug delivery systems such as liposomes. In the present study, the relationship between tumor microcirculation, elevated IFP, and accumulation of nanoparticles was investigated through in vivo experimentation. This was accomplished by evaluation of the tumor microcirculation using dynamic contrast enhanced computed tomography (DCE-CT) and measurement of tumor IFP using a novel image-guided robotic needle placement system connected to the micro-CT scanner. The intra-tumoral accumulation of liposomes was determined by CT image-based assessment of a nanoparticle liposomal formulation that stably encapsulate the contrast agent iohexol (CT-liposomes). CT imaging allowed for co-localization of the spatial distribution of tumor hemodynamics, IFP and CT-liposome accumulation in an individual subcutaneous xenograft mouse model of breast cancer. Measurements led to the discovery that perfusion and plasma volume fraction are strong mediators of the intra-tumoral distribution of liposomes. Furthermore, the results suggest that IFP plays an indirect role in mediating liposome distribution through modulating blood flow.

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes has been linked to an abnormal tumor microenvironment. Herein methods are presented to measure tumor microcirculation by perfusion imaging and elevated interstitial fluid pressure (IFP) using an image-guided robotic system. Measurements are compared to the intra-tumoral accumulation of liposomes, determined using volumetric micro-CT imaging.

Le misurazioni spaziali di perfusione, interstiziale pressione del fluido e liposomi accumulo nei tumori solidi

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes is a critical determinant of their efficacy. Both the chaotic tumor microcirculation and ...

Medicina

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes all liposomes of the ensemble to be identical. However, new experimental platforms able to observe liposomes at the single-particle level have made it possible to perform highly sophisticated and quantitative studies on protein-membrane interactions or drug carrier properties on individual liposomes, thus avoiding errors from ensemble averaging. Here we present a protocol for preparing, detecting, and analyzing single liposomes using a fluorescence-based microscopy assay, facilitating such single-particle measurements. The setup allows for imaging individual liposomes in a massive parallel manner and is employed to reveal intra-sample size and compositional inhomogeneities. Additionally, the protocol describes the advantages of studying liposomes at the single liposome level, the limitations of the assay, and the important features to be considered when modifying it to study other research questions.

This protocol describes the fabrication of liposomes and how these can be immobilized on a surface and imaged individually in a massive parallel manner using fluorescence microscopy. This allows for the quantification of the size and compositional inhomogeneity between single liposomes of the population.

Un saggio di liposoma singolo basato sulla microscopia quantitativa per rilevare l'inomogeneità compositiva tra i singoli liposomi

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an otherwise dynamic system, and successive phases are easily overlooked or misinterpreted. Live-cell imaging and time-lapse microscopy, in which living cells can be followed for hours or even days in a more or less continuous fashion, are therefore very informative. The protocol described here allows for the investigation of the fate of chemotherapeutic nanoparticles after the delivery of doxorubicin (dox) in living cells. Dox is an intercalating agent that must be released from its nanocarrier to become biologically active. In spite of its clinical registration for more than two decades, its uptake, breakdown, and drug release are still not fully understood. This article explores the hypothesis that lipid-based nanoparticles are taken up by the tumor cells and are slowly degraded. Released dox is then translocated to the nucleus. To prevent fixation artifacts, live-cell imaging and time-lapse microscopy, described in this experimental procedure, can be applied.

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Live-cell imaging is a powerful tool to visualize dynamic processes. The examination of fixed cells provides only static pictures, which can lead to misinterpretation and confusion about the process. This work presents a method to study uptake, drug release, and intracellular localization of liposomal nanoparticles in living cells.

Utilizzo In Vitro cellule vive di Imaging per esplorare chemioterapici consegnato da nanoparticelle di basata sui lipidi

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such as the cornea and conjunctiva. While therapeutic effects and pharmacokinetics of the drugs upon subconjunctival injection have been described in some studies, very few assess the ocular distribution of drugs or drug delivery systems (DDS). The latter is critical for the optimization of intraocular DDS design and drug bioavailability to achieve the desired ocular localization and duration of action (e.g., acute versus. prolonged). This study establishes the use of fiberoptic confocal laser microendoscopy (CLM) to qualitatively study the ocular distribution of fluorescent liposomes in real-time in live mice after sub-conjunctival injection. Being designed for in vivo visual inspection of tissues at the microscopic level, this is also the first full description of the CLM imaging method to study spatio-temporal distribution of injectables in the eye after subconjunctival injection.

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

We present a protocol for the use of fiberoptic confocal laser microendoscopy (CLM) to non-invasively study the spatio-temporal distribution of liposomes in the eye after subconjunctival injection.

Imaging in vivo spazio-temporale di sistemi di somministrazione di farmaci oculari mediante microscopia laser confocale a fibre ottiche

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro and in vivo. Fluorescent probes are particularly useful in determining the bio-distribution of administered large molecules, where the addition of a small-molecule fluorescent label is unlikely to affect the kinetics or bio-distribution of the compound. A variety of methods exist to examine bio-distribution that vary significantly in the amount of effort required and whether the resulting measurements are fully quantitative, but using multiple methods in conjunction can provide a rapid and effective system for analyzing bio-distributions.
Ex vivo whole-organ imaging is a method that can be used to quickly compare the relative concentrations of fluorescent molecules within tissues and between multiple types of tissues or treatment groups. Using an imaging platform designed for live-animal or whole-organ imaging, fluorescence within intact tissues can be determined without further processing, saving time and labor while providing an accurate picture of the overall bio-distribution. This process is ideal in experiments attempting to determine the tissue specificity of a compound or for the comparison of multiple different compounds. Quantitative tissue histology on the other hand requires extensive further processing of tissues in order to create a quantitative measure of the labeled compounds. To accurately assess bio-distribution, all tissues of interest must be sliced, scanned, and analyzed relative to standard curves in order to make comparisons between tissues or groups. Quantitative tissue histology is the gold standard for determining absolute compound concentrations within tissues.
Here, we describe how both methods can be used together effectively to assess the ability of different administration methods and compound modifications to target and deliver fluorescently labeled molecules to the central nervous system1.

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo whole-organ imaging is a rapid method for determining the relative concentrations of fluorescently labeled compounds within and between tissues or treatment groups. Conversely, quantitative fluorescence histology, while more labor intensive, allows for the quantification of the absolute tissue levels of labeled molecules.

L&#39;impiego di<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Imaging Whole-organo e quantitativa Istologia del tessuto per determinare la Bio-distribuzione delle molecole fluorescente

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Biologia

In Vivo Imaging of Transduction Efficiencies of Cardiac Targeting Peptide

Since the initial description of protein transduction domains, also known as cell penetrating peptides, over 25 years ago, there has been intense interest in developing these peptides, especially cell-specific ones, as novel vectors for delivering diagnostic and therapeutic materials. Our past work involving phage display identified a novel, nonnaturally occurring, 12 amino acid-long peptide that we named cardiac targeting peptide (CTP) due to its ability to transduce normal heart tissue in vivo with peak uptake seen in as little as 15 min after an intravenous injection. We have undertaken detailed biodistribution studies by injecting CTP labeled with fluorophore cyanine5.5, allowing it to circulate for various periods of time, and euthanizing, fixing, and sectioning multiple organs followed by fluorescent microscopy imaging. In this publication, we describe these processes as well as ex vivo imaging of harvested organs using an in vivo imaging system in detail. We provide detailed methodologies and practices for undertaking transduction as well as biodistribution studies using CTP as an example.

We describe protocols for assessing the degree of transduction by cell-penetrating peptides utilizing ex vivo imaging systems followed by paraffin embedding, sectioning, and confocal fluorescent microscopy using cardiac targeting peptide as an example. In our protocol, a single animal can be used to acquire both types of imaging assessment of the same organs, thereby cutting the number of animals needed for studies by half.

In vivo Imaging di Efficienza trasduzione di Peptide Targeting Cardiac

Since the initial description of protein transduction domains, also known as cell penetrating peptides, over 25 years ago, there has been intense interest ...

Preparazione, somministrazione e valutazione dell'assorbimento cellulare tessuto-specifico in vivo di liposomi marcati con coloranti fluorescenti

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